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    甲魚蛋α-葡萄糖苷酶抑制肽及其納米運(yùn)載體的體外胃腸消化特性

    2022-07-07 03:04:52裘樂(lè)蕓王瑞艷鄧澤元鄭溜豐
    食品科學(xué) 2022年12期
    關(guān)鍵詞:寡肽糖苷酶外泌體

    肖 婷,裘樂(lè)蕓,王瑞艷,李 男,鄧澤元,鄭溜豐

    (南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330047)

    隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們膳食結(jié)構(gòu)的改變,糖尿病發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐年遞增。據(jù)估計(jì),2045年全球患病人數(shù)將超過(guò)7億。餐后血糖濃度過(guò)高是糖尿病前期患者的主要特征,持續(xù)性高血糖與-葡萄糖苷酶活性密切相關(guān)。-葡萄糖苷酶抑制劑可通過(guò)減緩碳水化合物的消化控制餐后血糖峰值,是臨床中的一線降糖藥物。近年來(lái),多肽作為安全有效的-葡萄糖苷酶抑制劑備受關(guān)注。Yu Zhipeng等從雞蛋清水解物中分離得到具有-葡萄糖苷酶抑制活性的肽段,并證實(shí)RVPSLM的抑制活性效果最好,半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC)為23.07 μmol/L。朱作藝等以蜂王漿粗蛋白為肽源制備-葡萄糖苷酶抑制肽,其IC為6.94 mg/mL。史加加用胃蛋白酶和胰蛋白酶水解西藏牦牛奶渣酪蛋白,得到的酶解液對(duì)-葡萄糖苷酶的抑制率達(dá)72%。甲魚蛋是制備-葡萄糖苷酶抑制肽的一種優(yōu)質(zhì)來(lái)源。Qiu Leyun等利用木瓜蛋白酶水解甲魚蛋,酶解液經(jīng)超濾得到的組分(分子質(zhì)量<2.5 kDa)具有較強(qiáng)的-葡萄糖苷酶抑制能力,并從中鑒定出16種-葡萄糖苷酶抑制肽。

    普遍認(rèn)為,生物活性肽在胃中易變性、易被蛋白酶降解,生物利用度被嚴(yán)重降低。因此,通常通過(guò)包埋活性肽,以避免肽在體內(nèi)發(fā)揮活性前被降解,從而延長(zhǎng)保留時(shí)間,提高吸收利用率。利用天然生物大分子的特性和納米技術(shù)聯(lián)合制備運(yùn)載體系對(duì)多肽類物質(zhì)進(jìn)行包埋,對(duì)提高生物活性肽的蛋白酶水解穩(wěn)定性,從而解決生物利用率低的問(wèn)題具有重要指導(dǎo)意義。外泌體是一類直徑在40~100 nm之間的囊泡樣小體,由于獨(dú)特的納米級(jí)結(jié)構(gòu)以及低免疫原性、高穩(wěn)定性、高運(yùn)載效率、靶向性和滲透性等優(yōu)勢(shì),外泌體作為一種新型運(yùn)載體系已成為眾多研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。Sun Dongmei等將姜黃素封裝在外泌體中,外泌體-姜黃素復(fù)合物的形成提高了姜黃素的溶解度、體外穩(wěn)定性、抗炎活性及體內(nèi)生物利用度。Fan Yue等發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體是白藜蘆醇的優(yōu)良載體,包埋2 h后白藜蘆醇的體內(nèi)濃度增加,并且降解率低于30%。Wang Piaopiao等用外泌體作為紫杉醇的載體制備納米復(fù)合物,發(fā)現(xiàn)外泌體-紫杉醇對(duì)4T1荷瘤小鼠表現(xiàn)出較紫杉醇更強(qiáng)的抗腫瘤作用。固體脂質(zhì)納米顆粒(solid lipid nanoparticles,SLN)是20世紀(jì)90年代初發(fā)展的一種新型固體膠粒運(yùn)載體系,粒徑在40~1 000 nm。SLN理化性質(zhì)穩(wěn)定、生物利用度高、安全性高,同時(shí)能夠保護(hù)運(yùn)載物質(zhì)不被降解。Liu Mengyao等成功將葉黃素封裝在不同脂質(zhì)載體中并進(jìn)行體外模擬胃腸消化,發(fā)現(xiàn)SLN-葉黃素的體外生物利用度最高。Sacchetti等用SLN運(yùn)載一種親水性八肽LSCQLYQR,結(jié)果表明該肽在SLN中具有良好穩(wěn)定性且包埋率為23%。SLN可用作天然抗菌肽的良好載體,并保持抗菌活性長(zhǎng)達(dá)20 d。目前對(duì)外泌體的研究大多集中在分離提取、鑒定與表征方面,對(duì)SLN的研究主要為其顆粒特征,而將兩者用于包埋-葡萄糖苷酶抑制肽的研究鮮見報(bào)道。

    實(shí)驗(yàn)前期已從甲魚蛋蛋白水解產(chǎn)物中分離鑒定出具有-葡萄糖苷酶抑制特性的潛在抗糖尿病寡肽SGTLLHK,其IC為289 μmol/L。考慮到寡肽進(jìn)入人體后面臨的復(fù)雜體內(nèi)環(huán)境會(huì)導(dǎo)致其生物利用率更低,難以發(fā)揮作用,為解決這一瓶頸問(wèn)題,本研究選用寡肽SGTLLHK作為實(shí)驗(yàn)材料,探究甲魚蛋-葡萄糖苷酶抑制肽的體外胃腸消化特性及其活性變化,并制備SGTLLHK-外泌體顆粒和SGTLLHK-SLN,以Zeta電位、粒徑、多分散性指數(shù)(polymer dispersity index,PDI)、包埋率為指標(biāo),對(duì)比兩種多肽-納米顆粒包埋效果,并對(duì)其胃腸道穩(wěn)定性進(jìn)行研究,以期為甲魚蛋-葡萄糖苷酶抑制肽的納米化保護(hù)提供一定理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    寡肽SGTLLHK由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,純度達(dá)98%以上。

    -葡萄糖苷酶(來(lái)源于酵母,50 U/mg) 上海源葉生物科技有限公司;胰蛋白酶(來(lái)源于豬胰腺,250 U/mg)、胃蛋白酶(來(lái)源于豬胃黏膜,3 000 U/mg)、對(duì)硝基苯基吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl---glucopyranoside,-NPG)、甲酸(色譜級(jí)) 北京索萊寶科技有限公司;單硬脂酸甘油酯 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;泊洛沙姆188 德國(guó)巴斯夫股份公司;外泌體提取試劑盒(細(xì)胞培養(yǎng)基上清) 上海貝博生物科技公司;乙腈(色譜級(jí)) 美國(guó)Sigma公司;氫氧化鈉、乙醇、碳酸鈉 西隴化工股份有限公司;濃鹽酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    SHZ-A水浴恒溫振蕩器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;JY-86-2-50型-80 ℃冰箱、Neofuge 15R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 香港力康發(fā)展有限公司;磁力攪拌器 鄭州亞榮儀器有限公司;SU8010掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)日本日立公司;1100型高效液相色譜儀、超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry,UHPLC-QTOF-MS/MS)美國(guó)Agilent公司;AR1140電子分析天平 奧豪斯儀器有限公司;Nano-ZS Zetasizer粒徑分析儀 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;EXL800全自動(dòng)酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek Instruments有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 體外模擬胃腸消化

    參照Minekus等的方法并稍作修改。稱取適量-葡萄糖苷酶抑制肽SGTLLHK用去離子水配成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液加入1 mL胃蛋白酶溶液,用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至1.8,混合均勻(體系最終酶活力2 000 U/mL),于37 ℃避光反應(yīng)2 h,收集胃消化液,90 ℃水浴10 min滅活蛋白酶,終止反應(yīng),冷卻至室溫,將胃消化液于4 ℃、10 000 r/min離心10 min,收集上清液進(jìn)行測(cè)定。

    在上述胃消化體系中繼續(xù)加入2 mL胰蛋白酶溶液,用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0,充分混勻(體系最終酶活力100 U/mL),37 ℃避光反應(yīng)2 h,收集腸消化液,90 ℃水浴10 min滅酶,冷卻至室溫,將胃腸消化液于4 ℃、10 000 r/min離心10 min,收集上清液,-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.2 消化液中肽段的鑒定

    參照Wang Xuefeng等的方法并稍作修改。將收集到的消化液通過(guò)Empore? SPE C小柱(6 mL)反相萃取脫鹽,然后冷凍干燥并用體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液重懸,待UHPLC-QTOF-MS/MS進(jìn)行肽段序列的鑒定。

    HPLC條件:流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液,B為體積分?jǐn)?shù)84%乙腈溶液(含0.1%甲酸),Agilent RRHD Eclipse Plus C(2.1 mm×150 mm,1.8 μm)以95%的A相進(jìn)行平衡,流速0.3 mL/min。樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器Zorbax 300SB-CPeptide Traps上樣,再經(jīng)過(guò)液相色譜柱分離,梯度洗脫:0~1 min,96% A、4% B;1~30 min,96%~50% A、4%~50% B;30~34 min,50%~0% A、50%~100% B;34~35 min,0% A、100% B;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量1 μL。

    MS鑒定:電噴霧離子源;正離子模式;掃描范圍/100~1 800;碰撞能量30 eV;分析時(shí)長(zhǎng)60 min。質(zhì)譜測(cè)試原始文件用MaxQuant 1.5.5.1軟件檢索相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù),得到肽段鑒定及定量分析結(jié)果。查庫(kù)相關(guān)參數(shù):允許最大漏切位點(diǎn)數(shù)2;固定修飾Carbamidomethyl(C);可變修飾Oxidation(M);一級(jí)離子質(zhì)量容差2×10;二級(jí)離子質(zhì)量容差0.1 Da;錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率0.01。根據(jù)MaxQuant 中基于強(qiáng)度的絕對(duì)定量對(duì)鑒定的肽豐度進(jìn)行量化。通過(guò)MS鑒定到的-葡萄糖苷酶抑制原肽及其產(chǎn)物的比例確定消化率。

    1.3.3 消化液的-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定

    參照Yu Zhipeng等的方法并稍作修改。移取100 μL胃腸消化液與50 mL-葡萄糖苷酶溶液(0.35 U/mL)充分混合均勻,于37.5 ℃孵育20 min后,再加入100 μL 1 mmol/L-NPG,繼續(xù)37.5 ℃孵育20 min,加入1 mol/L NaCO溶液終止反應(yīng),于410 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用100 μL去離子水作為對(duì)照,-葡萄糖苷酶抑制率按式(1)計(jì)算:

    1.3.4 多肽-SLN的制備

    參照Chai Guihong等的方法并稍作修改。稱取50 mg單硬脂酸甘油酯,溶解于50 mL無(wú)水乙醇中,在70 ℃水浴下磁力攪拌至均勻,加入50 mg寡肽SGTLLHK和50 mL 0.1%泊洛沙姆188,70 ℃、400 r/min繼續(xù)攪拌5 min。然后室溫放置使乙醇充分揮發(fā),調(diào)節(jié)pH值至1.2,4 200 r/min離心20 min,取25 mL離心后的溶液加入50 mL 0.1%泊洛沙姆188中,經(jīng)超聲處理(超聲2 s、間隙3 s,重復(fù)20 次)形成均勻白色乳液。將乳液于4 200 r/min離心20 min,獲得上清液,即為SGTLLHK-SLN。

    1.3.5 多肽-外泌體納米顆粒的制備

    1.3.5.1 外泌體的提取

    參照外泌體提取試劑盒說(shuō)明書提取牛乳外泌體。取-80 ℃貯藏牛乳于25 ℃恒溫水浴鍋解凍,完全解凍后移取10 mL于4 ℃、3 000 r/min離心20 min,去除大部分細(xì)胞和碎片。收集的上清液加入5 mL外泌體提取試劑,渦旋充分混合均勻后于4 ℃放置過(guò)夜。孵育后將提取液于4 ℃、10 000 r/min離心60 min,移去上清液,收集離心管底部的外泌體沉淀,用1 mL磷酸鹽緩沖液重懸,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.5.2 外泌體的特征分析

    用去離子水稀釋外泌體,配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的懸液。取1 mL置于一次性毛細(xì)管中,使用粒徑分析儀測(cè)定外泌體Zeta電位、粒徑、PDI。測(cè)定3 次取平均值。

    將外泌體冷凍干燥后用SEM觀察。

    取100 μL外泌體懸液,加入20 μL 6×上樣緩沖液,渦旋混勻后沸水浴5 min使蛋白變性,冷卻至室溫。配制12%的分離膠和4%的濃縮膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),上樣量10 μL,在70 V下使條帶分離至濃縮膠與分離膠交界處,再在120 V下電泳至分離膠底部。

    1.3.5.3 多肽-外泌體顆粒的制備

    取0.2 mL外泌體懸液,加入1 mg寡肽SGTLLHK渦旋混合均勻后,經(jīng)超聲處理(超聲30 s、間隙90 s,重復(fù)6 次),將超聲后溶液于37 ℃下孵育60 min,回收外泌體膜。

    1.3.6 多肽-納米顆粒包埋率的測(cè)定

    采用HPLC法測(cè)定游離肽含量計(jì)算多肽-納米顆粒包埋率。Waters XBridg BEH SEC色譜柱(7.8 mm×300 mm,3.5 μm),二極管陣列檢測(cè)器,流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液,流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-乙腈,柱溫30 ℃,流速0.8 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm,進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫條件為:0~3 min,98% A、2% B;3~6 min,98%~97% A、2%~3% B;6~9 min,97% A、3% B;9~15 min,97%~96% A、3%~4% B;15~18 min,96% A、4% B;18~21 min,96%~95% A、4%~5% B。肽包埋率按式(2)計(jì)算:

    式中:、分別為包埋前后肽峰面積。

    1.3.7 多肽-納米顆粒的特征分析

    方法同1.3.5.2節(jié)。

    1.3.8 多肽-納米顆粒的消化特性

    方法同1.3.1和1.3.2節(jié)。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    2 結(jié)果與分析

    2.1 α-葡萄糖苷酶抑制肽在體外模擬胃腸消化過(guò)程中的變化

    活性肽在消化過(guò)程中會(huì)因pH值的急劇變化活性部分降低或喪失。因此,生物活性肽在模擬胃腸消化過(guò)程中的穩(wěn)定對(duì)其在體內(nèi)發(fā)揮正常的生理作用具有重要意義。通過(guò)分析胃腸道消化過(guò)程中肽段降解情況,從而確定多肽活性降低的具體消化階段,可有針對(duì)性地保護(hù)肽段減少活性損失。如圖1所示,原肽SGTLLHK在8.39 min左右出峰,經(jīng)過(guò)模擬胃消化階段后,胃消化產(chǎn)物在8.42 min左右出峰,經(jīng)腸道消化后,峰右移,出峰時(shí)間為8.46 min。說(shuō)明胃、小腸均對(duì)寡肽SGTLLHK有一定的消化作用且生成新的消化產(chǎn)物。

    圖1 SGTLLHK體外模擬胃(A)、腸道(B)消化的液相色譜圖Fig. 1 HPLC profiles of SGTLLHK during in vitro simulated gastric (A) and gastrointestinal (B) digestion

    2.2 胃腸消化產(chǎn)物的質(zhì)譜鑒定

    如圖2所示,多肽MS/MS碎片離子主要為b離子和y離子。與譜庫(kù)比對(duì),SGTLLHK的胃消化產(chǎn)物共鑒別出2個(gè)序列,分別為SGTLL(Ser-Gly-Thr-Leu-Leu)和GTLL(Gly-Thr-Leu-Leu);結(jié)合圖3可知,SGTLLHK在胃消化階段被完全酶解成SGTLL和GTLL,其中SGTLL比例較高(占94.5%),而在腸消化階段后僅存在SGTLL。說(shuō)明-葡萄糖苷酶抑制肽SGTLLHK在胃消化階段已被完全分解,可能是因?yàn)槲傅鞍酌竷?yōu)先切割疏水性氨基酸,而SGTLLHK內(nèi)部含有兩個(gè)Leu,導(dǎo)致其對(duì)胃消化耐受性極低。

    圖2 SGTLLHK消化產(chǎn)物SGTLL(A)、GTLL(B)二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 2 ESI-MS/MS spectra of SGTLL (A) and GTLL (B) from the digestion products of SGTLLHK

    圖3 SGTLLHK主要消化產(chǎn)物占比Fig. 3 Proportions of major digestion products of SGTLLHK

    2.3 消化后SGTLLHK的α-葡萄糖苷酶抑制活性

    如圖4所示,胃消化結(jié)束后消化液的-葡萄糖苷酶抑制活性顯著升高,達(dá)到54.05%,而經(jīng)腸消化后顯著降低(<0.05),且低于未消化時(shí)。說(shuō)明胃消化后肽段具有更好的-葡萄糖苷酶抑制能力,而腸消化產(chǎn)物抑制活性反而較低。氨基酸組成和結(jié)構(gòu)決定多肽的生物活性。-葡萄糖苷酶抑制肽的活性可能與疏水性氨基酸含量有關(guān),抑制-葡萄糖苷酶的多肽序列中疏水性氨基酸含量較高。Wang Rongchun等分析3種蛋白經(jīng)堿性蛋白酶水解后的氨基酸組成,發(fā)現(xiàn)大豆蛋白酶解液中Pro(4.06%)、Tyr含量(2.59%)明顯高于乳清蛋白和綠豆蛋白酶解液,且具有較高的-葡萄糖苷酶抑制活性(53.79%)。Zong Yafeng等研究-酪啡肽7(YPFPGPI)的降血糖功能,發(fā)現(xiàn)該肽會(huì)抑制小腸對(duì)葡萄糖的吸收,且主要由疏水性氨基酸組成。SGTLLHK受到胃蛋白酶切割,可能導(dǎo)致肽鏈內(nèi)部某些疏水性基團(tuán)暴露,其主要通過(guò)疏水性相互作用與-葡萄糖苷酶結(jié)合,從而產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制。因此,本研究經(jīng)胃蛋白酶消化后SGTLLHK的-葡萄糖苷酶抑制活性顯著增強(qiáng),而經(jīng)胰蛋白酶作用后,-葡萄糖苷酶抑制活性顯著下降,推測(cè)可能是由于疏水性氨基酸含量降低,但還需進(jìn)一步研究。綜上,為使原肽SGTLLHK避免被胃液破壞且能到達(dá)小腸發(fā)揮對(duì)-葡萄糖苷酶的抑制作用,本實(shí)驗(yàn)選擇納米顆粒對(duì)該肽進(jìn)行包埋,提高活性肽在胃腸消化過(guò)程中的穩(wěn)定性。

    圖4 消化后SGTLLHK的α-葡萄糖苷酶抑制活性Fig. 4 α-Glucosidase inhibitory activity of SGTLLHK after digestion

    2.4 牛乳外泌體的特征鑒定

    圖5 牛乳-外泌體的SEM(A)、SDS-PAGE(B)和粒徑分布(C)表征Fig. 5 SEM image (A), SDS-PAGE pattern (B) and particle size distribution (C) of milk-derived exosomes

    牛乳成分復(fù)雜,含量豐富的脂質(zhì)以脂肪球的形式大量存在,脂肪球與外泌體某些性質(zhì)相似,此外還含有大量酪蛋白,其密度與外泌體密度十分接近。由表1可知,外泌體的Zeta電位為(-18.43±2.16)mV、粒徑為(137.7±3.50)nm,PDI為0.13±0.02,呈較窄的分布范圍。由圖5可知,外泌體納米顆粒表面光滑,形狀呈球狀且尺寸不均一,粒徑在70~400 nm之間,峰值單一。乳源外泌體表征幾乎均呈簡(jiǎn)單球形,且大部分粒徑分布在30~200 nm。從SDS-PAGE圖可以看出外泌體主要有6個(gè)明顯條帶,在76 kDa左右有明顯的乳鐵蛋白條帶,其他條帶可能為外泌體膜表面和外泌體內(nèi)的蛋白質(zhì)。

    表1 牛乳外泌體的特性Table 1 Properties of cow milk-derived exosomes

    2.5 多肽-納米顆粒的包埋效果及特征

    如圖6所示,SLN和外泌體包埋后寡肽峰面積均明顯減小,在SGTLLHK-SLN包埋體系中僅能檢測(cè)到一小部分肽。SGTLLHK-外泌體納米顆粒包埋率為31.98%,而SGTLLHK-SLN包埋率為96.05%。

    圖6 SGTLLHK-外泌體(A)和SGTLLHK-SLN(B)的HPLC圖Fig. 6 HPLC profiles of SGTLLHK-exosomes (A) and SGTLLHK-SLN (B)

    表2 SLN、SGTLLHK、SGTLLHK-SLN和SGTLLHK-外泌體的特性Table 2 Properties of SLN, SGTLLHK, SGTLLHK-SLN and SGTLLHK-exosomes

    如表2所示,SGTLLHK的Zeta電位為(2.43±0.32)mV,SGTLLHK-SLN的Zeta電位降低至(-10.56±0.78)mV,SGTLLHK-外泌體的Zeta電位降低至(-12.03±0.59)mV。Zeta電位是評(píng)價(jià)納米顆粒體系穩(wěn)定性的重要指標(biāo),反映了顆粒表面的凈電荷數(shù)量,凈電荷多發(fā)生靜電排斥時(shí)不易聚集,說(shuō)明體系越穩(wěn)定。因此,SGTLLHK-外泌體顆粒體系較SGTLLHK-SLN具有較高穩(wěn)定性。

    在高于油相熔點(diǎn)的溫度下得到O/W納米乳液(或乳液),隨后進(jìn)行冷卻促進(jìn)脂質(zhì)微滴結(jié)晶生產(chǎn)SLN。據(jù)報(bào)道由單硬脂酸甘油酯制成的SLN粒徑在1 000 nm以內(nèi),本研究中制備的SLN粒徑為(535.93±16.84)nm。納米顆粒粒徑越小,穩(wěn)定性更好。SGTLLHK-外泌體粒徑僅為(125.87±2.66)nm,遠(yuǎn)小于SGTLLHK-SLN((558.83±3.33)nm)和SLN((535.93±16.84)nm),與Zeta電位結(jié)果一致。SGTLLHK-SLN粒徑較大,穩(wěn)定性較低,可能是因?yàn)榈玫降腛/W納米乳液體系在親水性生物活性肽或蛋白包封后容易聚集,可能會(huì)使肽或蛋白質(zhì)逃逸。而SGTLLHK-外泌體粒徑較小,穩(wěn)定性較好,可能是因?yàn)樗苄陨锘钚噪谋话庠谕饷隗w囊泡的親水性核心中。

    當(dāng)PDI<0.4時(shí),說(shuō)明懸浮液有良好的穩(wěn)定性,而高PDI值會(huì)引起懸浮液中顆粒或液滴聚集、絮凝。本研究中,SLN的PDI值為0.31±0.04,SGTLLHKSLN和SGTLLHK-外泌體的PDI值分別為0.46±0.01和0.17±0.01。

    以上結(jié)果表明,寡肽SGTLLHK成功包埋于SLN和外泌體中,并且SGTLLHK-外泌體納米顆粒體系更穩(wěn)定。

    如圖7所示,包埋前,-葡萄糖苷酶抑制肽SGTLLHK形狀大多為片狀,而用SLN和外泌體包埋后均呈圓滑的顆粒球狀,此外,明顯觀察到SGTLLHK-SLN顆粒較大,且出現(xiàn)聚集現(xiàn)象,外泌體包埋后體系顆粒較小,極少有聚集。綜上所述,SGTLLHK-外泌體顆粒體系在懸浮液中具有高度穩(wěn)定性。

    圖7 SGTLLHK(A)、SGTLLHK-SLN(B)和SGTLLHK-外泌體(C)的SEM圖Fig. 7 SEM images of SGTLLHK (A), SGTLLHK-SLN (B) and SGTLLHK-exosomes (C)

    2.6 多肽-外泌體和多肽-SLN體外模擬胃腸道的消化特性

    乳液的穩(wěn)定性及其在胃腸道中的消化特性取決于其粒徑大小,盡管SGTLLHK-外泌體和SGTLLHK-SLN納米顆粒在懸浮液中均具有良好的穩(wěn)定性,但對(duì)環(huán)境脅迫(如pH值的急劇變化、鹽離子濃度及各種胃腸道蛋白酶)仍較為敏感。如圖8所示,SGTLLHK-外泌體顆粒有兩個(gè)明顯的峰,其中寡肽SGTLLHK在8.9 min出峰。經(jīng)胃消化階段,肽峰強(qiáng)度沒(méi)有明顯減小,根據(jù)峰面積計(jì)算得出此階段的肽保留率為93.65%,這說(shuō)明SGTLLHK-外泌體能夠在強(qiáng)pH值胃酸環(huán)境下穩(wěn)定存在并保護(hù)寡肽SGTLLHK不被降解。繼續(xù)腸道消化后,在8.9 min處肽峰強(qiáng)度降低,而11.56 min處的峰強(qiáng)度升高,此階段的肽保留率較高,為72.52%,說(shuō)明在腸液中性環(huán)境下,少部分肽從外泌體納米顆粒中逃逸。Sun Dongmei等將姜黃素-外泌體于37 ℃水浴中避光孵育150 min后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大部分姜黃素免受降解,保留率達(dá)80%。Fan Yue等發(fā)現(xiàn)經(jīng)外泌體封裝的白藜蘆醇在處理2 h后約70%白藜蘆醇被保留,而游離白藜蘆醇在前25 min內(nèi)迅速被降解。綜上,SGTLLHK-外泌體具有一定的耐胃腸消化特性,這一特性能夠改善-葡萄糖苷酶抑制肽SGTLLHK生物可利用度低的問(wèn)題。

    圖8 SGTLLHK-外泌體模擬胃腸消化前后的HPLC圖Fig. 8 HPLC profiles of SGTLLHK-exosomes during in vitro digestion

    如圖9所示,SGTLLHK-SLN中寡肽SGTLLHK在9.5 min左右出峰,在模擬胃消化階段,根據(jù)峰面積進(jìn)行計(jì)算得到SGTLLHK-SLN具有較高的肽保留率(88.37%),這一部分損失主要為SLN顆粒表面聚集的肽,一旦與胃液接觸便可引起其降解,說(shuō)明SLN可以有效保護(hù)SGTLLHK免于胃中蛋白酶的降解。然而,SGTLLHK在腸消化階段的保留率僅為48.43%,表明SGTLLHK-SLN納米顆粒能在腸道中存在,但對(duì)寡肽的保留率低于SGTLLHK-外泌體。綜上,外泌體納米顆粒對(duì)-葡萄糖苷酶抑制肽SGTLLHK的保護(hù)作用優(yōu)于SLN納米顆粒。

    圖9 SGTLLHK-SLN模擬胃腸消化前后的HPLC圖Fig. 9 HPLC profiles of SGTLLHK-SLN during in vitro digestion

    3 結(jié) 論

    甲魚蛋-葡萄糖苷酶抑制肽SGTLLHK不耐胃腸道消化,其在胃消化階段就已被完全降解成兩種產(chǎn)物SGTLL和GTLL,胃消化液的-葡萄糖苷酶抑制活性顯著上升。GTLL經(jīng)后續(xù)腸消化完全被降解,而SGTLL耐腸消化,胃腸消化液的-葡萄糖苷酶抑制顯著下降,且低于原肽抑制能力。牛乳外泌體和SLN均能成功包埋SGTLLHK,且SGTLLHK-外泌體在模擬胃腸道消化中的穩(wěn)定性優(yōu)于SGTLLHK-SLN。本研究為甲魚蛋-葡萄糖苷酶抑制肽的保護(hù)提供了理論依據(jù)。

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