肝細胞生長因子交聯(lián)于膠原導管構(gòu)建神經(jīng)導管用于面神經(jīng)損傷修復

田婭媛，張文川，王寒明，王歡，馬富凱

面神經(jīng)炎癥反應，創(chuàng)傷，腫瘤或手術操作均可能引起周圍性面神經(jīng)麻痹，周圍性面神經(jīng)麻痹常常引起患者功能缺失，造成患者審美、心理方面的問題[1-4]。通常情況下，將神經(jīng)斷端直接縫合重建神經(jīng)連接是治療面神經(jīng)損傷的最佳方法，當神經(jīng)斷端較長時，無法將神經(jīng)斷端直接縫合。目前，自體神經(jīng)移植被認為是連接神經(jīng)斷端的金標準方法，因為它含有雪旺氏細胞和基板，能有效促進神經(jīng)再生。然而，自體神經(jīng)移植來源有限，因此需要尋找新的替代自體神經(jīng)移植的治療策略[5-6]。

前期的研究顯示，使用膠原管連接神經(jīng)斷端，修復神經(jīng)損傷時生物兼容性較好。膠原管惰性強，植入體內(nèi)后不易引起慢性炎癥反應形成疤痕[7-8]，因此本研究使用膠原管橋接神經(jīng)斷端。研究顯示,肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)在體外實驗中對運動神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元有營養(yǎng)支持作用[9]。本研究前期使用Traut’s和Sulfo-SMCC，通過兩步化學交聯(lián)成功將膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)交聯(lián)到膠原材料上[10]。該化學交聯(lián)方式不影響GDNF的生物學活性且GDNF的釋放速度得到了有效地控制。為防止HGF從損傷局部大量擴散，本研究探索采用前期工作中的化學交聯(lián)法，將HGF通過化學交聯(lián)中構(gòu)建神經(jīng)導管連接神經(jīng)斷端，觀察該方法對損傷的面神經(jīng)的修復作用, 旨在為面神經(jīng)損傷的治療提供依據(jù)。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及膠原管 HGF購自(Peprotech,Rocky Hill,NJ,USA)。膠原管購自(Renerve,NIPRO,Osaka,Japan)。Traut’s和Sulfo-SMCC購自(Thermo scientific)。雄性SD大鼠購自斯萊克實驗動物有限公司。

1.2 面神經(jīng)損傷模型制備及動物分組 本實驗嚴格遵循科技部2006年9月發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》的相關規(guī)定進行。將1 cm長的膠原管與Traut’s試劑反應0.5 h，Sulfo-SMCC試劑與HGF反應0.5 h。隨后將膠原管置于Sulfo-SMCC試劑與HGF反應液中0.5 h，通過化學交聯(lián)將HGF錨定在膠原導管內(nèi)。雄性SD大鼠12只, 體質(zhì)量180～200 g, 隨機將動物分為HGF組(實驗組)和磷酸緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)組(對照組)，每組6只。大鼠經(jīng)4%戊巴比妥納(30 mg/kg) 腹腔麻醉后，在其左側(cè)面部切開皮膚，暴露面神經(jīng)頰支，仔細分離神經(jīng)及周圍組織，使用手術剪剪去8 mm長面神經(jīng)頰支，由于神經(jīng)收縮，造成1 cm長神經(jīng)缺損，用膠原管連接神經(jīng)斷端，逐層縫合肌肉、皮膚。在HGF組，2 μg HGF錨定在膠原導管內(nèi)構(gòu)建神經(jīng)導管，對照組膠原管中填充PBS。

1.3 行為學觀察 正常情況下大鼠觸須向前豎起，并有節(jié)律拂動。面神經(jīng)損傷后，觸須即向尾側(cè)垂下，且失去拂動能力。術后8周，使用運動評分分析大鼠的功能恢復情況。評分規(guī)則如下[11]，0分：觸須無運動；1分：觸須有微量可觀測到的運動；2分：觸須有少量運動；3分：觸須不對稱運動；4分：觸須對稱運動。

1.4 電生理監(jiān)測 術后8周，將各組大鼠經(jīng)腹腔麻醉后，使用電生理儀檢測再生神經(jīng)傳導速度。將刺激電極置于面神經(jīng)近端，接收電極置于面神經(jīng)遠端，檢測再生神經(jīng)的傳導速度。刺激強度為5 V，波寬為0.2 ms，頻率1 Hz。實驗操作在室溫下進行。

1.5 免疫組化 術后8周，將大鼠通過心臟灌注處死。仔細分離、暴露再生的面神經(jīng)，將新生神經(jīng)使用4%多聚甲醛固定2 d。隨后將新生神經(jīng)包埋于石蠟中行切片。經(jīng)脫水、抗原修復后，使用3%牛血清白蛋白在室溫下將切片封閉40 min。加入抗神經(jīng)絲蛋白200一抗，將切片放于濕盒內(nèi)再放入4 ℃冰箱孵育過夜。使用PBS將切片洗滌3次，加入山羊抗鼠IgG二抗，再次使用PBS將切片洗滌3次，加入適量新鮮配置的DAB溶液，放入濕盒內(nèi)37 ℃孵育；最后使用Harris蘇木素中染色5 min左右，在倒置熒光顯微鏡下采集圖像；陽性染色為棕黃色，細胞核染色為藍色。

1.6 透射電鏡觀察 術后8周，經(jīng)心臟灌注將大鼠處死，切取左側(cè)面神經(jīng)，將新生神經(jīng)迅速投入電鏡固定液4 ℃固定2～4 h。使用0.1 M PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次15 min。1%的鋨酸·0.1 M PBS(pH 7.4)室溫(20 ℃)固定2 h。0.1 M PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次15 min。組織依次置入50%～70%～80%～90%～95%～100%～100%酒精上行脫水，每次15 min。丙酮∶812包埋劑=1∶1混合液滲透過夜，純812包埋劑滲透過夜。60 ℃聚合48 h。切片機切片60～80 nm超薄切片。鈾鉛雙染色(2%醋酸鈾飽和水溶液，枸櫞酸鉛，各染色15 min)，切片室溫干燥過夜。透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

2 結(jié) 果

2.1 運動功能分析 各組大鼠面神經(jīng)損傷后，大鼠觸須即向尾側(cè)垂下, 失去拂動能力, 口角歪向健側(cè)。術后各組大鼠觸須開始拂動，口角歪斜減輕，隨著時間延長，拂動的幅度加大。HGF組大鼠恢復速度大于PBS組大鼠。至術后第8周時，HGF組大鼠功能評分顯著高于PBS組大鼠，且差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

2.2 電生理結(jié)果 術后第8周，對兩組大鼠進行電生理測試，HGF組大鼠的神經(jīng)傳導速度顯著高于PBS組大鼠[(47.17±7.13)，(22.5±4.03)，P<0.01] 。見表1。

表1 神經(jīng)導管修復面神經(jīng)損傷的效果分析(均值±標準差)

2.3 透射電鏡觀察 術后第8周，透射電鏡結(jié)果顯示，HGF組有髓鞘神經(jīng)纖維直徑顯著大于PBS組，纖維分布較均勻，排列較為規(guī)則，纖維間有毛細血管和結(jié)締組織，部分纖維呈束狀生長。HGF組髓鞘厚度亦顯著大于PBS組，且差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1、表1。

圖1 電鏡下大鼠各組面神經(jīng)損傷后再生面神經(jīng)髓鞘形態(tài)

2.4 免疫組化 術后第8周，使用一抗對神經(jīng)纖維進行染色，觀察HGF組和PBS組面神經(jīng)的再生情況。結(jié)果顯示單位面積下，神經(jīng)纖維陽性面積在HGF組顯著高于PBS組。統(tǒng)計學結(jié)果顯示差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖2、表1。

陽性染色為棕黃色(免疫組化染色，×40)

3 討 論

周圍神經(jīng)再生是再生醫(yī)學中的研究熱點[12-14]。迄今，面神經(jīng)損傷后神經(jīng)功能修復仍然沒有取得滿意的效果。神經(jīng)橫斷缺損較長，無法通過直接縫合重建神經(jīng)連接時需要導管連接，引導神經(jīng)從近端向遠端生長[15-16]。在面神經(jīng)再生的眾多研究中，很少有解決神經(jīng)散亂生長和臨床聯(lián)帶運動這樣的問題[17]。前期的研究顯示，一些生長因子能夠促進神經(jīng)損傷后的再生[18-19]。HGF是一種有效的營養(yǎng)因子，最初在干細胞的原代培養(yǎng)中被用作絲裂原而被發(fā)現(xiàn)和應用[20]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，HGF還參與其他生理活動，如器官再生、血管發(fā)生、腫瘤浸潤神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等[21]。有研究顯示，周圍神經(jīng)損傷后HGF受體升高，然而內(nèi)源性HGF不足以促進神經(jīng)損傷，外源性HGF在神經(jīng)損傷修復的早期階段起著重要作用[22]。

本研究將HGF通過化學交聯(lián)錨定于膠原導管內(nèi)構(gòu)建神經(jīng)導管用于連接神經(jīng)斷端，術后8周發(fā)現(xiàn)神經(jīng)導管能橋接神經(jīng)斷端，引導神經(jīng)叢近端向遠端生長，到達靶器官，促進運動功能恢復。以膠原導管為載體，將HGF錨定于膠原導管中能防止HGF隨體液流動而大量擴散，使得HGF在損傷局部維持有效的濃度，該神經(jīng)導管能有效促進神經(jīng)修復；本研究同時進行了功能和形態(tài)學的分析。術后8周，形態(tài)學方面，透射電鏡和免疫組化結(jié)果顯示，有髓神經(jīng)纖維的數(shù)量和髓鞘厚度在HGF組顯著高于PBS組。功能學方面，觸須運動評分和電生理結(jié)果顯示，運動評分和神經(jīng)傳導速度在HGF組顯著高于PBS組，功能學結(jié)果與形態(tài)學結(jié)果相似。本研究使用膠原導管作為HGF的載體，通過化學交聯(lián)防止HGF溶液在體液中大量擴散。研究結(jié)果提示，將HGF通過化學交聯(lián)錨定于膠原導管構(gòu)建神經(jīng)導管能有效促進神經(jīng)損傷修復。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。