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    全基因組測(cè)序和real-time PCR法檢測(cè)食源性沙門氏菌parC、gyrA基因突變特征

    2022-07-07 03:05:14畢旺來趙巍薇
    食品科學(xué) 2022年12期
    關(guān)鍵詞:喹諾酮沙門氏菌基因突變

    畢旺來,趙巍薇,馬 達(dá),李 睿,*,周 敏

    (1.武漢輕工大學(xué)生命與科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430023;2.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖北 武漢 430023)

    沙門氏菌(spp.)是主要的食源性致病菌之一,也是食品污染的常見指示菌,可通過動(dòng)物性食品、蔬菜及水果等傳播引起人類感染發(fā)病,引發(fā)腸胃炎、菌血癥和傷寒等疾病。據(jù)報(bào)道,全球每年有超過1億 人感染沙門氏菌,其中大多數(shù)人會(huì)在短期內(nèi)自行恢復(fù),但也有大約15萬感染者死亡。我國(guó)的細(xì)菌性食物中毒有70%~80%是由沙門氏菌引起,抵抗力低下的人群,老年、嬰幼兒尤其容易感染。沙門氏菌造成的食品安全問題在我國(guó)很常見。在不發(fā)達(dá)地區(qū)或者農(nóng)村地區(qū),由于當(dāng)?shù)厝嗣裥l(wèi)生意識(shí)差,由聚餐引發(fā)的沙門氏菌食物中毒事件屢見報(bào)端。

    除此之外,沙門氏菌的耐藥現(xiàn)象也很嚴(yán)重。近年來,全國(guó)各地屢屢從雞蛋、水產(chǎn)品、禽肉制品等食物中分離到多重耐藥沙門氏菌,對(duì)食品安全防控造成了嚴(yán)重威脅。沙門氏菌耐藥機(jī)制復(fù)雜,主要涉及滅活酶及鈍化酶的產(chǎn)生、基因突變、細(xì)菌主動(dòng)外排作用、可移動(dòng)基因元件介導(dǎo)和生物膜的形成等,這些機(jī)制相互作用共同決定沙門氏菌的耐藥水平。由于抗生素濫用、細(xì)菌耐藥基因水平傳播等原因,加劇了食品中耐藥性致病菌的潛在風(fēng)險(xiǎn)。2020年11月20日,多個(gè)聯(lián)合國(guó)機(jī)構(gòu)共同宣布成立一體化衛(wèi)生抗微生物藥物耐藥性領(lǐng)導(dǎo)人小組,以促進(jìn)全球重視并采取行動(dòng),避免微生物耐藥性造成的災(zāi)難性后果。

    喹諾酮類藥物是人畜通用的抗生素,包括第1代藥物萘啶酸,第3代藥物環(huán)丙沙星,第4代藥物莫西沙星等。喹諾酮類耐藥主要由喹諾酮耐藥決定區(qū)(quinolone resistance-determining region,QRDR)基因突變導(dǎo)致。喹諾酮類藥物的作用靶位為DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV,前者由2個(gè)GyrA亞基和2個(gè)GyrB亞基組成,分別由和基因編碼;后者由2個(gè)ParC亞基和2個(gè)ParE亞基組成,分別由和基因編碼。DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的QRDR發(fā)生氨基酸突變可引起酶的結(jié)構(gòu)與功能改變,影響喹諾酮類藥物與靶位的結(jié)合,降低細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物的敏感性,從而導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)。此外質(zhì)粒上的喹諾酮類耐藥(plasmid mediated quinolone resistance,PMQR)基因也可介導(dǎo)喹諾酮類耐藥,PMQR基因主要是編碼Qnr蛋白的基因。

    鑒于細(xì)菌耐藥性日趨嚴(yán)重的現(xiàn)實(shí),查明喹諾酮類耐藥株QRDR和PMQR狀況,有助于更好地了解沙門氏菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播途徑,為預(yù)防和控制沙門氏菌提供理論依據(jù)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)耐藥基因突變的研究還是以基因測(cè)序?yàn)橹鳎馁M(fèi)大、時(shí)間長(zhǎng)?;谝陨媳尘埃緦?shí)驗(yàn)篩查食源性沙門氏菌喹諾酮類耐藥株P(guān)MQR分布狀況,并設(shè)計(jì)一種real-time PCR方法,結(jié)合全基因組測(cè)序方法對(duì)QRDR突變進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)和測(cè)序驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為耐藥基因突變位點(diǎn)篩查提供新的準(zhǔn)確快捷的檢測(cè)方法。

    1 材料與方法

    1.1 菌株與試劑

    大腸桿菌()ATCC25922、沙門氏菌()ATCC14028,神農(nóng)架林區(qū)檢驗(yàn)檢測(cè)中心提供。120 株待檢食源性沙門氏菌分離株2017—2020年間分離獲得,其中92 株分離自江西南昌市冰凍禽肉制品,28 株分離自神農(nóng)架林區(qū)冰凍禽肉制品。

    細(xì)菌基因組提取試劑盒(TIANamp bacteria DNA Kit離心柱型) 天根生化科技有限公司;Gold view核酸染料 北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司;2×realtime PCR Mix 武漢楚誠(chéng)正茂生物工程有限公司;PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA Marker 2000、TaKaRa試劑盒寶生物(大連)有限公司;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.2 儀器與設(shè)備

    DYY-10C電泳儀 北京六一儀器廠;恒溫培養(yǎng)箱上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;梯度PCR儀 德國(guó)Biometra公司;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;ABI7500型熒光定量PCR儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;GBox-HR-E-M凝膠圖像系統(tǒng) 英國(guó)Syngene公司。

    1.3 方法

    1.3.1 藥敏實(shí)驗(yàn)

    采用藥敏紙片擴(kuò)散法(K-B法)測(cè)定細(xì)菌藥物敏感性,參考2018年臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)的《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行。即用無菌棉拭子蘸取菌液,涂布MH平板表面。用無菌鑷子將萘啶酸(5 μg/片)、環(huán)丙沙星(5 μg/片)藥敏紙片貼在瓊脂表面。紙片貼完15 min內(nèi),將平板倒置于37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)16~18 h。測(cè)量各個(gè)藥敏紙片的抑菌圈直徑。用大腸桿菌ATCC25922作質(zhì)控株同步做質(zhì)量控制。將各抗生素藥敏紙片的抑菌圈直徑與CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對(duì),報(bào)告待測(cè)細(xì)菌對(duì)該抗生素是否敏感(S)、中介(I)或耐藥(R)。

    1.3.2 全基因組二代測(cè)序

    選取4 株南昌來源食源性沙門氏菌,菌株編號(hào)為3、4、31、62。將菌液制備成甘油管送上海美吉生物公司,采用Illumina HiSeq X-10平臺(tái)進(jìn)行二代測(cè)序、序列組裝和基因功能注釋。對(duì)4 株菌耐藥基因進(jìn)行深入挖掘。采用抗生素耐藥基因數(shù)據(jù)庫(http://arpcard.Mcmaster.ca,Version 1.1.3)和Resfinder 4.1(https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)對(duì)耐藥基因進(jìn)行搜索預(yù)測(cè)。

    1.3.3 細(xì)菌核酸提取

    將細(xì)菌用LB培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)過夜,用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取DNA。提取的DNA利用超微量分光光度儀測(cè)定DNA的含量,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.4基因PCR篩查

    PCR擴(kuò)增檢測(cè)、、,引物參照文獻(xiàn)[17]合成,序列見表1。PCR擴(kuò)增體系(25 μL)為:DNA模板1 μL,上游引物和下游引物(10 μmol/L)各1 μL,TaKaRa r酶0.15 μL,10×Buffer 2.5 μL,dNTPMix(2.5 mmol/L)2 μL,ddHO補(bǔ)足總反應(yīng)體系到25 μL。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s,預(yù)定溫度退火45 s,72 ℃延伸1 min,32個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。其中、退火溫度為53 ℃,退火溫度為55 ℃。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察產(chǎn)物片段大小進(jìn)行驗(yàn)證。基因產(chǎn)物大小516 bp;基因產(chǎn)物大小417 bp;基因產(chǎn)物大小469 bp。

    表1 qnr基因PCR檢測(cè)引物Table 1 PCR primers for qnr gene

    1.3.5 real-time PCR引物設(shè)計(jì)

    將4 株測(cè)序的沙門氏菌進(jìn)行序列組裝后,分析、基因序列及基因突變位點(diǎn)的信息,食源性沙門氏菌包含有4個(gè)常見的突變位點(diǎn),分別為Asp87Tyr,核苷酸GAC→TAC;Asp87Asn,核苷酸GAC→AAC;Thr57Ser,核苷酸ACC→AGC;Ser80Ile,核苷酸AGC→ATC。使用在線軟件對(duì)4個(gè)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物(http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/primer1.Html)。上游引物3’末端為待檢驗(yàn)的突變位點(diǎn),用下劃線標(biāo)識(shí)。為提高引物特異性,在上游序列靠近3’末端人為引進(jìn)堿基錯(cuò)配,以減少引物和模板間形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能值。堿基錯(cuò)配也用下劃線標(biāo)識(shí)。引物序列見表2。

    表2 基因突變位點(diǎn)real-time PCR檢測(cè)引物Table 2 Real-time PCR primers for mutation sites

    1.3.6 real-time PCR擴(kuò)增

    對(duì)提取得到的沙門氏菌基因組DNA分別進(jìn)行Asp87Tyr、Asp87Asn、Thr57Ser和Ser80Ile四個(gè)位點(diǎn)real-time PCR擴(kuò)增篩查,以不含以上突變位點(diǎn)ATCC14028菌株作為陰性對(duì)照,以含有上述突變位點(diǎn)的測(cè)序菌株作為陽性對(duì)照。擴(kuò)增結(jié)束后查看熔解曲線和擴(kuò)增曲線。預(yù)實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察產(chǎn)物片段大小。根據(jù)4個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)的real-time PCR引物見表2。

    PCR體系(25 μL):DNA模板1 μL、上游引物和下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL、2×SYBR Green realtime PCR Mix 12.5 μL、ddHO 10.5 μL。PCR擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性10 s,預(yù)定溫度退火15 s,72 ℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán)。Asp87Tyr位點(diǎn)檢測(cè)的退火溫度為56.2 ℃,Asp87Asn位點(diǎn)檢測(cè)的退火溫度為55.5 ℃,Thr57Ser位點(diǎn)檢測(cè)的退火溫度為61.6 ℃,Ser80Ile位點(diǎn)檢測(cè)的退火溫度為56.8 ℃。

    1.3.7 QRDR位點(diǎn)的測(cè)序驗(yàn)證

    將待驗(yàn)證的10 株沙門氏菌分別進(jìn)行、基因全長(zhǎng)擴(kuò)增,上游引物為CGCCTACTTAAACTACTCCA,下游引物為GCCGACCACCTTCTGTA;上游引物為TGCCCGTGTCGTTGGT,下游引物為GTCGCACGAGACTTGG。

    PCR擴(kuò)增體系(25 μL)為:DNA模板1 μL,上游引物和下游引物(10 μmol/L)各1 μL,TaKaRa r酶0.1 μL,10×Buffer 2.5 μL,dNTPMix(2.5 mmol/L)2 μL,ddHO 17.4 μL。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,52 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,32個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化,送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序驗(yàn)證QRDR位點(diǎn)。將測(cè)序原始數(shù)據(jù)采用DNASTAR軟件進(jìn)行拼接,查找并驗(yàn)證real-time PCR檢測(cè)出來的QRDR位點(diǎn)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 喹諾酮類藥物敏感性實(shí)驗(yàn)和qnr基因篩查

    藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),120 株食源性沙門氏菌分離株有45 株菌耐喹諾酮類抗生素萘啶酸,其中11 株來源于神農(nóng)架,34 株來源于江西南昌。3 株神農(nóng)架株、8 株南昌株同時(shí)耐環(huán)丙沙星,環(huán)丙沙星耐藥率分別為10.7%(3/28)、8.7%(8/92)。神農(nóng)架株對(duì)喹諾酮類藥物耐藥率為39.3%(11/28),南昌株對(duì)喹諾酮類藥物耐藥率為37%(34/92)。兩地菌株喹諾酮類藥物耐藥率非常接近。

    將4 株南昌株送樣進(jìn)行二代測(cè)序,序列組裝、基因功能注釋后進(jìn)行耐藥基因檢測(cè),結(jié)果僅4號(hào)菌株檢出攜帶基因,未檢出其他亞型。以余下的41 株喹諾酮耐藥沙門氏菌為研究對(duì)象,PCR篩查喹諾酮耐藥基因、、。圖1、2為部分沙門氏菌DNA提取和基因檢測(cè)PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果。南昌株有8 株P(guān)CR檢出耐藥基因,檢出率為23.5%(8/34);神農(nóng)架株有6 株檢出耐藥基因,檢出率為54.4%(6/11)。而、耐藥基因檢出率均為0%。

    圖1 沙門氏菌總DNA電泳結(jié)果Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total DNA extracted from Salmonella isolates

    圖2 qnrS基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 PCR amplification products of qnrS gene

    2.2 real-time PCR擴(kuò)增檢測(cè)gyrA和parC基因突變

    對(duì)本課題組測(cè)序的4 株南昌株進(jìn)行QRDR位點(diǎn)分析。通過與Resfinder數(shù)據(jù)庫比對(duì),發(fā)現(xiàn)4 株沙門氏菌和沒有突變位點(diǎn),但和基因均有數(shù)個(gè)QRDR突變位點(diǎn)。其中有4個(gè)突變位點(diǎn)是文獻(xiàn)常報(bào)道的QRDR位點(diǎn)。除了測(cè)序的3號(hào)菌不含有上述4個(gè)QRDR位點(diǎn),4號(hào)菌攜帶Thr57Ser突變,31號(hào)菌攜帶Asp87Tyr突變,62號(hào)菌同時(shí)攜帶Thr57Ser+Ser80Ile+Asp87Asn突變。

    根據(jù)這4個(gè)QRDR位點(diǎn)設(shè)計(jì)real-time PCR檢測(cè)引物。經(jīng)過PCR篩查,45 株耐喹諾酮的沙門氏菌中有31 株未檢出基因,推斷這些菌株和基因應(yīng)存在QRDR位點(diǎn)突變,從而導(dǎo)致喹諾酮耐藥。因此對(duì)這31 株菌采用real-time PCR法檢測(cè)和基因QRDR位點(diǎn)。

    real-time PCR檢測(cè)的熔解曲線圖和擴(kuò)增曲線見圖3~6。樣品熔解曲線均形成單一峰,說明無非特異性擴(kuò)增。樣品real-time PCR擴(kuò)增Ct值在16~28之間,擴(kuò)增效率良好。陰性對(duì)照Ct值大于35,說明real-time PCR無污染,無假陽性。二代測(cè)序的4 株菌進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)后,根據(jù)測(cè)序所得和基因QRDR位點(diǎn),與realtime PCR結(jié)果進(jìn)行分析比對(duì),結(jié)果表明這4個(gè)菌real-time PCR擴(kuò)增結(jié)果和測(cè)序結(jié)果吻合,說明real-time PCR特異性良好。

    圖3 real-time PCR檢測(cè)parC Thr57Ser突變位點(diǎn)Fig. 3 Real-time PCR detection of parC Thr57Ser

    圖4 real-time PCR檢測(cè)parC Ser80Ile突變位點(diǎn)Fig. 4 Real-time PCR detection of parC Ser80Ile

    圖5 real-time PCR檢測(cè)gyrA Asp87Asn突變位點(diǎn)Fig. 5 Real-time PCR detection of gyrA Asp87Asn

    圖6 real-time PCR檢測(cè)gyrA Asp87Tyr突變位點(diǎn)Fig. 6 Real-time PCR detection of gyrA Asp87Tyr

    表3 31 株沙門氏菌基因突變位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果Table 3 Gene mutation sites of 31 Salmonella isolates

    如表3所示,31 株沙門氏菌除2 株未檢出QRDR突變外,其他菌株均有檢出。其中Thr57Ser+Asp87Asn型突變最常見,菌株檢出數(shù)目最多。

    為進(jìn)一步驗(yàn)證real-time PCR的準(zhǔn)確性,挑選10 株real-time PCR陽性菌株分別擴(kuò)增和全長(zhǎng),純化后送生物公司雙向測(cè)序。部分PCR產(chǎn)物如圖7所示。將測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接比對(duì),找尋和基因突變位點(diǎn),測(cè)序結(jié)果與real-time PCR結(jié)果高度吻合,進(jìn)一步證實(shí)了realtime PCR的可靠性。

    圖7 parC、gyrA基因全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 7 PCR amplification of the complete sequences of parC and gyrA

    3 討 論

    沙門氏菌耐藥日益嚴(yán)重,相對(duì)于其他抗生素類藥物,沙門氏菌對(duì)喹諾酮類藥物敏感性相對(duì)較高。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)因此喹諾酮類三代藥物如環(huán)丙沙星仍是沙門氏菌感染治療的推薦藥物之一。

    沙門氏菌對(duì)喹諾酮類耐藥主要由QRDR突變和PMQR介導(dǎo)引起。目前基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)的檢測(cè)方法可以分為兩類:一類是以單鏈構(gòu)象多態(tài)性、等位基因特異性PCR等為代表的以凝膠電泳為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)方法。另一類是以直接測(cè)序、變性高效液相色譜、高分辨率溶解曲線等為代表的高通量檢測(cè)方法。近年來部分學(xué)者研發(fā)了一些篩查QRDR突變的新技術(shù),比如單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、變性高效液相色譜、高分辨率溶解曲線法等。這些技術(shù)操作要求高,費(fèi)用高,而且主要是檢測(cè)已知的基因突變位點(diǎn)。目前多數(shù)文章研究QRDR突變采取的還是基于測(cè)序的方法。Takashi等采取Illumina平臺(tái)二代測(cè)序方式研究了107 株傷寒沙門氏菌QRDR突變,識(shí)別出2 461個(gè)SNP位點(diǎn)。其中高耐藥菌含有3個(gè)QRDR突變,Ser83Phe、Asp87Asn和Ser80Ile。游興勇等采取二代全基因組測(cè)序分析了2018年江西省臨床分離的58 株非傷寒沙門菌,這些菌存在不同程度的QRDR突變。其中突變率最高(31.03%,18/58),且全部是Thr57Ser突變,其次是(27.59%,16/58)突變,最常見的有Asp87Asn(4 株)和Asp87Tyr(8 株)突變。葛琨等采取測(cè)序的方法研究了30 株烏魯木齊牛羊肉源沙門氏菌QRDR基因突變狀況,發(fā)現(xiàn)14 株沙門氏菌發(fā)生Ser83Phe基因突變,25 株發(fā)生了Thr57Ser基因突變。劉貴深等發(fā)現(xiàn)16 株耐環(huán)丙沙星沙門氏菌常見突變類型是Ser83Phe和Asp87Gly變異,同時(shí)伴隨Ser80Arg變異。

    以上文獻(xiàn)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)有很多相似之處,也有不同之處,比如發(fā)現(xiàn)2 株南昌株攜帶了Ser80Ile突變。游興勇等研究的58 株南昌臨床株均未發(fā)現(xiàn)該突變。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Thr57Ser和Asp87Asn很常見,南昌株有22 株發(fā)生Thr57Ser突變,15 株發(fā)生Asp87Asn突變,這個(gè)結(jié)果和游興勇等的研究相似。在本實(shí)驗(yàn)中,120 株沙門氏菌中有45 株對(duì)萘啶酸耐藥,其中僅14 株菌檢出基因。所有沙門氏菌均未檢出、兩種亞型。游興勇等發(fā)現(xiàn)58 株江西來源臨床株P(guān)MQR基因攜帶率最高為(29.31%,17/58),有3 株菌檢出(5.17%,3/58)。這一結(jié)果和本實(shí)驗(yàn)不同。沙門氏菌耐藥狀況復(fù)雜,因此耐藥株來源、分離時(shí)間、樣本數(shù)量等,都會(huì)對(duì)研究結(jié)果造成一定影響。

    本實(shí)驗(yàn)沒有對(duì)陽性的菌株進(jìn)行real-time PCR檢測(cè),有的文獻(xiàn)報(bào)道部分沙門氏菌菌株同時(shí)具有QRDR和PMQR,如果加上這部分菌株,發(fā)生QRDR突變的菌株檢出率會(huì)更高。此外QRDR突變比較復(fù)雜多樣,比如經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)3號(hào)菌株雖然沒有Asp87Tyr、Asp87Asn、Thr57Ser和Ser80Ile這4個(gè)文獻(xiàn)常報(bào)道的QRDR突變,但具有Thr748Met、Thr255Ser、Asn395Ser、Ala620Thr和Ser469Ala突變。這些突變是否能影響菌株對(duì)喹諾酮藥物的敏感性尚需驗(yàn)證。

    在耐藥機(jī)制研究上全基因組測(cè)序具有較大的優(yōu)勢(shì),可識(shí)別新的耐藥基因及其突變。但單純采用全基因組測(cè)序的方法跟蹤研究耐藥基因費(fèi)用昂貴、時(shí)間長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)建立了一種real-time PCR的方法檢測(cè)QRDR突變。對(duì)31個(gè)無PMQR的喹諾酮耐藥株篩查Asp87Tyr、Asp87Asn、Thr57Ser和Ser80Ile這4個(gè)文獻(xiàn)常報(bào)道的QRDR突變,采取已經(jīng)二代測(cè)序的4 株菌作為對(duì)照,并隨機(jī)挑選有real-time PCR陽性產(chǎn)物的10個(gè)菌擴(kuò)增基因和基因全長(zhǎng),結(jié)果這14個(gè)菌的realtime PCR結(jié)果和測(cè)序結(jié)果完全吻合。說明本實(shí)驗(yàn)建立的real-time PCR方法特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠。采取本實(shí)驗(yàn)的引物設(shè)計(jì)思路還可以建立篩查其他各種耐藥基因突變的real-time PCR方法。采用全基因組測(cè)序和real-time PCR聯(lián)用的方法既可以發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因及其突變,又可以篩查大量的樣本,成本低、耗時(shí)短。

    沙門氏菌耐藥機(jī)制復(fù)雜,目前全球處于新冠后疫情時(shí)代,各地大規(guī)模消毒可能會(huì)誘導(dǎo)環(huán)境中細(xì)菌產(chǎn)生新的耐藥性。因此對(duì)環(huán)境-食品-人這一鏈條上細(xì)菌耐藥性變化的監(jiān)控力度應(yīng)該加大。全基因組測(cè)序結(jié)合realtime PCR檢測(cè),可應(yīng)用于跟蹤細(xì)菌耐藥基因突變的研究,更快的識(shí)別新出現(xiàn)的耐藥危害,有助于及時(shí)制定公共衛(wèi)生的風(fēng)險(xiǎn)控制策略。

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