高速逆流色譜分離制備青桑葚中原花青素及其抗氧化活性研究

汪玉玲，蔡為榮，卓允允，王晴晴

安徽工程大學生物與食品工程學院，蕪湖 241000

桑葚(mulberry)，作為?？浦参锷涞墓麑峓1]，營養(yǎng)成分豐富，具有抗癌、抗氧化、鎮(zhèn)痛消炎、烏發(fā)美容等多種功效[2]。青桑葚，又被稱為黃桑葚，是指未成熟的桑葚，作為一種中藥材，相對于成熟桑葚青桑葚更易于采摘、運輸和貯存，且其成分中原花青素、兒茶素、表兒茶素類物質(zhì)含量遠高于成熟桑葚[3]。國內(nèi)外已有從葡萄籽、玫瑰花、玉米須、蔓越莓、可可豆等各種植物中提取分離原花青素的研究[4-8]，Liu等[9]使用LSA-10樹脂對山楂中的原花青素進行富集純化；Chen等[10]采用膜分離過濾法從葡萄籽中分離低聚原花青素，使低聚原花青素含量達65%，但未得到單體分離組分；Glavnik等[11]使用高效薄層色譜法分析了日本虎杖中的原花青素，從其粗提取物中鑒定出了原花青素的單體到十聚體以及B型原花青素，但該方法很難用于制備；Sun等[12]采用半制備高效液相色譜法從葡萄籽中分離原花青素，但預處理復雜，且分離量低；本文選擇高速逆流色譜法(high-speed countercurrent chromatography，HSCCC)，其分離量大，可進行批量制備分離，操作簡便，分離效率高。

原花青素(procyanidins，PC)，作為一種多酚類化合物廣泛存在于植物體中，它主要由兒茶素、表兒茶素(epicatechin，EC)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)以及表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)等聚合而成，有較強的抗氧化活性[13,14]。本工作擬利用高速逆流色譜法從青桑葚中分離純化原花青素類物質(zhì)，應用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)鑒定各組分化學成分和分析其純度；通過考察各組分的DPPH自由基、ABTS+自由基以及羥自由基的清除能力，反映其抗氧化能力強弱。這一工作拓展了桑葚深加工利用的范圍，為青桑葚原花青素工業(yè)化生產(chǎn)提供方向，對桑葚作為藥用資源的開發(fā)利用具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

青桑葚購自陜西天璽尚品商貿(mào)有限公司，40 ℃烘干1 h，至青桑葚含水量低于10%后粉碎，粉碎后過60目篩，低溫避光儲存?zhèn)溆谩?/p>

ABTS(批號：20200629，國藥集團化學試劑有限公司)；DPPH(批號：RY393024，安徽博美生物科技有限公司)；表沒食子兒茶素(批號：EGC060919，安徽博美生物科技有限公司)；表兒茶素(批號：EC060919，安徽博美生物科技有限公司)；表兒茶素沒食子酸酯(批號：EB20191225，安徽博美生物科技有限公司)；兒茶素(批號：21042621，上海同田生物技術(shù)有限公司)；原花青素A1(批號：21052539，上海同田生物技術(shù)有限公司)；原花青素B2(批號：21062924，上海同田生物技術(shù)有限公司)；色譜純乙腈、甲醇(國藥集團化學試劑有限公司)；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇大地自動化儀器廠)；真空冷凍干燥機(松源華興科技發(fā)展有限公司)；Multiskan FC型酶標儀(賽默飛世爾儀器有限公司)；TBE-300B高速逆流色譜(上海同田生物技術(shù)有限公司)；Waters 2998液相色譜儀(美國Waters公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 青桑原花青素粗提物制備

稱取一定量青桑葚樣品粉末置于燒杯中，使用60%乙醇作為提取液，料液比1∶20，在40 ℃水浴條件提取90 min，重復提取三次，抽濾得浸提液，再在45 ℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至浸膏狀態(tài)。浸膏用水復溶后依次用石油醚、氯仿萃取，去除其脂類、生物堿等雜質(zhì)。再用乙酸乙酯萃取，萃取過后將所得乙酸乙酯級分在45 ℃條件下旋蒸除去乙酸乙酯[15]，得到浸膏用水復溶，真空冷凍干燥備用。

1.3.2 高速逆流色譜(HSCCC)溶劑系統(tǒng)篩選

適宜溶劑體系的篩選是HSCCC分離中最為復雜和關(guān)鍵工作，依據(jù)Ito歸納認為[16]，在不知目標組分極性的情況下，根據(jù)本文分離物質(zhì)為乙酸乙酯萃取物，溶劑體系的篩選可以從正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體系開始，調(diào)整各組成溶劑的體積比。結(jié)合溶劑體系的極性和參考相關(guān)文獻[17-21]選取了表(1)中各溶劑體系進行HSCCC分離體系篩選。同時利用高效液相法測定各個體系對目標組分的分配系數(shù)K，方法如下：根據(jù)溶劑體系比例配制溶液，劇烈震蕩后靜置分層，分別取上下相各2 mL，準確稱取5 mg青桑葚粗提物，溶于上下相，搖勻，待兩相分配達到平衡后，將兩相進行分離，然后過0.45 μm濾膜，用HPLC檢測分析，按式(1)和(2)計算目標組分的分配系數(shù)K和分離因子(α)，通常在HSCCC溶劑系統(tǒng)中，K值范圍在0.5～2之間最合適。

(1)

(2)

式中：S上表示目標組分在上相中測得的峰面積；S下表示目標組分在下相中測得的峰面積；Ki和Kj(Ki≥Kj)分別代表不同組分在溶劑體系中的分配系數(shù)。

1.3.3 HSCCC分離制備

按照“1.3.2”節(jié)篩選的最佳溶劑比例組合作為HSCCC溶劑體系。將配好的溶劑體系靜置后分層，上相作為固定性、下相作為流動相，超聲脫氣30 min。進樣前，低溫恒溫槽設定溫度30 °C，先泵入固定相，流速為30 mL/min，待固定相充滿管道后，轉(zhuǎn)速為正轉(zhuǎn)850 r/min，當轉(zhuǎn)速恒定后，以2 mL/min流速泵入流動相，待檢測器出口端流出一定體積流動相且紫外信號穩(wěn)定，即體系系統(tǒng)達到平衡，開始進樣。準確稱取青桑原花青素粗提物200 mg，用15 mL流動相充分溶解，過0.45 μm有機濾膜，進樣后打開色譜工作站，檢測波長為280 nm，根據(jù)高速逆流實驗時，設備得到的色譜流出圖對出峰組分分步收集，粗提物經(jīng)高速逆流色譜在500 min內(nèi)分離得到F1、F2、F3、F4，最后用氣泵吹出固定相命名為F5，對收集所得各個組分進行真空冷凍干燥，避光冷藏貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 HPLC分析檢測

分別準確稱取一定量經(jīng)“1.3.3”節(jié)HSCCC分離所得組分，用甲醇(色譜純)配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的樣品溶液，并配置一定濃度的標準品溶液，過0.45 μm有機濾膜，用于HPLC法對樣品定性分析與純度分析。采用標準品對照法和內(nèi)標法對樣品進行成分鑒定；依據(jù)峰面積歸一法計算所得組分的純度，按式(3)計算樣品純度[22]。

(3)

上式中：Wi為待測組分i的峰面積比例/%；fi為校正因子；Ai為待測組分i的峰面積。

色譜條件：Sun Fire?C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A：0.1%甲酸-乙腈，流動相B：0.1%甲酸-水；梯度洗脫：0～6 min，15%A；6～10 min，15%→35%A；10～15 min，35%→45%A；15～20 min，15%A；流速1 mL/min；檢測波長280 nm，柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

1.3.5 抗氧化能力測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力測定

參考Li[23]的方法并略作修改。分別準確稱取1.0 mg樣品(青桑葚高速逆流組分F1、F2、F3、F4、F5)用甲醇將其配制成不同質(zhì)量濃度(0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00 mg/mL)的樣品溶液，在96孔酶標板中每孔中先后加入各組分不同濃度樣品溶液100 μL和0.5 mg/mL DPPH甲醇溶液100 μL，室溫下，暗處反應30 min，517 nm處測定紫外吸光度，記作實驗組Ai；加入樣品溶液和甲醇溶液各100 μL，記作對照組Aj；加入甲醇100 μL和DPPH甲醇溶液100 μL，記作空白組Ao，每組樣品設3組平行組；以同濃度抗壞血酸(Vc)作對比實驗。按式(4)算出DPPH自由基的清除率。

(4)

1.3.5.2 ABTS+自由基清除能力測定

參考Li[24]的方法并略做改動。配置7 mmol/L的ABTS溶液及2.45 mmol/L的過硫化鉀溶液，按1∶1的體積比搖勻混合后常溫避光放置16～24 h，得到ABTS自由基陽離子儲備液。然后，用甲醇稀釋約6倍。取ABTS稀釋液200 μL與100 μL的不同濃度的樣品液混合，室溫、避光條件下反應6 min，立即測定其在734 nm處的吸光度，記作實驗組Ai；加入樣品100 μL和超純水200 μL，記作對照組Aj；加入超純水100 μL和ABTS工作液200 μL，記作空白組Ao，每組樣品設3組平行組；以同濃度抗壞血酸(Vc)作對比實驗；按照公式(5)計算ABTS自由基的清除率。

(5)

1.3.5.3 羥基自由基清除能力測定

采用Fonton反應-水楊酸法測定羥基自由基清除能力。在96孔酶標板中每孔中先后加入試樣和9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、9 mmol/L硫酸亞鐵溶液及9.79 mmol/L過氧化氫溶液各50 μL[25]。37°C恒溫條件下反應30 min，510 nm處測定吸光度值記為實驗組Ai。加入樣品50 μL和超純水150 μL，記作對照組Aj；加入超純水50 μL和上述三種溶劑各50 μL，記作空白組Ao；以同濃度抗壞血酸(Vc)作對比實驗；每組樣品設3組平行組；按照公式(6)計算羥基自由基的清除率。

(6)

2 結(jié)果與分析

2.1 HSCCC溶劑系統(tǒng)的確定

根據(jù)青桑葚粗提物的HPLC色譜圖(如圖2)，結(jié)合標準品出峰時間(如圖1)并選取粗提物中占比較大物質(zhì)組分作為目標組分，則選擇了圖2中峰1、2、3和4四個目標化合物色譜峰。

圖1 標準品HPLC圖

圖2 青桑葚粗提物HPLC色譜圖

按照“1.3.2”方法測定不同溶劑體系中目標組分1、2、3、4的分配系數(shù)K并計算組分1與組分2和組分3與組分4相對的分離因子α，如表1所示。根據(jù)所得目標組分在不同溶劑中的分配系數(shù)和分離因子α，并比較具體分離效果，可知當溶劑體系對不同組分的分配系數(shù)K接近于1，分離因子α接近1.5時，即選取正己烷-乙酸乙酯-水(1∶20∶20，V/V/V)作為分離青桑葚中原花青素的HSCCC溶劑體系有較優(yōu)分離效果。

表1 不同溶劑體系中四個目標組分的分配系數(shù)和分離因子

2.2 HSCCC分離制備結(jié)果

經(jīng)“2.1”溶劑體系篩選優(yōu)化，優(yōu)化前后青桑原花青素粗提物HSCCC分離效果如圖3，優(yōu)化前溶劑體系為正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(0.17∶12.5∶1∶12.5，V/V/V/V)，固定相保留率為64.28%，100 min左右開始出峰，色譜分離出2個峰，分離效果較差；而經(jīng)溶劑體系篩選后以正己烷-乙酸乙酯-水(1∶20∶20，V/V/V)作為分離青桑葚原花青素粗提物的HSCCC溶劑體系，體系固定相保留率為64.21%，與優(yōu)化前相差不大，出峰時間提前約20 min，分離出4個峰，如圖3中優(yōu)化后譜圖所示。

如圖3中青桑中青桑葚粗提物HSCCC分離效果圖所示，根據(jù)分離效果計算出從200 mg青桑原花青素粗提物經(jīng)HSCCC分離所得各組分的質(zhì)量和得率分別為F1(28.5 mg，14.25%)、F2(10.43 mg，5.22%)、F3(6.85 mg，3.43%)、F4(10.65 mg，5.33%)、F5(13.65 mg，6.83%)。

圖3 HSCCC分離青桑中原花青素粗提物溶劑優(yōu)化前后色譜圖

2.3 HPLC檢測分析結(jié)果

采用HPLC對青桑葚粗提物經(jīng)HSCCC分離所得的五個組分(F1、F2、F3、F4、F5)進行液相色譜檢測分析，其結(jié)果如圖4分別為HSCCC分離組分F1～F5的液相色譜圖。

圖4 青桑葚粗提物各組分的HPLC色譜圖

由圖可知，HSCCC分離對青桑原花青素粗提物中相近組分有較好分離效果，如圖2中的組分1與組分2，其中組分1在F4中被富集，而組分2主要位于F2。對照表兒茶素、兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、原花青素A1、原花青素B2等標品的HPLC圖(見圖1)，根據(jù)保留時間對照標品初步推測定性，采用內(nèi)標法將標品與樣品混合，根據(jù)出峰時間和出峰情況推測判斷樣品中未知峰物質(zhì)是否為推測的標品物質(zhì)，再按式(3)計算樣品的純度。

得出F1中峰a、b和c分別為兒茶素(38.54%)、原花青素B2(12.96%)和原花青素A1(9.58%)；F2中峰d為ECG(18.54%)；F3中峰e為原花青素B2(51.10%)；F4中峰f為EGC，純度達到95.05%；F5中峰g為EC，純度達到73.75%。相似結(jié)構(gòu)與性質(zhì)物質(zhì)的分離是天然產(chǎn)物分離制備的重難點，通過此高速逆流色譜分離，可將原花青素粗提物液相譜圖中相近出峰物質(zhì)分離在不同組分中，為后期的單體分離奠定了基礎(chǔ)。

2.4 抗氧化結(jié)果分析

2.4.1 DPPH自由基清除能力分析

DPPH是一種較為穩(wěn)定的含氮自由基，分子結(jié)構(gòu)簡單，廣泛用于各類天然產(chǎn)物的體外抗氧化活性研究。文中測定的青桑葚粗提物經(jīng)HSCCC所得五個組分不同質(zhì)量濃度(0.1～1 mg/mL)對DPPH自由基的清除活性如圖5所示，隨著不同組分樣品濃度的增加，其DPPH自由基的清除能力也逐漸增強，DPPH自由基清除能力各個組分比較：F5>F4>F2>F3>F1>青桑葚粗提物，但差于同濃度Vc，其中F4與F5的DPPH自由基清除率明顯優(yōu)于其他三個組分，且當兩者濃度大于0.3 mg/mL時，其DPPH自由基清除率大于80%，可能是由于F4、F5純度較高的原因。另外F2較F1好，這與Liu等[26]文中兒茶素類物質(zhì)清除DPPH自由基的能力：ECG>EC>兒茶素相符。

圖5 不同濃度樣品對DPPH自由基的清除率

2.4.2 ABTS+自由基清除能力分析

ABTS+自由基溶液表現(xiàn)為深藍色，在734 nm處有最大紫外吸收峰。隨著被測物質(zhì)加入ABTS+自由基溶液后，被測物質(zhì)中的部分抗氧化成分能與ABTS+自由基發(fā)生反應而使藍色褪去，可根據(jù)其在734 nm處吸光度變化測定其清除效果。由圖6可以看出經(jīng)青桑葚粗提物以及經(jīng)HSCCC分離出的5個組分在0.1～1 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，ABTS+自由基清除能力排序為：Vc>F5>F4>F2>F3>F1>青桑粗提物。其中F5和F4對ABTS+自由基的清除率比其他組分要好，在0.3 mg/mL時清除率已大于90%，但是各組分的清除效果都較同濃度Vc差。

圖6 不同濃度樣品對ABTS+自由基的清除率

2.4.3 羥基自由基清除能力分析

由圖7知羥基自由基清除能力排序大致為：F1>F5>Vc>F4>F2>青桑粗提物>F3，F(xiàn)1、F5和Vc在0.1～1 mg/mL不同濃度范圍內(nèi)，隨著濃度增大，羥自由基清除率增大，且清除能力F1>F5>Vc>F4；其中F1組分羥自由基清除率遠大于Vc，可能是F1組分體系共同作用的結(jié)果；F2、F3和青桑葚粗提物在較高濃度時，其清除率呈現(xiàn)負值情況，代表不但不能有效清除羥基自由基，反而能促進它的生成，這可能是由于被測物質(zhì)混合物體系中含有某種物質(zhì)可以產(chǎn)生羥基自由基，但其具體機理與原因需要進一步研究。

圖7 不同濃度樣品對羥基自由基的清除率

3 結(jié)論

以青桑葚為原材料，經(jīng)本實驗條件下提取、脫脂除雜、萃取富集獲得粗提物，HSCCC分離純化最佳溶劑體系為正己烷-乙酸乙酯-水(1∶20∶20，V/V/V)，200 mg青桑原花青素粗提物經(jīng)HSCCC分離5個組分得率分別F1(28.5 mg)、F2(10.43 mg)、F3(6.85 mg)、F4(10.65 mg)、F5(13.65 mg)，各組分中含有兒茶素、原花青素B2、原花青素A1等物質(zhì)，其中F4中含表沒食子兒茶素，純度達到95.05%；F5中表兒茶素，純度達到73.75%。分離所得各個組分都具有一定的抗氧化活性，以Vc作為對照，DPPH自由基清除能力：Vc>F5>F4>F2>F3>F1>青桑葚粗提物；ABTS+自由基清除能力：Vc>F5>F4>F2>F3>F1>青桑葚粗提物；羥基自由基清除能力：F1>F5>Vc>F4>F2>青桑葚粗提物>F3。HSCCC制備量大、色譜柱無填料，本實驗中粗提物經(jīng)1次分離可獲得5個組分，且部分組分具有較高純度的單體物質(zhì)和較強的抗氧化活性。文章研究內(nèi)容為原花青素的生產(chǎn)開辟了新思路，也為青桑葚中原花青素類物質(zhì)的藥用功效研究提供一定的理論支持。