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    基于G-四鏈體的PCR-RCA雙重?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)沙門(mén)氏菌

    2022-07-07 03:05:18劉健慧張先舟張?zhí)N哲李蘭茹王紅靜耿鳳珍檀建新
    食品科學(xué) 2022年12期
    關(guān)鍵詞:啞鈴沙門(mén)氏菌產(chǎn)物

    劉健慧,張先舟,張?zhí)N哲,李蘭茹,王紅靜,高 潔,耿鳳珍,檀建新,*

    (1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北 保定 071000;2.河北旅游職業(yè)學(xué)院,河北 承德 067000;3.河北大學(xué)附屬醫(yī)院,河北 保定 071000)

    沙門(mén)氏菌()是一種革蘭氏陰性食源性病原菌,屬腸桿菌科,常以家畜、家禽作為傳染源。進(jìn)食被沙門(mén)氏菌污染而未煮熟的食品或未消毒的奶制品可誘發(fā)嘔吐、腹瀉等癥狀。在我國(guó),75%的細(xì)菌性食物中毒事件由沙門(mén)氏菌造成,因此為保障食品安全,急需快速靈敏的檢測(cè)手段對(duì)其監(jiān)控。

    目前,食源性病原菌的檢測(cè)手段主要包括傳統(tǒng)的微生物學(xué)檢測(cè)、生理生化鑒定和現(xiàn)代的免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法等。純培養(yǎng)方法雖作為檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn),但需要在各種選擇性培養(yǎng)基中進(jìn)行分離培養(yǎng)、形態(tài)檢測(cè)、生化鑒定,檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng),失去了快檢的應(yīng)用意義;免疫學(xué)方法雖不需要復(fù)雜的儀器,檢測(cè)準(zhǔn)確性好,但制備高特異性單克隆抗體相對(duì)困難、成本高,限制了其使用前景;分子生物學(xué)方法主要以核酸檢測(cè)方法為主,常分為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、多重PCR、實(shí)時(shí)PCR等非等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification,RCA)、鏈置換擴(kuò)增等等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。核酸檢測(cè)技術(shù)雖存在較多弊端,如過(guò)于敏感導(dǎo)致假陽(yáng)性和引物設(shè)計(jì)相對(duì)復(fù)雜、需要大量篩選驗(yàn)證等,但其檢測(cè)周期短、特異性強(qiáng)、可進(jìn)行多種病原菌同時(shí)檢測(cè),精準(zhǔn)定量,故取得了廣闊的發(fā)展。

    核酸信號(hào)輔助放大是快檢有效、直接的策略。生物素-親和素連接、酪酰胺信號(hào)放大、納米顆粒信號(hào)放大、核酸染料信號(hào)放大等技術(shù)均已實(shí)現(xiàn)廣泛應(yīng)用,但需額外在體系中添加或標(biāo)記信號(hào)放大因子,使實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)復(fù)雜,且靈敏度易受到添加量的干擾。而G-四鏈體作為富G的單鏈功能核苷酸,將其自身或互補(bǔ)堿基設(shè)計(jì)到相關(guān)序列中,可開(kāi)發(fā)出多種成本低、有效性強(qiáng)的生物傳感器。如水溶性苯并噻唑染料硫黃素T (thioflavin T,ThT)可特異性識(shí)別并嵌入G-四鏈體凹槽中,導(dǎo)致熒光信號(hào)顯著增強(qiáng),進(jìn)而通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。

    本研究先針對(duì)沙門(mén)氏菌基因設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物,并在下游引物的5’端標(biāo)記15個(gè)A堿基(15A),通過(guò)PCR擴(kuò)增積累誘發(fā)RCA反應(yīng)的環(huán)外“引物”。同時(shí)將G-四鏈體互補(bǔ)序列和15個(gè)A堿基設(shè)計(jì)成含有黏性末端的發(fā)卡結(jié)構(gòu),并連接成啞鈴環(huán)狀DNA,作為RCA擴(kuò)增的模板。以PCR產(chǎn)物為“橋梁”,將PCR與RCA偶聯(lián),當(dāng)沙門(mén)氏菌基因組DNA存在時(shí),啟動(dòng)RCA擴(kuò)增,不斷積累富G序列,最終通過(guò)測(cè)量雙重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物與ThT混合溶液的熒光強(qiáng)度,實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)。該方法在無(wú)靶標(biāo)的擴(kuò)增體系中無(wú)G-四鏈體生成,能夠極大降低背景值,為食品中致病菌的快檢提供新策略。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    志賀氏菌(ATCC 12022)、單核細(xì)胞性李斯特菌(CICC 21633)、金黃色葡萄球菌(CICC 21600)、銅綠假單胞菌(ABCC 0927)、大腸埃希氏菌(CMCC 44752)、甲型副傷寒沙門(mén)氏菌(CICC 21501)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(CICC 21484)、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌(CICC 21512)均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室提供;核酸序列由金唯智生物科技有限公司合成;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒 天根生化科技有限公司;2×EsMaster Mix(Dye)、PAGE凝膠制備試劑盒 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;100 bp DNA ladder、T4 DNA聚合酶 寶生物工程(大連)有限公司;50 bp ladder 北京聚合美生物科技有限公司;2.0 DNA聚合酶 NEB(北京)有限公司;ThT 北京Solarbio公司;其他主要試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    MTH-012型旋渦混合儀 海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司;070-851型PCR儀 德國(guó)Biometra公司;DYY-10 C型電泳儀 北京市六一儀器廠;JY04S-3E型凝膠成像分析系統(tǒng) 北京科普爾科技發(fā)展有限公司;K5500型超微量核酸測(cè)量?jī)x 北京凱奧科技發(fā)展有限公司;FP-750熒光分光熒光計(jì) 日本分光株式會(huì)社。

    1.3 方法

    1.3.1 細(xì)菌基因組提取

    取1 mL過(guò)夜培養(yǎng)菌液,提取細(xì)菌基因組DNA,具體操作方法見(jiàn)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)。并用核酸測(cè)量?jī)x對(duì)其DNA濃度及純度進(jìn)行測(cè)定。

    1.3.2 引物及啞鈴環(huán)設(shè)計(jì)

    通過(guò)Primer Premier 5設(shè)計(jì)了上游引物(HF)序列:5’-GAAAGAGCAACTGGCCAACG-3’,下游引物(TR)序列:5’-AAAAAAAAAAAAAAAATGCTTGAGCTGATTGCGC-3’。通過(guò)DNAMAN設(shè)計(jì)了可在T4 DNA連接酶的作用下連接成穩(wěn)定啞鈴型的發(fā)夾(CP)序列:5’-Phosphate-ATGAACAGG TCTAAAAAAAAAAAAAAACCCAACCCGCCCTA CCCTTTCCTGTTC-3’。并合成了15個(gè)T的環(huán)外引物5’-TTTTTTTTTTTTTTT-3’,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可行性。

    1.3.3 PCR條件優(yōu)化

    以沙門(mén)氏菌基因組DNA為模板,采用HF與TR通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列,獲得PCR產(chǎn)物觸發(fā)后續(xù)RCA擴(kuò)增。為確保得到大量包含15個(gè)堿基T(15T)的PCR產(chǎn)物且控制后續(xù)誘發(fā)RCA反應(yīng)的“引物”量,達(dá)到相對(duì)定量效果,本實(shí)驗(yàn)對(duì)初始引物濃度進(jìn)行優(yōu)化,設(shè)置了1、2、3、4 μmol/L的梯度變化,在相同的濃度添加量及模板濃度下,尋求最佳的引物初始濃度,最終確定PCR體系為:25 μL 2×EsMaster Mix(Dye),2 μL HF(3 μmol/L),2 μL TR(3 μmol/L),2 μL各濃度基因組DNA,ddHO補(bǔ)至50 μL。

    本實(shí)驗(yàn)在TR的5’端額外標(biāo)記了15個(gè)A堿基,目的是在PCR結(jié)束后獲得大量包含15個(gè)T的PCR產(chǎn)物。這就造成了引物對(duì)的不等長(zhǎng),從而設(shè)置了54、56、58、60、62、64 ℃退火溫度梯度優(yōu)化,最終確定PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸10 s,72 ℃延伸5 min,28個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證(140 V、40 min),后利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察分析,并按照DNA純化回收試劑盒步驟純化PCR產(chǎn)物。

    1.3.4 啞鈴環(huán)狀DNA的制備

    借助T4 DNA連接酶能封閉DNA鏈上切口的作用,將所設(shè)計(jì)的啞鈴環(huán)狀DNA發(fā)夾前體的黏性末端連接。并對(duì)發(fā)夾DNA的反應(yīng)終濃度及T4 DNA連接酶的加入量進(jìn)行優(yōu)化,保障發(fā)夾DNA連接成啞鈴環(huán)的效率。發(fā)夾DNA(10 μmol/L)終濃度梯度設(shè)置為1、0.5、0.25、0.1 μmol/L,T4 DNA連接酶(350 U/μL)用量梯度設(shè)置為0.5、1.0、1.5、2、2.5 μL。最終確定連接反應(yīng)為5 μL發(fā)夾DNA、10 μL 10×T4 DNA連接緩沖液和83 μL ddHO混合均勻后95 ℃保溫5 min后37 ℃孵育30 min,使發(fā)夾DNA變性,充分進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)。后加入2 μL T4 DNA連接酶,37 ℃孵育3 h,65 ℃滅酶10 min,所制得的連接產(chǎn)物可直接使用或-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    將連接后的啞鈴環(huán)狀DNA產(chǎn)物20 μL加入loading buffer染色后在15%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)表征(140 V,1 h),后用3×Gel Red染色液(45 mL蒸餾水,5 mL 1 mol/L的NaCl溶液,15 μL 10 000×Gel Red母液)室溫避光振蕩染色30 min。最終利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察分析。

    1.3.5 RCA擴(kuò)增及G-四鏈體熒光檢測(cè)的條件及優(yōu)化

    RCA擴(kuò)增是借助2.0 DNA聚合酶強(qiáng)烈的鏈置換能力實(shí)現(xiàn)的,為達(dá)到快速檢測(cè)的目的,對(duì)啞鈴環(huán)狀DNA用量、RCA反應(yīng)時(shí)間及溫度進(jìn)行優(yōu)化。啞鈴環(huán)狀DNA(0.5 μmol/L)的加入終濃度設(shè)置為50、100、150、200、250、300 nmol/L;反應(yīng)時(shí)間設(shè)置為20、40、60、80、100 min;反應(yīng)溫度梯度設(shè)置為56、59、62、65、68 ℃。因RCA擴(kuò)增產(chǎn)物為冗長(zhǎng)且包含富G序列的ssDNA,為判斷該產(chǎn)物是否在擴(kuò)增結(jié)束后自身形成二級(jí)結(jié)構(gòu),對(duì)ThT誘導(dǎo)折疊G-四鏈體結(jié)構(gòu)造成干擾,因此將RCA擴(kuò)增產(chǎn)物與ThT混勻后95 ℃變性5 min后4 ℃孵育5 min處理與直接室溫孵育對(duì)比,并對(duì)ThT用量及孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,將ThT(1 mmol/L)濃度梯度設(shè)置為5、10、20、30、40、50 nmol/L;孵育時(shí)間梯度設(shè)置為30、40、50、60、70 min。

    最終確定反應(yīng)條件為20 μL啞鈴環(huán)狀DNA,10 μL PCR純化產(chǎn)物,5 μL 10×2.0 DNA聚合酶緩沖液,4 μL 2.5 mmol/L dNTP Mix溶液,2.5 μL 100 mmol/L MgSO溶液,7.5 μL ddHO混合均勻后95 ℃變性5 min后4 ℃孵育5 min,加入1 μL 10×2.0 DNA聚合酶,59 ℃孵育1 h。在RCA擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1.5 μL ThT溶液,95 ℃變性5 min,4 ℃孵育5 min后室溫孵育1 h,最終將50 μL反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到狹縫比色皿中,用熒光分光光度計(jì)測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)425 nm、發(fā)射波長(zhǎng)486 nm下的熒光值,選擇最優(yōu)條件用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.3.6 基于G-四鏈體的RCA反應(yīng)可行性驗(yàn)證

    為了排除實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性和驗(yàn)證啞鈴環(huán)狀DNA的連接效果,以合成的15個(gè)T的靶標(biāo)序列為模板進(jìn)行RCA擴(kuò)增G-四鏈體的可行性驗(yàn)證。根據(jù)1.3.5節(jié)反應(yīng)條件對(duì)2 μL合成靶標(biāo)進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照,無(wú)靶標(biāo)的陰性對(duì)照,無(wú)2.0 DNA聚合酶對(duì)照和無(wú)啞鈴環(huán)狀DNA模板對(duì)照。最終測(cè)量激發(fā)波長(zhǎng)425 nm、發(fā)射波長(zhǎng)450~550 nm的熒光信號(hào),同時(shí)取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果,判定RCA反應(yīng)擴(kuò)增G-四鏈體的信號(hào)放大策略的可行性。

    1.3.7 基于G-四鏈體的PCR-RCA方法檢測(cè)沙門(mén)氏菌

    1.3.7.1 方法特異性

    對(duì)過(guò)夜培養(yǎng)的革蘭氏陰性菌(大腸埃希氏菌、志賀氏菌、銅綠假單胞菌、甲型副傷寒沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌)和革蘭氏陽(yáng)性菌(單核細(xì)胞性李斯特菌和金黃色葡萄球菌)的基因組DNA進(jìn)行提取。根據(jù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的最佳條件進(jìn)行基于G-四鏈體的PCR-RCA方法檢測(cè),測(cè)定486 nm下的熒光信號(hào),驗(yàn)證構(gòu)建方法對(duì)沙門(mén)氏菌的特異性。

    1.3.7.2 方法靈敏度

    取過(guò)夜培養(yǎng)的沙門(mén)氏菌菌液1 mL進(jìn)行基因組DNA提取,并將提取的核酸進(jìn)行梯度稀釋,測(cè)其核酸含量,按照優(yōu)化好的條件進(jìn)行基于G-四鏈體的PCR-RCA方法檢測(cè),測(cè)量發(fā)射波長(zhǎng)為450~550 nm的熒光信號(hào),并取486 nm的熒光值,判斷此方法的靈敏度。

    1.3.7.3 方法檢出限(limit of detection,LOD)

    取培養(yǎng)的沙門(mén)氏菌菌液,用0.85%的生理鹽水進(jìn)行10 倍梯度稀釋,每個(gè)稀釋度取1 mL進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。將上述各稀釋度菌液5 mL接種于45 mL滅菌牛奶中,均質(zhì)后取1 mL提取基因組DNA,對(duì)基于G-四鏈體的PCR-RCA方法進(jìn)行牛奶加標(biāo)樣品中LOD分析。根據(jù)文獻(xiàn)[28]計(jì)算方法:LOD=3/(為空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差,為校準(zhǔn)曲線的斜率),確定此方法的LOD。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    相關(guān)數(shù)據(jù)的處理及標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算采用Microsoft Excel 2010軟件,圖表的繪制采用GraphPad Prism 8軟件,并采用Adobe Photoshop CS5軟件對(duì)圖片進(jìn)行了組合排列。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PCR條件優(yōu)化

    引物與模板相互作用,在相同模板濃度下,PCR產(chǎn)物會(huì)隨著引物濃度的增加而增多,但引物濃度過(guò)大又會(huì)造成模板經(jīng)指數(shù)擴(kuò)增后的產(chǎn)物無(wú)區(qū)別,干擾后續(xù)的定量效果,因此進(jìn)行引物濃度優(yōu)化。圖1顯示,當(dāng)引物濃度達(dá)3 μmol/L后,LOD為0.17 pg/μL,且不隨著引物濃度增加而變化,因此選用引物濃度3 μmol/L用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    因TR的5’端引入15個(gè)堿基A,導(dǎo)致上下游引物不等長(zhǎng),值相差較大,因此進(jìn)行退火溫度優(yōu)化。圖1E為退火溫度依次為54、56、58、60、62、64 ℃時(shí)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果,當(dāng)退火溫度為56 ℃時(shí),產(chǎn)物較亮,且無(wú)非特異擴(kuò)增,因此選取56 ℃用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    圖1 PCR條件的優(yōu)化Fig. 1 Optimization of PCR conditions

    2.2 發(fā)夾DNA的連接及優(yōu)化

    RCA反應(yīng)的關(guān)鍵是構(gòu)建一個(gè)完整的環(huán)狀模板,而本實(shí)驗(yàn)根據(jù)G-四鏈體的反向互補(bǔ)序列及PCR擴(kuò)增3’端的15個(gè)T堿基產(chǎn)物,設(shè)計(jì)出自身可折疊成半啞鈴結(jié)構(gòu)的發(fā)夾DNA,且2個(gè)發(fā)夾DNA的黏性末端又可被T4 DNA連接酶連接成封閉的啞鈴環(huán)。圖2A~D分別是發(fā)夾DNA加入的終濃度1、0.5、0.25、0.1 μmol/L,T4 DNA連接酶添加量0.5、1、1.5、2、2.5 μL的連接產(chǎn)物。不難發(fā)現(xiàn)發(fā)夾探針濃度相對(duì)較低時(shí),整個(gè)體系的連接效率變高,但也依然存在未連接的原始探針。因此為保障連接的啞鈴環(huán)狀DNA產(chǎn)物量的相對(duì)較多,又避免未連接探針的絕對(duì)浪費(fèi),選取探針終濃度為0.5 μmol/L,T4 DNA連接酶量為2 μL的連接產(chǎn)物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    圖2 發(fā)夾DNA的連接優(yōu)化Fig. 2 Optimization of hairpin DNA ligation

    2.3 RCA擴(kuò)增及G-四鏈體熒光檢測(cè)的條件及優(yōu)化

    2.3.1 RCA反應(yīng)條件優(yōu)化

    RCA反應(yīng)是擴(kuò)增G-四鏈體從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的關(guān)鍵因素,對(duì)后續(xù)檢測(cè)的靈敏度起著重要作用,借助2.0 DNA聚合酶具有的5’→3’聚合酶活性和強(qiáng)鏈置換活性,可實(shí)現(xiàn)高效的等溫?cái)U(kuò)增。RCA反應(yīng)時(shí)間及溫度均會(huì)對(duì)2.0 DNA聚合酶的效率造成干擾,從而影響RCA擴(kuò)增的產(chǎn)物量,而啞鈴環(huán)狀DNA用量是決定擴(kuò)增產(chǎn)物多少的關(guān)鍵因素,啞鈴環(huán)較多,會(huì)造成模板浪費(fèi),反之會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的靈敏度。

    由圖3A可見(jiàn),隨著啞鈴環(huán)狀DNA濃度從50 nmol/L增加到200 nmol/L,熒光強(qiáng)度逐漸加強(qiáng)到最大,而超過(guò)200 nmol/L時(shí),可能因添加的濃度過(guò)大,導(dǎo)致非特異擴(kuò)增增強(qiáng),從而富G產(chǎn)物積累減少,熒光值降低。因此選擇啞鈴環(huán)狀DNA加入量為200 nmol/L用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。由圖3B可見(jiàn),隨著反應(yīng)時(shí)間從20 min增加到60 min,熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng),當(dāng)時(shí)間達(dá)到60 min后,熒光值幾乎不發(fā)生變化,推測(cè)此時(shí)已達(dá)到反應(yīng)最大限度,因此選擇該時(shí)間用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。由圖3C可見(jiàn),隨著溫度在56~68 ℃的變化,熒光值呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì),推測(cè)隨著溫度的升高,逐漸接近酶的最適溫度,此時(shí)反應(yīng)效率最大,但當(dāng)溫度持續(xù)上升,使聚合酶在高溫下部分失活,又環(huán)外引物受值影響互補(bǔ)配對(duì)能力下降,故熒光信號(hào)降低,因此選擇59 ℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    圖3 RCA反應(yīng)條件優(yōu)化Fig. 3 Optimization of RCA reaction conditions

    2.3.2 G-四鏈體熒光檢測(cè)條件優(yōu)化

    ThT的旋轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)致使自身熒光值低,但當(dāng)其特異性識(shí)別G-四鏈體并嵌入其中時(shí),會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào),從而達(dá)到檢測(cè)的目的。因此G-四鏈體結(jié)構(gòu)形成的多少,ThT的用量及二者相互作用的時(shí)間都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的靈敏度有較大影響。

    圖4G-四鏈體熒光檢測(cè)條件優(yōu)化Fig. 4 Optimization of fluorescence detection conditions for G-quadruplex

    圖4A為對(duì)RCA擴(kuò)增的長(zhǎng)鏈ssDNA產(chǎn)物進(jìn)行95 ℃、5 min,4 ℃、5 min處理和直接室溫孵育的檢測(cè)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)RCA產(chǎn)物與ThT經(jīng)過(guò)熱變性處理,熒光信號(hào)得到明顯提升。推測(cè)是長(zhǎng)鏈ssDNA自身折疊成二級(jí)結(jié)構(gòu),使富G序列被包裹,從而影響了ThT誘導(dǎo)G-四鏈體結(jié)構(gòu)的功能。因此,選擇熱變性處理后再進(jìn)行室溫孵育的方法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖4B為T(mén)hT終濃度由5~50 μmol/L的優(yōu)化結(jié)果,當(dāng)濃度從5~30 μmol/L時(shí),熒光值逐漸增大且達(dá)到最大,但濃度超過(guò)30 μmol/L,熒光值呈現(xiàn)降低趨勢(shì),推測(cè)是因溶解ThT粉末的溶液為50%的冰乙酸,自身pH值較低,在過(guò)酸的溶液中G-四鏈體結(jié)構(gòu)形成受到影響所致。因此,選擇30 μmol/L的ThT添加量作為后續(xù)條件。圖4C為RCA產(chǎn)物與ThT室溫孵育時(shí)間優(yōu)化結(jié)果,當(dāng)二者作用60 min時(shí),熒光信號(hào)達(dá)到最大值,且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),熒光值基本不再有大幅度的變化,因此選擇60 min孵育時(shí)間作為后續(xù)條件。

    2.4 基于G-四鏈體的RCA反應(yīng)可行性驗(yàn)證

    通過(guò)通用引物對(duì)沙門(mén)氏菌的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到3’端含有15個(gè)T的PCR產(chǎn)物,將其變性解旋后,再誘發(fā)RCA反應(yīng)和ThT熒光檢測(cè),因此15個(gè)T堿基能否引發(fā)RCA反應(yīng)是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。同時(shí)也針對(duì)RCA反應(yīng)的發(fā)生條件,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)是否存在假陽(yáng)性和啞鈴環(huán)狀DNA的連接效果,進(jìn)行了如下對(duì)照。

    圖5 基于G-四鏈體的RCA反應(yīng)可行性驗(yàn)證Fig. 5 Feasibility verification of G-quadruplex based RCA reaction

    對(duì)比瓊脂糖凝膠電泳圖(圖5A)與熒光信號(hào)(圖5B)可知,陰性對(duì)照、無(wú)2.0 DNA聚合酶對(duì)照和無(wú)啞鈴環(huán)狀DNA模板的對(duì)照反應(yīng)體系,均不能誘發(fā)RCA反應(yīng),故也不能產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào),故本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的基于G-四鏈體的RCA技術(shù)檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法具有良好的可行性。

    2.5 基于G-四鏈體的PCR-RCA方法檢測(cè)沙門(mén)氏菌的特異性

    為評(píng)價(jià)方法的特異性,對(duì)1.1節(jié)中菌株進(jìn)行基因組DNA提取,根據(jù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行基于G-四鏈體的PCR-RCA擴(kuò)增及ThT誘導(dǎo)產(chǎn)物增強(qiáng)自身熒光強(qiáng)度的檢測(cè)。在保證其他菌株的DNA濃度大于沙門(mén)氏菌DNA濃度和其他反應(yīng)條件相同情況下,驗(yàn)證構(gòu)建方法的特異性。由圖6可知,含目標(biāo)DNA的反應(yīng)體系產(chǎn)生了明顯的熒光信號(hào),而其他非目標(biāo)菌的熒光信號(hào)與空白對(duì)照相差無(wú)幾,證明基于G-四鏈體的PCR-RCA方法對(duì)沙門(mén)氏菌具有高度的特異性。

    圖6 基于G-四鏈體的PCR-RCA檢測(cè)方法的特異性Fig. 6 Specificity of G-quadruplex-based PCR-RCA detection method

    2.6 基于G-四鏈體的PCR-RCA方法檢測(cè)沙門(mén)氏菌的靈敏度

    取1 mL過(guò)夜培養(yǎng)的沙門(mén)氏菌,提取基因組DNA后進(jìn)行10 倍系列稀釋,得到1.7 fg/μL、17 fg/μL、0.17 pg/μL、1.7 pg/μL、17 pg/μL、0.17 ng/μL、1.7 ng/μL、17 ng/μL的靶標(biāo)樣品,在優(yōu)化的反應(yīng)條件下進(jìn)行基于G-四鏈體的PCR-RCA方法的檢測(cè),以確定該方法的靈敏度。由圖7A可知,在17 fg/μL~1.7 ng/μL的基因組DNA模板下,隨著靶標(biāo)質(zhì)量濃度的逐漸增加,熒光信號(hào)也呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)。且由圖7B可知,基因組DNA濃度對(duì)數(shù)與熒光信號(hào)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為=2.101+2.872 3(=0.992 5),靈敏度為17 fg/μL,說(shuō)明構(gòu)建的基于G-四鏈體的PCR-RCA檢測(cè)方法可以對(duì)沙門(mén)氏菌進(jìn)行有效的鑒別和定量檢測(cè)。

    圖7 基于G-四鏈體的PCR-RCA檢測(cè)方法的靈敏度Fig. 7 Sensitivity of G-quadruplex-based PCR-RCA detection method

    2.7 牛奶加標(biāo)樣品中基于G-四鏈體的PCR-RCA方法的LOD

    利用PCR-RCA方法擴(kuò)增G-四鏈體熒光檢測(cè)沙門(mén)氏菌的最佳條件,對(duì)沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株污染的牛奶進(jìn)行檢測(cè),其中人為污染濃度為10~10CFU/mL,通過(guò)觀察ThT誘導(dǎo)擴(kuò)增產(chǎn)物并特異性結(jié)合G-四鏈體的熒光增強(qiáng)效果及對(duì)比加標(biāo)樣品污染濃度,進(jìn)行檢測(cè)靈敏度計(jì)算。由圖8A可知,熒光信號(hào)隨著樣品污染程度的增加而增加。且由圖8B可知,在10~10CFU/mL樣品污染濃度下,其對(duì)數(shù)與熒光值呈現(xiàn)出良好的梯度變化,計(jì)算檢測(cè)限為4.48 CFU/mL。因此本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的方法在沙門(mén)氏菌實(shí)際檢測(cè)中實(shí)用性良好,在一定范圍內(nèi)可用于沙門(mén)氏菌的定量檢測(cè)。

    圖8 基于G-四鏈體的PCR-RCA方法檢測(cè)人工污染沙門(mén)氏菌的牛奶樣品Fig. 8 Detection of Salmonella in artificially contaminated milk samples by the G-quadruplex-based PCR-RCA method

    3 結(jié)論與討論

    目前,G-四鏈體偶聯(lián)RCA的方法,已實(shí)現(xiàn)單核細(xì)胞性李斯特菌、克氏桿菌屬、microRNA等的檢測(cè)。但其研究或采用較為復(fù)雜的引發(fā)RCA擴(kuò)增的手段,或設(shè)計(jì)更為復(fù)雜的環(huán)狀模板,增加了實(shí)驗(yàn)的難度。本實(shí)驗(yàn)建立的基于G-四鏈體的PCR-RCA雙重?cái)U(kuò)增檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法,特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)在于:1)借助PCR擴(kuò)增,使產(chǎn)物3’端生成的15個(gè)T堿基觸發(fā)后續(xù)實(shí)驗(yàn),既可確保引物與靶基因片段識(shí)別檢測(cè)的特異性,又可在核酸第1次擴(kuò)增時(shí)積累大量“引物”,確保實(shí)驗(yàn)的靈敏度。該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)低豐度目標(biāo)序列的初步擴(kuò)增,獲得與擴(kuò)增產(chǎn)物等量的“15T”,為后續(xù)含“15A”的頸環(huán)結(jié)構(gòu)提供RCA擴(kuò)增引物,通過(guò)誘發(fā)RCA擴(kuò)增間接完成對(duì)目標(biāo)序列的檢測(cè),也通過(guò)RCA擴(kuò)增得到巨量G-四鏈體實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的分析。因此,該方法對(duì)低豐度DNA樣品具有應(yīng)用潛力。2)以“15A”堿基為“橋梁”,可擴(kuò)展到對(duì)不同目標(biāo)核酸序列的檢測(cè)中,即只需要根據(jù)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)5’端帶“15A”的引物,無(wú)需重新設(shè)計(jì)啞鈴環(huán)狀DNA模板,就可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同目標(biāo)序列的檢測(cè),使方法具備通用性。3)設(shè)計(jì)帶有“AT”兩個(gè)堿基黏性末端的發(fā)夾結(jié)構(gòu),在T4 DNA連接酶的作用下可產(chǎn)生類似T-載體的連接效果,巧妙高效地連接成啞鈴環(huán)狀DNA模板。此方法有別于其它連接方式,不需要額外添加成環(huán)引物和核酸外切酶消化未連接的環(huán),有效減少實(shí)驗(yàn)假陽(yáng)性。4)與熒光定量PCR檢測(cè)中的熒光染料法相比,本實(shí)驗(yàn)方法可彌補(bǔ)由于嵌入核酸的熒光染料無(wú)法區(qū)分特異性產(chǎn)物與非特異產(chǎn)物造成的檢測(cè)結(jié)果誤差大的缺點(diǎn);與探針?lè)ㄏ啾?,可避免探針設(shè)計(jì)相對(duì)復(fù)雜、標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)成本高的弊端。最終利用ThT對(duì)核酸第2次擴(kuò)增產(chǎn)物中的重復(fù)富G單元特異識(shí)別,將核酸信號(hào)輔助放大為熒光信號(hào),借助熒光分光光度計(jì)即可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的精準(zhǔn)定量效果,雖然步驟上略顯繁瑣,但是其應(yīng)用范圍較熒光定量PCR更為廣泛。

    G-四鏈體作為一種高穩(wěn)定性、廣泛存在的功能核酸,以易于修飾和合成、檢測(cè)方式靈活的優(yōu)異特征,已應(yīng)用到多種核酸檢測(cè)技術(shù)中。但如何巧妙地將G-四鏈體與所檢核酸相偶聯(lián),積累大量富G序列是其關(guān)鍵。因此進(jìn)行如下改進(jìn):1)PCR擴(kuò)增的引物濃度是后續(xù)生成誘發(fā)RCA反應(yīng)的前提。通過(guò)PCR擴(kuò)增所得的RCA引物濃度高時(shí),雖然靈敏度得到顯著提高,但易掩蓋RCA引物間的濃度差,直接影響RCA富G產(chǎn)物檢測(cè)的梯度。因此,本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化選擇3 μmol/L的PCR引物,剛好能獲得最佳RCA擴(kuò)增梯度。2)與擴(kuò)增靶標(biāo)得到5’-磷酸化產(chǎn)物并經(jīng)過(guò)核酸外切酶消化和不對(duì)稱拖尾PCR (AT-PCR)獲得ssDNA產(chǎn)物觸發(fā)后續(xù)RCA反應(yīng)的方法相比,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)直接對(duì)PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行熱變性處理,使解鏈的3’端15個(gè)T堿基與啞鈴環(huán)狀DNA模板相互識(shí)別配對(duì),通過(guò)鏈替換擴(kuò)增積累大量RCA產(chǎn)物,使整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作變得便捷。3)RCA擴(kuò)增產(chǎn)物為冗長(zhǎng)的ssDNA,其自身二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)包裹大量重復(fù)的富G序列而影響G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成,因此在進(jìn)行ThT熒光信號(hào)放大檢測(cè)前,將RCA產(chǎn)物進(jìn)行熱變性及冷卻孵育處理,使富G堿基裸露,即可顯著提升檢測(cè)靈敏度。

    綜上,通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化,建立了PCRRCA雙重核酸擴(kuò)增與G-四鏈體核酸輔助檢測(cè)信號(hào)放大聯(lián)合檢測(cè)沙門(mén)氏菌的新方法,該方法有效性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、靈敏度高,借助熒光分光光度計(jì)對(duì)所檢樣品的熒光值進(jìn)行分析,即實(shí)現(xiàn)一定范圍內(nèi)的定量檢測(cè)??蓮V泛用于其他食源性致病菌的檢測(cè),通用性強(qiáng),只需改變PCR擴(kuò)增的引物,即可達(dá)到對(duì)靶物質(zhì)的測(cè)定。但相比其他信號(hào)放大技術(shù),G-四鏈體/ThT的熒光信號(hào)強(qiáng)度易受到緩沖體系中一價(jià)陽(yáng)離子濃度的影響,因此在檢測(cè)復(fù)雜樣品和低濃度樣品時(shí)存在一定的局限性。

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