那曲黃綠蜜環(huán)菌營(yíng)養(yǎng)成分及其抗氧化性的測(cè)定與分析

曹葉偉，扎西窮達(dá)，朱肖翔，王珊珊，尼珍*

西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)研究院（拉薩 850000）

黃綠蜜環(huán)菌（Armillaria luteo-virens），又名黃蘑菇、皇菇、雙環(huán)菌，屬于擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycentes）口蘑目（Tricholomatales）口蘑科（Tcholomataceae）蜜環(huán)菌屬（Armillaria），主要分布于我國(guó)的西南地區(qū)，尤其是青藏高原地帶，夏秋季生長(zhǎng)在低溫、高海拔的蒿草草甸或草原上，單生、散生、野生，常形成蘑菇圈[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，野生黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體中含有較豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、硒、糖類、生物堿、揮發(fā)油、脂肪酸和少量皂苷、強(qiáng)心苷、甾體三萜類、有機(jī)酸、黃酮等[4-10]，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗流感病毒，促進(jìn)小兒發(fā)育等作用[11-14]。近年來的研究對(duì)象多為青海產(chǎn)黃綠蜜環(huán)菌，對(duì)于西藏尤其是作為特色資源的那曲黃綠蜜環(huán)菌鮮少有報(bào)道，分析那曲黃綠蜜環(huán)菌的營(yíng)養(yǎng)成分及其抗氧化活性，以期為那曲黃綠蜜環(huán)菌的開發(fā)應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃綠蜜環(huán)菌樣品（采集自西藏那曲的干燥品，均需研磨成細(xì)粉）。

1.2 儀器與試劑

Kjeltec8400全自動(dòng)凱氏定氮儀（福斯）；20AT液相色譜儀（島津）；AL204-IC天平（梅特勒）；TU-1810D紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；NexION1000電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（珀金埃爾默）；ETHOS UP微波消解儀（邁爾斯通）；CF16RXII離心機(jī)（日立）。

硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、氫氧化鈉、95%乙醇、鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液、三乙胺、鹽酸、乙腈、異硫氰酸苯酯、衍生劑（異硫氰酸苯酯∶三乙胺∶乙腈=1∶1∶8）、蒽酮、Tris-HCl、鄰苯三酚、磷酸緩沖液、過氧化氫、乙二胺四乙酸二鈉、超純水。試劑為分析純、優(yōu)級(jí)純或色譜純。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 蛋白質(zhì)的測(cè)定

參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》。

1.3.2 游離氨基酸的測(cè)定

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱Agilent extend-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相，A相為0.1 mol/L乙酸鈉水溶液（醋酸調(diào)pH 5.0）；B相為乙腈；流速1.0 mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣體積20 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 游離氨基酸含量測(cè)定梯度洗脫程序

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

配制標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液。分別精確稱取約10 mg氨基酸對(duì)照品天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及賴氨酸至25 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并定容至刻度。

配制混合系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。精密量取儲(chǔ)備液，用0.1 mol/L鹽酸溶液配制成質(zhì)量濃度分別為2，5，10，20和50 μg/mL的混合系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線見表2。

表2 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.2.3 試樣的制備與測(cè)定

稱取約2.0 g樣品粉末于離心管中，加入30 mL 0.1 mol/L鹽酸混勻，超聲30 min，過濾至50 mL比色管中，用水潤(rùn)洗離心管后過濾至比色管中，加水至50 mL，作為樣品溶液。

取混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液及樣品溶液各100 μL置4 mL離心管中，加入100 μL衍生試劑，渦旋20 s，放置60 min，加800 μL水、0.5 mL正己烷，渦旋1 min，靜置10 min，取0.5 mL下層溶液加正己烷，渦旋1 min，靜置10 min，取下層溶液，用0.22 μm濾膜過濾后取20 μL進(jìn)行色譜分析，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算氨基酸含量。

1.3.2.4 典型色譜圖

圖1 10.0 μg/mL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 那曲市周邊樣品色譜圖

1.3.3 多糖的測(cè)定

1.3.3.1 試劑的配制

配制硫酸蒽酮溶液。精密稱取0.1 g蒽酮，加100 mL硫酸溶液使溶解，搖勻，置于棕色瓶，即得。

1.3.3.2 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取約12 mg經(jīng)98～100 ℃干燥2 h的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品置100 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得。

1.3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

精密量取0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.5和2.0 mL對(duì)照品溶液，分別置于10 mL具塞試管中，各加水至2.0 mL，迅速加入6 mL硫酸蒽酮溶液，立即搖勻，放置15 min，立即置冰水浴中冷卻15 min，取出，以相應(yīng)的試劑為空白，在625 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為f(x)=29.161x-0.021 7，R2=0.993 1。

1.3.3.4 試樣的制備與測(cè)定

稱取約2 g樣品粉末，置圓底燒瓶中，加50 mL水，超聲提取2 min，靜置1 h，于80 ℃水浴加熱浸提4 h，趁熱過濾，用少量熱水洗滌濾器和濾渣，將濾渣置圓底燒瓶中，加20 mL水，于80 ℃水浴加熱浸提2 h，趁熱過濾，合并濾液，于70 ℃水浴真空旋干，殘?jiān)?2 mL水溶解，邊攪拌邊緩慢加入38 mL乙醇，搖勻，于4 ℃放置12 h，離心，棄去上清液，沉淀用熱水溶解，轉(zhuǎn)移并定容至500 mL，搖勻，取2.5 mL上清液，置25 mL量瓶，加水定容至刻度，搖勻，即得。

精密量取2 mL樣品溶液，置10 mL具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備顯色方法，迅速加入6 mL硫酸蒽酮溶液，同法操作，測(cè)定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算多糖含量。

1.3.4 硒的測(cè)定

參照GB 5009.93—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中硒的測(cè)定》。

1.3.5 水溶物抗氧化性測(cè)定

1.3.5.1 試樣的制備

精密稱取約2.0 g樣品，置離心管中，加入20 mL超純水，渦旋混勻，超聲提取30 min，渦旋混勻，按3 500 r/min離心10 min，取上層清液為樣品溶液。

1.3.5.2 羥基自由基抑制率測(cè)定

按順序分別在試管中加入1 mL 0.15 mol/L、pH 7.4的磷酸緩沖液、0.5 mL樣品溶液、1 mL 1.3%過氧化氫溶液（新鮮配制）和1 mL 0.95 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（新鮮配制），混勻后置30 ℃水浴反應(yīng)30 min，在550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為A樣品，以0.5 mL水代替樣品溶液同法測(cè)定吸光度，記為A對(duì)照，按式（1）計(jì)算羥基自由基抑制率。

1.3.5.3 超氧陰離子自由基抑制率測(cè)定

取4.5 mL 0.05 mol/L、pH 8.2的Tris-HCl緩沖溶液于試管中，置25 ℃水浴預(yù)熱20 min，按順序加入0.1 mL樣品溶液和0.4 mL 2.5 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后置25 ℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)4 min，立即加2滴中8 mol/L鹽酸溶液止反應(yīng)，在299 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為A樣品，以0.1 mL水代替樣品溶液同法測(cè)定吸光度，記為A對(duì)照，按式（2）計(jì)算超氧陰離子自由基抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)含量的分析

那曲黃綠蜜環(huán)菌中蛋白質(zhì)含量為33.05～38.36 g/100 g，如表3所示，與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的青海黃綠蜜環(huán)菌中的蛋白質(zhì)含量相當(dāng)。

表3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

2.2 游離氨基酸含量的分析

游離氨基酸檢測(cè)結(jié)果顯示（表4），那曲黃綠蜜環(huán)菌中19種氨基酸種類齊全，總量為55.80～79.75 mg/g，8種人體必需氨基酸含量為16.80～30.06 mg/g。其中色氨酸、谷氨酸、精氨酸及天冬酰胺含量較高，不同來源樣品氨基酸含量存在差異，檢出青海黃綠蜜環(huán)菌中未檢出的天冬酰胺[15-16]。

表4 游離氨基酸含量的測(cè)定

2.3 多糖含量的分析

那曲黃綠蜜環(huán)菌中多糖含量為3.56～8.12 g/100 g，如表5所示，與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的香菇中的多糖含量相當(dāng)。

表5 多糖含量的測(cè)定

2.4 硒含量的分析

GB 28050—2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽通則》中富含硒的要求為0.15 mg/kg以上，硒含量測(cè)定結(jié)果顯示（表6），那曲黃綠蜜環(huán)菌符合該要求，為富含硒食品。與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的富硒黑木耳中硒的平均含量相當(dāng)，高于富硒香菇中硒的平均含量。

表6 硒含量的測(cè)定

2.5 抗氧化性的分析

測(cè)試那曲周邊黃綠蜜環(huán)菌樣品的水溶物抗氧化性，結(jié)果見表7，羥基自由基抑制率為58.14%，抑制率優(yōu)于0.03%過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液；超氧陰離子自由基抑制率為56.85%，抑制率與0.15 mg/mL維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)。

表7 抗氧化性的測(cè)定

3 結(jié)論

試驗(yàn)對(duì)那曲黃綠蜜環(huán)菌的主要營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行檢測(cè)與分析：蛋白質(zhì)含量為33.05～38.36 g/100 g，與青海黃綠蜜環(huán)菌中的蛋白質(zhì)含量相當(dāng)；19種氨基酸種類齊全，總量為55.80～79.75 mg/g，8種人體必需氨基酸含量為16.80～30.06 mg/g，其中色氨酸、谷氨酸、精氨酸及天冬酰胺含量較高，不同來源樣品氨基酸含量存在差異，檢出青海黃綠蜜環(huán)菌中未檢出的天冬酰胺；多糖含量為3.56～8.12 g/100 g，與香菇中的多糖含量相當(dāng)；硒含量為0.57～2.53 mg/kg，符合GB 28050—2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽通則》中富含硒的要求，可界定為富含硒食品；羥基自由基抑制率為58.14%，抑制率優(yōu)于0.03%過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液，超氧陰離子自由基抑制率為56.85%，抑制率與0.15 mg/mL維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)。

結(jié)果表明，那曲黃綠蜜環(huán)菌是一種富含蛋白質(zhì)，19種氨基酸種類齊全，含有多糖、硒等功能性成分，具有抗氧化活性的健康佳品。發(fā)揮特色資源優(yōu)勢(shì)，推廣其作為健康食品的內(nèi)在價(jià)值，推動(dòng)那曲黃綠蜜環(huán)菌的產(chǎn)品深加工，無疑將產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)進(jìn)一步鞏固脫貧攻堅(jiān)成果、助力鄉(xiāng)村振興具有深遠(yuǎn)意義。