MSI檢測(cè)在胃癌治療中的研究進(jìn)展

胃癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，是世界上排名第五的癌癥和第三大癌癥死亡原因，給患者及家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)

。由于胃癌無(wú)特異性癥狀，大多數(shù)患者就診時(shí)已處于晚期。近些年來(lái)，基礎(chǔ)科學(xué)和臨床研究的進(jìn)步清楚地表明，胃癌的診斷不再僅僅依靠組織學(xué)診斷，分子技術(shù)水平的提高使越來(lái)越多的患者受益于分子診斷

。2020版CSCO胃癌診療指南已將胃癌組織中評(píng)估微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability, MSI/錯(cuò)配修復(fù)缺陷(deficient mismatch repair, dMMR)狀態(tài)“Ⅱ級(jí)推薦(ⅠB類證據(jù))”改為“Ⅰ級(jí)推薦(ⅠB類證據(jù))”，同時(shí)高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability-high, MSI-H)/dMMR是晚期胃癌免疫檢查點(diǎn)抑制劑有效治療的預(yù)測(cè)標(biāo)志物，對(duì)晚期胃癌患者的治療和預(yù)后具有指導(dǎo)作用

。

從浙江經(jīng)驗(yàn)走向全國(guó)，“最多跑一次”改革書寫了深化放管服改革的新篇章，邁入“互聯(lián)網(wǎng)+政務(wù)服務(wù)”發(fā)展的新階段。

1 微衛(wèi)星(microsatellites，MS)概述

MS，又稱為簡(jiǎn)單重復(fù)序列，是具有1～10個(gè)核苷酸重復(fù)序列的DNA鏈，在人類基因中分布廣泛。這些重復(fù)序列非常不穩(wěn)定，比基因組中的其他序列突變頻率更高，其突變率每代10

～10

不等

。錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair，MMR)系統(tǒng)是一種DNA完整性維護(hù)系統(tǒng)，MMR基因的體細(xì)胞或胚系表觀/遺傳改變會(huì)導(dǎo)致DNA MMR功能喪失，引起基因組中大量突變的積累，從而產(chǎn)生一種被稱為MSI的分子表型。因?yàn)橥ㄟ^免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)識(shí)別的dMMR狀態(tài)和通過PCR識(shí)別的MSI-H狀態(tài)通常90%以上是一致的，所以術(shù)語(yǔ)dMMR與MSI-H可互換使用

。MMR系統(tǒng)由至少7種蛋白質(zhì)組成，分別是h-MLH1、h-MLH3、h-MSH2、h-MSH3、h-MSH6、h-PMS1和h-PMS2，它們與特定的伙伴結(jié)合形成功能性異源二聚體，識(shí)別DNA復(fù)制過程中發(fā)生的堿基對(duì)錯(cuò)配和小核苷酸插入/缺失(1～4個(gè)堿基對(duì))

。這些蛋白與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，研究

表明，hMLH1基因啟動(dòng)子的過甲基化和hMSH2基因編碼區(qū)的突變與胃癌的發(fā)生相關(guān)。hMSH6突變?cè)谧訉m內(nèi)膜癌的發(fā)生中起重要作用，與結(jié)直腸癌有很大不同的是，子宮內(nèi)膜癌患者中hMSH6的突變較hMLH1和hMSH2的突變更常見

。MLH3基因位于14號(hào)染色體q24.3位點(diǎn)，在PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，在人類MLH3中有15個(gè)SNP被引用，其中SNP rs1650697與散發(fā)性大腸癌和MSI顯著相關(guān)。rs175080對(duì)肝細(xì)胞癌、肺癌和宮頸癌有不良影響，與胃癌的關(guān)系尚未見報(bào)道

。MLH3基因是否有望成為MSI檢測(cè)的新的生物標(biāo)志物，值得深入研究。組蛋白H3賴氨酸36位三甲基化(H3K36me3)是一個(gè)重要的組蛋白標(biāo)志，參與轉(zhuǎn)錄延伸和DNA MMR。研究

表明，在正常情況下，依賴于H3K36me3的MMR優(yōu)先保護(hù)活躍轉(zhuǎn)錄的抑癌基因，以避免發(fā)生突變。組蛋白H3K36me3可通過與MSH6直接作用招募hMutSα，進(jìn)而調(diào)控MMR功能，當(dāng)細(xì)胞缺少H3K36me3等調(diào)控MMR功能的蛋白時(shí)表現(xiàn)為MSI-H。這對(duì)后續(xù)的研究有所啟發(fā)，可以通過全基因組測(cè)序分析H3K36me3并發(fā)現(xiàn)其富集區(qū)域，識(shí)別MSI-H的患者并提早進(jìn)行干預(yù)，以達(dá)到較好的治療效果。如果僅僅依靠H3K36me3來(lái)確定MSI-H，似乎并不全面，是否可以與其他生物標(biāo)志物共同確定MSI-H，還需要大量相關(guān)實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。

2 MSI檢測(cè)方法

目前MSI的檢測(cè)方法主要有IHC、PCR、二代測(cè)序(next generation sequencing，NGS)，最近，通過循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，CtDNA)識(shí)別MSI的方法也在進(jìn)行中。不同類型的標(biāo)本和變異需要選擇不同的檢測(cè)方法，檢測(cè)位點(diǎn)的選擇是MSI診斷中極為重要的因素，影響MSI診斷的準(zhǔn)確性和靈敏度等。IHC分析MMR蛋白表達(dá)是檢測(cè)MSI/MMR系統(tǒng)狀態(tài)的常用方法，這種方法對(duì)MMR基因產(chǎn)物丟失(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)進(jìn)行分析可以指導(dǎo)特定基因胚系突變的DNA測(cè)序以診斷Lynch綜合征。標(biāo)準(zhǔn)化MMR判讀與病理報(bào)告可根據(jù)不同醫(yī)院的病理報(bào)告格式不同而不同。若4個(gè)蛋白中任意一個(gè)或多個(gè)陰性(細(xì)胞核不著色)時(shí)，則病理報(bào)告為dMMR，相當(dāng)于MSI-H；若4個(gè)蛋白均表達(dá)正常，則判讀為錯(cuò)配修復(fù)表達(dá)完整(proficient mismatch repair，pMMR)，相當(dāng)于MSI-L或微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellite stability，MSS)

。PCR法是MSI檢測(cè)的另一種方法，旨在比較來(lái)自同一個(gè)體的正常組織和腫瘤之間的一組MS標(biāo)記，以識(shí)別MSI-H的腫瘤。這種分析方法可以在新鮮的、冰凍的或石蠟包埋的腫瘤組織上進(jìn)行

。美國(guó)國(guó)家癌癥研究院公布了腫瘤中檢測(cè)MSI的5個(gè)位點(diǎn)，其中至少2個(gè)位點(diǎn)發(fā)生改變時(shí)稱MSI-H，僅有1個(gè)位點(diǎn)改變時(shí)稱MSI-L，未出現(xiàn)位點(diǎn)改變時(shí)稱MSS

?；赑CR的MSI檢測(cè)與IHC檢測(cè)MMR蛋白高度一致，靈敏度>90%，特異度很高

。近年來(lái)，NGS技術(shù)逐漸發(fā)展和成熟，不同NGS平臺(tái)的腫瘤基因組測(cè)序被證明能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)MSI狀態(tài)，與基于PCR的MSI測(cè)試的符合率達(dá)到95%

。NGS法與傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)相比更具優(yōu)勢(shì)，為實(shí)現(xiàn)單瘤種的所有基因變異及泛瘤種的熱點(diǎn)基因變異進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)成為可能

。但是，由于成本和周轉(zhuǎn)時(shí)間的限制，使得基于NGS的MSI檢測(cè)方法未能在臨床實(shí)踐中常規(guī)使用。

3 MSI在胃癌中的表達(dá)

2021年NCCN指南推薦所有新確診的胃癌患者常規(guī)完成MSI檢測(cè)

。研究表明，有15%～30%的胃癌病例中會(huì)發(fā)生MSI，MSI胃癌可以發(fā)生在遺傳綜合征的背景下，如Lynch綜合征，但大多數(shù)是零星發(fā)生的，只有10%表現(xiàn)出家族聚集性

。Latham等

采用靶向NGS方法確定MSI狀態(tài)，根據(jù)MSI狀態(tài)來(lái)確定Lynch綜合征在實(shí)體腫瘤中的患病率，同時(shí)還可忽略腫瘤類型、家族遺傳史等因素，來(lái)評(píng)估MSI-H/MMR-D患者Lynch綜合征的胚系基因。目前盡管對(duì)患MSI-H胃癌的相關(guān)危險(xiǎn)因素有較多的研究證實(shí)，但其在全球的發(fā)病率差異仍然較大。有研究

認(rèn)為，這可能是由于MSI與地域因素有關(guān)，最終導(dǎo)致不同地域可能呈現(xiàn)出不同的組織學(xué)特征。

MSI與結(jié)腸癌患者的生存率提高有關(guān)，并可能預(yù)示在Ⅱ期疾病中缺乏輔助化療的益處。因此，建議對(duì)切除的結(jié)直腸癌患者通過ICH或MSI來(lái)評(píng)估dMMR，以指導(dǎo)治療決定和篩查L(zhǎng)ynch綜合征

。結(jié)直腸癌中，更近端、低分化和黏液性以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較少的腫瘤，預(yù)后較好。然而，胃癌患者的生存期與MSI之間的關(guān)系尚未確定。一薈萃研究認(rèn)為，MSI-H型較MSS型胃癌患者的總生存期更長(zhǎng)，有著更佳的預(yù)后

。但存在異質(zhì)性，造成這種異質(zhì)性的潛在原因可能是流行病學(xué)的改變或化療的效果

。Yang等

在來(lái)自癌癥基因組圖譜和亞洲隊(duì)列GSE62254的樣本中定義了胃腺癌亞型，將MSI-H STAD樣本基本上分為兩個(gè)亞組(MSI-H1和MSI-H2)。進(jìn)一步的免疫圖譜檢查顯示，MSI-H1亞組預(yù)后比MSI-H2亞組差，可能與抑制性免疫受體和趨化因子的富集有關(guān)。在MSI-H2亞群中，氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)、過氧化物酶體等代謝途徑被增強(qiáng)，OXPHOS上調(diào)，可能使其對(duì)OXPHOS敏感，靶向OXPHOS的抑制劑有可能成為一種有前途的抗癌療法。

MSI亞型胃癌是帕博麗珠單抗用藥指征。MSI型胃癌中，錯(cuò)配修復(fù)基因的突變導(dǎo)致了腫瘤組織總體突變負(fù)荷高，且常常伴隨著有絲分裂通路的激活。研究

顯示，MSI型胃癌具有較高水平的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，提示MSI型胃癌相對(duì)良好的預(yù)后可能與機(jī)體免疫相關(guān)。另一方面，研究證實(shí)PD-1/PD-L1及CTLA-4等免疫檢查點(diǎn)抑制劑在高突變負(fù)荷的腫瘤如惡性黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌中更容易取得好的療效，而低頻至中頻突變負(fù)荷的腫瘤往往對(duì)其不敏感

。目前，由腫瘤基因突變產(chǎn)生的新抗原已被證實(shí)是成功免疫治療的主要作用靶點(diǎn)，與良好的臨床免疫治療療效密切相關(guān)

。MSI型胃癌因其高突變負(fù)荷、高新抗原頻率的特征，有望成為包括免疫檢查點(diǎn)在內(nèi)的臨床免疫治療潛在的獲益群體

。與之相對(duì)應(yīng)的是，早在被FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于胃癌之前，免疫檢查點(diǎn)抑制劑PD-1單抗已于同年5月被批準(zhǔn)用于多種實(shí)體瘤MSI亞型的治療

。

4 MSI與胃癌TCGA和ACRG分型

考慮試件加載經(jīng)歷的4個(gè)受力階段，將節(jié)點(diǎn)骨架曲線簡(jiǎn)化為考慮剛度退化的四段折線模型。骨架曲線各特征點(diǎn)分別為開裂點(diǎn)A(Pc, Δc)；屈服荷載點(diǎn)B(Py, Δy)；峰值荷載點(diǎn)C(Pmax,Δmax)；極限荷載點(diǎn)D(Pu, Δu)。其中屈服荷載點(diǎn)B采用“通用屈服彎矩法”求得，極限荷載點(diǎn)D取峰值荷載的85%。由于各試件骨架曲線存在一定差異性，首先對(duì)各試件骨架曲線進(jìn)行無(wú)量綱化處理，如圖7所示，+Pmax和+Δmax分別表示節(jié)點(diǎn)正向加載的峰值荷載及其對(duì)應(yīng)的位移，-Pmax和-Δmax分別表示節(jié)點(diǎn)負(fù)向加載的峰值荷載及其對(duì)應(yīng)的位移。

目前，已發(fā)現(xiàn)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)通路的成員在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)生突變和激活，與TCGA中對(duì)于MSI-H胃癌突變分析的研究

一致。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，12例胃癌中有3例出現(xiàn)了編碼PI3K的p110α催化亞基的PIK3CA基因突變，其中有80%聚集在涉及螺旋和激酶結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)區(qū)域內(nèi)。對(duì)其中一個(gè)“熱點(diǎn)”突變體的體外研究表明，它是一種激活突變

。有一項(xiàng)研究通過直接測(cè)序的方法在94例胃癌患者中篩查PIK3CA突變情況，其中80%的已知PIK3CA突變發(fā)生在基因區(qū)域。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4例(4.3%)PIK3CA突變，在這4例中，3例腫瘤表現(xiàn)為MSI，2例腫瘤同時(shí)存在KRAS突變。從而得出結(jié)論：胃癌中PI3K信號(hào)通路的激活可能是通過PIK3CA的上調(diào)或突變實(shí)現(xiàn)的，后者可能是dMMR的結(jié)果

。為了更好地了解分子胃癌實(shí)體可能有助于該腫瘤的個(gè)體化治療，一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)對(duì)胃癌患者PIK3CA突變的臨床和病理資料進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)PIK3CA突變患者存在MSI(

<0.001)。攜帶PIK3CA突變的和未突變的MS感染患者的5年生存率分別為40%和70.4%(

=0.309)。外顯子9突變患者的5年生存率為0，外顯子20突變患者的5年生存率為80%(

=0.031)。由此得出，胃癌中PIK3CA突變與MSI分子亞群密切相關(guān)，比其他MSI患者預(yù)后更差。外顯子9的突變與外顯子20的突變相比，導(dǎo)致了更差的預(yù)后

。PD-1/PD-L1抗體與其他免疫檢查點(diǎn)靶向藥物的聯(lián)合化療正在開發(fā)中，作為一種潛在的治療策略，可以獲得顯著的療效。然而，根據(jù)TCGA研究，更有前景的聯(lián)合靶向藥物可能是PI3K抑制劑，而不是免疫檢查點(diǎn)靶向藥物或抗血管生成藥物

。

企業(yè)重組業(yè)務(wù)作為一項(xiàng)不同于日常經(jīng)營(yíng)活動(dòng)的非常規(guī)業(yè)務(wù)，對(duì)提升企業(yè)影響力和競(jìng)爭(zhēng)力具有重要意義。重組業(yè)務(wù)的復(fù)雜性也對(duì)企業(yè)全體人員提出了更高的要求。企業(yè)重組業(yè)務(wù)會(huì)給企業(yè)的稅務(wù)管理工作帶來(lái)一定風(fēng)險(xiǎn)，因此企業(yè)應(yīng)該加強(qiáng)稅收籌劃，降低稅務(wù)風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)重組業(yè)務(wù)有計(jì)劃有效率地進(jìn)行。

2014年，TCGA提出了一個(gè)涵蓋4種胃癌基因亞型的分子分類：EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)陽(yáng)性、MSI、基因組穩(wěn)定(genome stability，GS)和染色體不穩(wěn)定性(chromosome instability, CIN)

。不同的亞型因特定的分子發(fā)病特征而顯著，例如，EBV陽(yáng)性腫瘤具有復(fù)發(fā)性、PIK3CA突變及涉及JAK2、PD-L1和PD-L2的擴(kuò)增。EBV通過刺激多種宿主蛋白和途徑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。EBV胃癌具有如下特征：(1)腫瘤組織PD-L1高表達(dá)，EBV胃癌往往伴有免疫相關(guān)基因的擴(kuò)增，其中編碼PD-L1、PD-L2的基因均有明顯擴(kuò)增；(2)局部高水平淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，EBV胃癌伴有明顯的細(xì)胞趨化因子水平的改變，能更多地吸引T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)至腫瘤局部；(3)高頻基因突變，EBV胃癌具有以PIK3CA(10%～80%)、ARID1A(47%～55%)及AKT2(38%)為主的特征性高頻基因突變

。腫瘤組織的高PD-L1表達(dá)、高水平淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及高突變負(fù)荷均為免疫檢查點(diǎn)阻斷治療獲益的生物標(biāo)志，提示EBV胃癌有望成為胃癌中免疫檢查點(diǎn)阻斷治療的優(yōu)勢(shì)人群

。TCGA研究證實(shí)了啟動(dòng)子甲基化與EBV相關(guān)胃癌之間的關(guān)系，也證實(shí)了EBV與PI3K/Akt和JAK2等信號(hào)通路的另一個(gè)關(guān)鍵關(guān)聯(lián)。

2015年ACRG發(fā)起了一項(xiàng)共納入300例患者的胃癌分子分型研究，將胃癌分為4種亞型：(1)MSI型：多為L(zhǎng)auren腸型，臨床上多分期較早(Ⅰ或Ⅱ期)，預(yù)后最佳；(2)MSS/EMT型：較其他亞型發(fā)病年齡顯著偏低，細(xì)胞黏附基因CDH1表達(dá)缺失，多對(duì)應(yīng)Lauren彌漫型，且分期較晚(Ⅲ或Ⅳ期)，4種亞型中預(yù)后最差；(3)MSS/TP53+型；(4)MSS/TP53-型。MSS/TP53+型和MSS/TP53-型均好發(fā)于男性，多對(duì)應(yīng)Lauren 腸型，預(yù)后介于MSI型和MSS/EMT型之間，但MSS/TP53+型較其他亞型EBV陽(yáng)性率明顯偏高

。ACRG分型主要基于亞洲人群，主要來(lái)自日本和韓國(guó)。然而，目前尚不清楚ACRG分類標(biāo)準(zhǔn)是否適用于中國(guó)人群

。而且，根據(jù)國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究，我們發(fā)現(xiàn)，與ACRG分型相比，TCGA分型的適用性更強(qiáng)。未來(lái)還會(huì)出現(xiàn)新的關(guān)于胃癌分子分型方面的研究，值得期待。

5 MSI在胃癌免疫治療中的進(jìn)展

近些年來(lái)，免疫療法在提高某些實(shí)體腫瘤(如黑色素瘤和肺癌)的治療反應(yīng)方面顯示出了不錯(cuò)的療效。在大多腫瘤中，較高的突變負(fù)荷作為免疫治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物。突變水平較高的癌細(xì)胞產(chǎn)生更多的肽類抗原，并在其主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)I類分子上表達(dá)，這使得它們更容易被T細(xì)胞識(shí)別并被破壞，這為臨床醫(yī)師提供了治療的新思路，其中最主要的是PD-1/PD-L1阻斷治療。許多研究已經(jīng)證明，抑制PD-1/PD-L1通路提供了一種非常有效的腫瘤治療方法，Ⅰ～Ⅲ期試驗(yàn)顯示了抗PD-1、抗CTLA-4和聯(lián)合治療的良好療效

。然而，與化療相比，Pembrolizumab和Avelumab最近在進(jìn)展期胃癌預(yù)處理患者的Ⅲ期試驗(yàn)中均未能延長(zhǎng)生存期

。這些有爭(zhēng)議的結(jié)果強(qiáng)調(diào)，并不是所有的進(jìn)展期胃癌患者均可能從免疫療法中受益，需要仔細(xì)識(shí)別和選擇患者。在不同的臨床組中，各亞型的存活率存在差異。EBV相關(guān)性和彌漫性/混合性病例對(duì)化療的反應(yīng)較好

，而MSI對(duì)于免疫治療顯示出了很好的療效。Pembrolizumab被批準(zhǔn)用于治療MSI-H dMMR實(shí)體腫瘤，這是FDA首次批準(zhǔn)基于該標(biāo)志物而不是癌癥起源位置的藥物用于癌癥治療，這也揭示了癌癥免疫治療的廣泛適用性

。雙特異性抗體是免疫治療中的一個(gè)新概念，其中一種抗體被設(shè)計(jì)為具有兩個(gè)不同靶點(diǎn)的結(jié)合位點(diǎn)。癌胚抗原T細(xì)胞雙特異性抗體(carcinoembryonic antigen T cell bispecific antibody，CEA-TCB)是一種雙特異性抗體，可以同時(shí)結(jié)合癌細(xì)胞上表達(dá)的CEA和T細(xì)胞上的CD3，導(dǎo)致T細(xì)胞與癌細(xì)胞的結(jié)合，而不依賴于其他免疫系統(tǒng)相關(guān)的相互作用。CEA-TCB已在實(shí)體瘤和MSS的大腸癌中顯示出一定療效

。

6 討論

晚期胃癌治療尤其困難，且目前仍以一線化療為主，二線三線才考慮免疫治療。晚期胃癌免疫治療進(jìn)展后的治療選擇，探索仍在進(jìn)行中，進(jìn)展后跨線、再挑戰(zhàn)或可有臨床獲益，將是晚期胃癌免疫治療未來(lái)的探索方向。近年來(lái)從分子水平重新認(rèn)識(shí)疾病、應(yīng)用分子分型指導(dǎo)治療和預(yù)測(cè)療效的相關(guān)研究是熱點(diǎn)，對(duì)新的分子分型檢測(cè)生物標(biāo)志物顯得尤為重要，但其衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)效益尚不明確。我們需要大量實(shí)驗(yàn)研究明確其經(jīng)濟(jì)和臨床效果，為晚期胃癌患者診治的臨床決策提供理論支撐。下一步治療晚期胃癌的免疫和靶向治療的臨床試驗(yàn)應(yīng)該根據(jù)基因組差異和免疫學(xué)特征進(jìn)行調(diào)整，并為這些亞群發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)預(yù)測(cè)標(biāo)志物，現(xiàn)有的生物標(biāo)志物與新的生物標(biāo)志物的組合是未來(lái)研究工作的重點(diǎn)。必須繼續(xù)確定更有效的生物標(biāo)志物，以在治療前預(yù)測(cè)治療的有效性。期待未來(lái)更多的大型臨床試驗(yàn)研究，以更多地了解新的生物標(biāo)志物和靶向療法，針對(duì)個(gè)別患者確定較好的治療策略。

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