超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測麥類中典型鏈格孢霉毒素

吳 希，邢家溧，鄭睿行，張愛芝，毛玲燕，徐曉蓉，婁永江，穆應(yīng)花

（1.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.寧波市產(chǎn)品食品質(zhì)量檢驗研究院（寧波市纖維檢驗所），浙江 寧波 315048）

鏈格孢霉毒素（toxins，ATs）是鏈格孢霉菌產(chǎn)生的次級代謝物，最為典型的有鏈格孢酚（alternariol，AOH）、交鏈格孢酚單甲醚（alternariol monomethyl ether，AME）、交鏈孢烯（altenuene，ALT）、細(xì)交鏈格孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）、交鏈孢毒素I（altertoxin I，ATX-I）、騰毒素（tentoxin，Ten）和細(xì)格菌素（altenusin，ALS）。這些毒素在自然界中廣泛存在，會侵染谷物導(dǎo)致作物減產(chǎn)，還能污染后續(xù)的加工產(chǎn)品造成經(jīng)濟損失。ATs具有急慢性毒性以及三致效應(yīng)（致癌、致畸、致突變），對人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

麥類作物易受ATs污染，Siegel等在蕎麥粉中檢出TeA含量高達(dá)851 μg/kg；何玲等在調(diào)查四川省市售小麥及其制品中ATs污染情況時，在小麥及其制品檢出AOH、AME、TeA和Ten含量分別為0.75、0.57、27.2 μg/kg和4.78 μg/kg；Asam等在調(diào)查嬰兒谷物產(chǎn)品中的ATs污染情況時，在小麥、燕麥、黑麥產(chǎn)品中檢出TeA含量為8～30 μg/kg。隨著ATs危害逐漸明晰，人們的風(fēng)險防范意識也逐步加強，但因缺乏準(zhǔn)確的檢測分析方法和系統(tǒng)性的風(fēng)險評估數(shù)據(jù)，鮮見ATs的相關(guān)法規(guī)與限量標(biāo)準(zhǔn)，目前我國僅有1 項ATs的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，但應(yīng)用范圍只限于部分果蔬。因此，要盡快建立簡單、快速、高效、靈敏的ATs檢測方法，推動我國麥類中ATs殘留水平的控制、檢測標(biāo)準(zhǔn)的制定和管理措施的采取。

目前，ATs的主要檢測技術(shù)有薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）法、酶聯(lián)免疫檢測（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）法、氣相色譜（gas chromatography，GC）和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法等。TLC與ELISA法操作繁瑣且靈敏度低，ATs穩(wěn)定性好而揮發(fā)性差在GC和GC-MS/MS檢測方法中受到限制。UPLC-MS/MS具有高靈敏度及高選擇性等優(yōu)點，近年來對ATs的分析主要集中在UPLC-MS/MS的研究和應(yīng)用方面。但目前麥類中ATs的研究大多集中于單一或幾種毒素的檢測，如Siegel等利用UPLC-MS/MS檢測蕎麥粉中TeA，檢出限為10 μg/kg；何玲等利用HPLC結(jié)合熒光檢測器同時檢測小麥中的AOH、AME、TeA、Ten毒素，檢出限為0.2～1.0 μg/kg；Asam等用UPLC-MS/MS法測定小麥、燕麥、黑麥中的TeA，檢出限為1 μg/kg。另外，為了進(jìn)一步提高檢測效果，目前報道了多種ATs的提取和富集方法，包括QuEChERS法和固相萃取方法。但這些方法雖然前處理簡單，靈敏度高，但檢出限高，只能同時檢測少數(shù)幾種ATs。

基于以上研究現(xiàn)狀，本研究擬采用具有操作簡單、富集倍數(shù)高、有機溶劑用量少、成本低廉等優(yōu)點的分散液-液微萃取（dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）方法，快速富集和凈化麥類中7種ATs，再結(jié)合UPLC-MS/MS技術(shù)，實現(xiàn)麥類中7種ATs的快速定性和定量測定。這將為麥類中ATs的污染狀況研究提供方法依據(jù)，也為我國食品中ATs限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥類樣品購于當(dāng)?shù)爻?，磨碎?00 r/min，5 min），過篩（40 目），于0 ℃條件下保存。

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸乙酯、氯苯、二氯甲烷、三氯甲烷（均為色譜純） 美國Sigma公司；無水硫酸鎂、氯化鈉（均為分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；毒素標(biāo)準(zhǔn)品：AOH、AME、ALT、TeA、ATX-I、Ten和ALS（純度均≥98%） 上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Xevo TQ-XS三重四極桿質(zhì)譜儀、BEH C色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）、HSS T色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm） 美國Waters公司；X1R高速離心機 美國賽默飛世爾科技公司；TGL-20M高速臺式冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；TurboVap? LV多功能全自動樣品濃縮儀 上海Biotage有限公司；Milli-Q型超純水機（電阻率為18.2 MΩ·cm）美國Millipore公司；IKA-Vortexd2旋渦混合器 德國IKA（艾卡）儀器設(shè)備有限公司；Multi Reax-Heidolph多管漩渦振蕩器 德國海道夫儀器設(shè)備有限公司；ME-204電子分析天平（精度為0.000 1 g） 梅特勒-托利多儀器有限公司；KS-300EI超聲波清洗機 寧波科生設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取AOH、AME、ALT、TeA、ATX-I、Ten和ALS標(biāo)準(zhǔn)品0.001 g（精確至0.000 1 g）溶于10 mL乙腈中，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合液，取100 μL標(biāo)準(zhǔn)混合液（100 mg/L），并用乙腈溶解定容至10 mL棕色進(jìn)樣瓶中，得到質(zhì)量濃度為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，密封后置于-20 ℃保存、備用。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：用乙腈-水（1∶1，/）將標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級配制成質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/L的7種ATs的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液：用空白基質(zhì)溶液逐漸稀釋1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，制備成10 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 提取和凈化

準(zhǔn)確稱取1 g樣品（精確至0.01 g），置于50 mL的螺口尖底離心管中，加入3 mL一級水、10 mL1.5%甲酸乙腈-甲醇（4∶1，/）提取劑，渦旋3 min。加入2 g無水MgSO、1 g NaCl在40 ℃下超聲5 min、振蕩提取15 min，9 500 r/min、4 ℃離心10 min，取1 mL上清液。

加入100 μL三氯甲烷萃取劑、5 mL的1.5 g/L氯化鈉溶液、0.4%甲酸溶液（/），4 500 r/min離心5 min，取下清液，氮吹濃縮至干，用甲醇溶液復(fù)溶至1 mL，過0.22 μm有機濾膜，待UPLC-MS/MS分析。

1.3.3 分析條件

BEH C色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫為40 ℃；流動相：A為0.1%甲酸溶液（/），B為乙腈；流速0.40 mL/min；進(jìn)樣體積5 μL；梯度洗脫程序：0～5.0 min，90%～5% A、10%～95% B；5.0～7.0 min，5% A、95% B；7.0～7.5 min，5%～90% A、95%～10% B；7.5～10.0 min，90% A、10% B。

電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），正負(fù)離子模式掃描；毛細(xì)管電壓1.08 kV；錐孔電壓25 V；射頻透鏡1和射頻透鏡2的電壓均為15.0 V；離子源溫度150 ℃；脫溶劑溫度600 ℃；脫溶劑氣流量1 000 L/h；錐孔反吹氣流量150 L/h；多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式。7種ATs的保留時間和質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 MRM模式下7種ATs的保留時間和質(zhì)譜測定參數(shù)Table 1 Retention time and mass spectral parameters for the seven ATs in MRM mode

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取7種目標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/L），分別以自動進(jìn)樣的方式在全掃檢測模式下進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。結(jié)果顯示ATX-I在ESI模式掃描下不成峰，而在ESI模式掃描時響應(yīng)值較高（圖1），且峰形尖銳，剩下6種ATs在ESI模式得到的離子峰的響應(yīng)值更佳。通過子離子掃描得到目標(biāo)物碎片化離子信息，選擇最強的產(chǎn)物離子和次強的產(chǎn)物離子分別作為7種ATs的定性和定量離子，并對錐孔電壓、碰撞電壓、離子源溫度、脫溶劑氣體溫度、碰撞氣體流量質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。實驗優(yōu)化的質(zhì)譜條件，使每種靶物質(zhì)得到最佳電離效率（表1）。

圖1ATX-I毒素的離子對質(zhì)譜圖Fig. 1 Ion pair mass spectra of ATX-I

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

分別選擇純水-乙腈和0.1%甲酸-乙腈溶液（/）作為流動相，比較2個流動相體系對分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在純水流動相中TeA毒素會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，而純水加入0.1%甲酸溶液（/）有利于抑制真菌毒素與色譜柱的靜電作用，避免拖尾現(xiàn)象，TeA毒素峰形對稱性明顯得到改善。因此本實驗最終選擇0.1%甲酸-乙腈溶液作為流動相。

取質(zhì)量濃度為100 μg/L的7種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以0.1%甲酸-乙腈溶液作為流動相，按表1進(jìn)行梯度洗脫，在保持濃度、流速、進(jìn)樣量等參數(shù)一致的條件下，考察HSS T（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）和BEH C（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）這2種色譜柱對7種ATs的分離效果以及每種毒素的峰形、保留時間。結(jié)果顯示BEH C分離效果優(yōu)于HSS T，7種ATs在BEH C柱上能獲得更好的峰形和檢測靈敏度，且BEH C具有廣譜性、次級相互作用較低，pH值耐受范圍寬（pH 1～12），柱效更高，峰形尖銳等優(yōu)點，故選擇BEH C作為分析柱。

同時對流速、柱溫及梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，確定流速為0.4 mL/min；柱溫為40 ℃；由于7種ATs具有不同的極性，ALT的極性較強，AME的極性較弱，為了兼顧7種ATs能同時出現(xiàn)良好峰形，需要對流動相進(jìn)行較大的梯度變化，通過不斷調(diào)整，確定的洗脫程序見1.3.3節(jié)。在最優(yōu)條件下得到的7種ATs色譜圖見圖2，可以看出7種ATs在5 min內(nèi)可較好分離。

圖2 優(yōu)化條件下6種ATs的正離子圖（A）和ATX-I的負(fù)離子圖（B）Fig. 2 Positive ion chromatograms of six ATs (A) and negative ion chromatogram of ATX-I under the optimized conditions (B)

2.2 提取液的優(yōu)化

ATs易溶于甲醇與乙腈，其中TeA的酸性和極性較強，需在提取劑中加入適量的酸，1.5%甲酸最有利于TeA的提取。研究比較1.5%甲酸-乙腈（/）、1.5%甲酸乙腈-甲醇的不同比例對7種ATs提取效果的影響，結(jié)果表明，添加甲醇對ATX-I的提取效果影響明顯，對比1.5%甲酸-乙腈（/）提取體系，ATX-I的回收率在1.5%甲酸乙腈-甲醇（4∶1，/）體系中提升10%，這也與暢彤等研究適量的甲醇有利于ATX-I提取一致；甲酸的添加有利于TeA的提取，在1.5%甲酸-乙腈（/）提取體系中回收率高達(dá)92%；1.5%甲酸乙腈-甲醇比例從1∶4到4∶1，小麥樣品的提取液顏色由深黃色變?yōu)闇\黃色，猜測色素這一干擾物對實驗的干擾在減小。1.5%甲酸乙腈-甲醇（4∶1，/）提取體系中7種ATs的回收率最佳，在78.7%～100%之間（圖3），故選擇1.5%甲酸乙腈-甲醇（4∶1，/）提取體系。

圖3 提取溶劑體系對小麥樣品中7種ATs回收率的影響（n=5）Fig. 3 Effect of extraction solvent systems on the recoveries of seven ATs in wheat samples (n = 5)

2.3 萃取條件的優(yōu)化

2.3.1 萃取劑的優(yōu)化

小麥樣品經(jīng)提取、鹽析分層后，蛋白質(zhì)、油脂、色素以及糖組分等會被萃取出來，為減小雜質(zhì)的影響，對萃取條件進(jìn)行考察。以1.5%甲酸乙腈-甲醇（4∶1，/）提取液作為分散劑，分別考察乙酸乙酯、氯苯、二氯甲烷、三氯甲烷作為萃取劑時對各目標(biāo)組分的萃取效率，以7種ATs含量計算回收率。使用乙酸乙酯作為萃取試劑時沒有觀察到沉積相，因此不適合作為萃取試劑。使用其他3種萃取劑所得回收率見圖4，三氯甲烷回收率（83.1%～94%）比氯苯（75.1%～88.7%）和二氯甲烷（62.7%～72.7%）較優(yōu)，當(dāng)以三氯甲烷作為萃取劑時，各個目標(biāo)物質(zhì)的萃取效率較好，對目標(biāo)組分無干擾，且三氯甲烷在水中的溶解度較小，可以減少萃取劑的損失，故選擇三氯甲烷作為本實驗的萃取溶劑。

圖4 萃取劑種類對7種ATs回收率的影響（n=5）Fig. 4 Effect of extractant type on the recoveries of seven ATs in wheat samples (n = 5)

2.3.2 萃取體積的優(yōu)化

由于使用三氯甲烷溶劑進(jìn)行DLLME時，小麥樣品基質(zhì)中某些成分會沉淀在離心管底部，影響萃取試劑的吸取。因此，使用更大體積的萃取試劑可以更方便吸取離心后的萃取試劑。在分散劑體積為1 mL的條件下，分別用50、100、150 μL的三氯甲烷進(jìn)行萃取，考察不同體積萃取劑對萃取回收率的影響。結(jié)果如圖5所示，隨著三氯甲烷體積增大，回收率也增大，而當(dāng)體積大于100 μL時，回收率增加不明顯，而且三氯甲烷的使用體積越大，實驗更耗時，最終萃取劑中三氯甲烷的占比也越大，對于含有甲酸的流動相體系，容易造成溶劑效應(yīng)，使峰形變差。因此，最終確定三氯甲烷100 μL為最佳萃取體積。

圖5 萃取劑體積對7種ATs回收率的影響（n=5）Fig. 5 Effect of extractant volume on the recoveries of seven ATs in wheat samples (n = 5)

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 方法的線性范圍、檢出限、定量限

以乙腈為溶劑，配制7種ATs系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣分析。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（，μg/L），以峰面積為縱坐標(biāo)（，AU），繪制目標(biāo)分析物的基質(zhì)加標(biāo)校正曲線（表2）。結(jié)果顯示，7種ATs在各自范圍內(nèi)均能獲得良好的線性關(guān)系，均大于0.987 277，以信噪比3和信噪比10確定方法的檢出限和定量限。7種ATs的檢出限和定量限分別為0.11～0.16 μg/kg和0.42～0.49 μg/kg。

表2 7種ATs的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, correlation coefficients, detection limits, and quantification limits of seven ATs

2.4.2 加標(biāo)回收率以及精密度

按1.3.2節(jié)處理小麥樣品，分別以1、2 倍和10 倍定量限進(jìn)行三水平加標(biāo)實驗。每個水平在1 d內(nèi)重復(fù)測定5 次，計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。如表3所示，7種ATs的平均加標(biāo)回收率為70.7%～101.3%，RSD為1.22%～4.11%，均小于10%，說明該方法性能良好。本方法對小麥樣品的不同含量的7種ATs均具有較高的回收率和精密度，滿足檢測要求。

表3 7種ATs在小麥樣品中的加標(biāo)回收率和精密度（n= 5）Table 3 Recoveries and precision of seven ATs spiked in wheat samples (n = 5)

2.4.3 基質(zhì)效應(yīng)

取質(zhì)量濃度為10 μg/L的7種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，比較基質(zhì)提取液和純?nèi)軇┲?種ATs響應(yīng)值，以評估基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）。ME＜85%或ME＞115%，存在基質(zhì)抑制或增強作用，85%≤ME≤115%，基質(zhì)對分析物的分析過程無顯著的干擾。

如表4所示，小麥樣品中7種ATs的ME在90.7%～115%之間，基質(zhì)對分析物的分析過程無顯著干擾，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度與可靠性。

表4 7種ATs在小麥樣品基質(zhì)的ME（n=5）Table 4 Matrix effect of seven ATs in wheat samples (n = 5)

2.4.4 與其他方法比較

如表5所示，本研究與QuEChERS方法相比回收率高，比固相萃取處理步驟簡單、試劑用量少、成本低廉等，且本研究涉及的ATs種類廣、數(shù)量多，結(jié)合UPLC-MS/MS具有檢測靈敏度高、抗干擾能力強、定性準(zhǔn)確等優(yōu)點，能用于麥類樣品中7種ATs的快速（5 min內(nèi)）定性、定量分析測定。

表5 本實驗方法與其他文獻(xiàn)方法的比較Table 5 Comparison of the UPLC-MS/MS method and other existing methods present in the literature

2.4.5 實際樣品測定

使用本實驗建立的方法對市購黑麥、蕎麥、莜麥、青稞、燕麥、小麥6種麥類樣品（各20個）進(jìn)行7種ATs的檢測分析，結(jié)果見表6。結(jié)果顯示這6種麥類中7種ATs均有不同程度的檢出，黑麥樣品檢出Ten、AOH、ALT、TeA、ALS；蕎麥樣品中檢出Ten、ALT、TeA、ALS、ATX-I；莜麥樣品中檢出7種ATs；青稞樣品中檢出Ten、ALT、TeA、ALS、ATX-I；燕麥樣品中檢出Ten、AOH、TeA、ALS、ATX-I；小麥樣品中檢出Ten、AOH、AME、ALT、TeA、ALS。Ten和TeA是6種麥類中都檢出的毒素，含量分別是0.6～10.7 μg/kg和未檢出～31 μg/kg；ALS雖檢出率低于Ten和TeA，但最高含量37.3 μg/kg與TeA相當(dāng)。實際樣品測定結(jié)果表明Ten、TeA廣泛存在于麥類中，這一研究結(jié)果與之前研究報道的結(jié)果基本一致。

表6 麥類樣品中7種ATs的含量統(tǒng)計Table 6 Statistical analysis of results obtained for the determination of seven ATs in rye, buckwheat, naked oat, barley, oat, and wheat

續(xù)表6

3 結(jié) 論

采用DLLME前處理結(jié)合UPLC-MS/MS同時檢測麥類中7種ATs的分析方法。該方法具有操作簡單、快速（7種ATs在5 min內(nèi)完成色譜分離分析）、回收率高、靈敏度高、檢出限低等優(yōu)點，能滿足麥類中真菌毒素的檢測要求，具有實際應(yīng)用價值。將該方法應(yīng)用于麥類樣品中的實際測定，結(jié)果顯示Ten和TeA是6種麥類中都檢出的毒素，含量分別為0.6～10.7 μg/kg和未檢出～31 μg/kg；ALS雖檢出率低于Ten和TeA，但最高含量37.3 μg/kg與TeA相當(dāng)，這些結(jié)果將為糧食中ATs殘留水平的控制、檢測標(biāo)準(zhǔn)的制定和管理措施的采取，都具有重要的理論和現(xiàn)實意義。