青楷槭樹葉成分及抗氧化性的研究

楊辛雅，張麗娜，郭玉媛，張智勇，金鐵巖*

延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院（延吉 133002）

對于功能食品的開發(fā)已成為一個研究熱點，特別是關(guān)于植物資源的成分和功能的科學(xué)研究如火如荼地進行，對具有促進人體健康、預(yù)防人類疾病和抑制人體老化等功能的植物資源的研究十分活躍。調(diào)查顯示，青楷槭樹葉具有良好的營養(yǎng)特性，具有作為功能性食品原料的發(fā)展?jié)摿?。青楷槭樹葉的研究與開發(fā)，可以開拓我國功能性食品在國際上的市場領(lǐng)域、促進新型藥品的開發(fā)、提高工廠生產(chǎn)及工業(yè)上的應(yīng)用，可帶來良好的經(jīng)濟效益。

青楷槭（Acer tegmentosumMaxim.）又稱為青楷子、遼東槭[1]，是槭樹科槭屬植物，在俄羅斯、朝鮮北部和中國均有分布[2]。青楷槭樹葉具有解酒護肝[3]、抗腫瘤、抗菌消炎[4]的作用。在傳統(tǒng)民間醫(yī)學(xué)上，青楷槭樹葉常被用于治療創(chuàng)傷性出血、膿腫、皮炎等[5-6]，青楷槭樹葉對治療肝病很有效果，特別是對肝臟積累的毒有解毒、使肝細胞再生的功效[7]。另外，青楷槭樹葉上含有多種多酚類化合物與黃酮類化合物[8]，具有良好的抗氧化活性[9]。

當(dāng)前市場上主要使用丁基羥基茴香醚（BHA）和二丁基羥基甲苯（BHT）等合成抗氧化劑。為充分保證食品中添加的抗氧化劑不對消費者的健康造成損害，GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》對食品中合成抗氧化劑的使用進行明確規(guī)定，制作食用油脂、油炸食品、肉干制品等食品時，BHA和BHT混合使用的總量不可以超過0.2 g/kg。因此，合成抗氧化劑也存在安全性問題，并且還存在使用限制的問題[10]。因此，人們需要開發(fā)能夠代替這些合成抗氧化劑的天然抗氧化劑。青楷槭樹葉作為具有良好潛力的天然植物資源，含有豐富的營養(yǎng)元素，且具有較高的抗氧化性，是制作天然抗氧化劑的良好原料。然而查閱資料發(fā)現(xiàn)，對于青楷槭樹葉成分及抗氧化性的研究較為缺少，為充分利用自然植物資源，對青楷槭樹葉的基礎(chǔ)性研究也便成為當(dāng)下較為重要課題。

結(jié)合青楷槭研究目的和研究現(xiàn)狀，試驗分析青楷槭樹葉的基本成分、礦物質(zhì)組成和游離糖組成，對青楷槭樹葉及其乙醇提取物酚類物質(zhì)含量、抗氧化活性進行測定（DPPH自由基、ABTS自由基清除能力、Fe3+還原能力），旨在為開展青楷槭樹葉研究與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

青楷槭樹葉（采集于琿春市密江鎮(zhèn)下洼子村）；70%乙醇（分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；沒食子酸（色譜純，上海源葉生物科技有限公司）；蘆?。ㄉV純，上海恒遠生物科技有限公司）；DPPH標準品：色譜純，上海華藍化學(xué)科技有限公司）；ABTS（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；二丁基羥基甲苯（BHT，分析純，上海市攀花化學(xué)有限公司）；抗壞血酸（VC，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

電子天平（FA-N/JA-N型，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；分析天平（FA1104型，上海精科天平）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101型，泰斯特儀器有限公司）；冷凍干燥機（FD-1A-50型，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；紅外線水分測定儀（CSY-H5A型，深圳市分析儀器制造有限公司）；原子吸收光譜儀（AAS8000型，江蘇天瑞儀器股份有限公司）；馬弗爐（SRJX-2-9型，鄭州恩格電子科技有限公司）；索氏提取儀（SZF-06C型，浙江托普儀器有限公司）；凱氏定氮儀（KDN-08A型，上海新嘉電子有限公司）；高效液相色譜儀（HPLC-3000型，上海凱澤科技有限公司）；紫外分光光度計（U-3900型，日立高科技公司）；離心機（TDZ5-WS型，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)處理

取青楷槭樹葉，自然晾干，粉碎，過0.180 mm（80目）篩，收集備用。

1.2.2 青楷槭樹葉乙醇提取物的制備

將青楷槭樹葉粉末與70%乙醇以1∶10 g/mL比例混合，在25 ℃條件下浸泡24 h后進行過濾，重復(fù)3次，合并濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的1/10，凍干，放入-20 ℃冰箱中備用。

1.2.3 青楷槭樹葉基本成分的測定

水分測定，參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》；粗灰分測定，參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》；粗脂肪測定，參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》；粗蛋白質(zhì)測定，參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》；總膳食纖維測定，參照GB 5009.88—2014《食品安全國家標準 食品中膳食纖維的測定》；碳水化合物=100%-水分-粗灰分-粗脂肪-粗蛋白。

1.2.4 青楷槭樹葉礦物質(zhì)含量測定

K、Na含量測定，參照GB 5009.91—2017；Mg含量測定，參照GB 5009.241—2017；Ca含量測定，參照GB 5009.92—2016；Fe、Cu、P等微量元素含量測定，參照GB 5009.268—2016。

1.2.5 青楷槭樹葉游離糖含量測定

將1 g青楷槭樹葉與40 mL 80%乙醇混合后，在80℃振動培養(yǎng)箱中以100 r/min速度旋轉(zhuǎn)提取游離糖，過濾后離心分離20 min，將離心管中的上清液用一次性醫(yī)用針管吸取一定質(zhì)量，用0.45 μm的過濾膜過濾，將濾液置于試劑瓶中用高效液相色譜分析測定[11]。

1.2.6 總酚含量測定

采用福林酚法[12]測定總酚含量。將青楷槭樹葉乙醇提取物配制成1 mg/mL的溶液作為樣品，分別吸取2.0 mL質(zhì)量濃度為0，20，40，80，160和320 μg/mL單寧酸，加入2.5 mL 10%福林酚試劑，加入2.0 mL 7.5%的Na2CO3溶液，充分搖勻后靜置0.5 h，于750 nm處測定溶液的吸光度。根據(jù)線性回歸方程計算總酚含量。

1.2.7 總黃酮含量測定

采用紫外分光光度法[13]測定總黃酮含量。將青楷槭樹葉乙醇提取物配制成1 mg/mL的溶液作為樣品，分別取5 mL質(zhì)量濃度0，20，40，80，160和320 μg/mL蘆丁溶液于試管中，先后加入0.1 mL 5%的NaNO2溶液及0.1 mL 8%的Al(NO3)3溶液，充分混合后靜置10 min。而后加入4.0 mL 5%的NaOH溶液，定容至10 mL，搖勻混合后室溫下靜置20 min，以零管作為參比，于510 nm處測吸光度，根據(jù)線性回歸方程計算總黃酮含量。

1.2.8 DPPH自由基清除率測定

參照韓立杰[14]、胡瀟文[15]的方法進行測定。稱取0.003 9 g DPPH用無水乙醇溶解后轉(zhuǎn)移入100 mL棕色容量瓶，定容后制得0.1 mM/L DPPH標準溶液，在4 ℃下避光保存。配制0.01，0.05，0.10，0.50和1.00 mg/mL的樣品溶液，取4 mL不同濃度的樣品溶液，分別加入4 mL DPPH混勻，避光放置0.5 h。用紫外分光光度計于517 nm處測量溶液的吸光度Ai，同時測量4 mL無水乙醇與4 mL樣品混合液的吸光度Aj，及4 mL DPPH與4 mL無水乙醇混合液的吸光度Ac。DPPH自由基清除率（D）的計算方法如式（1）所示。

1.2.9 ABTS自由基清除率測定

參照韓立杰[14]、胡瀟文[15]的方法進行測定。配制0.01，0.05，0.10，0.50和1.00 mg/mL的樣品溶液，取1 mL不同濃度的樣品溶液，加入4 mL ABTS工作液，搖勻靜置6 min后，使用紫外分光光度計測得其的734 nm處的吸光度Ai，將樣品溶液替換成蒸餾水，測量其吸光度A0。ABTS自由基清除率（A）的計算方法如式（2）所示。

1.2.10 Fe3+還原能力測定

參照張鑫等[16]的方法進行測定。準確稱取1.74 g磷酸二氫鈉、2.7 g磷酸氫二鈉及1.7 g氯化鈉，加蒸餾水使其溶解為400 mL，配制出磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6）。配制0.01，0.05，0.10，0.50和1.00 mg/mL的樣品溶液，取2.5 mL不同濃度的樣品溶液加入2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.6）和2.5 mL 0.1%鐵氰化鉀溶液，混合均勻后在50 ℃下水浴30 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，離心10 min后，取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水及0.5 mL的0.1%氯化鐵溶液，混合均勻后于700 nm處測定吸光度，以抗壞血酸和BHT作對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 青楷槭樹葉基本成分含量

根據(jù)表1可知，青楷槭樹葉的一般成分中水分為13.1%±0.3%、碳水化合物含量為55.4%±0.9%、粗蛋白含量為24.1%±0.1%、粗脂肪含量為3.4%±0.4%、粗灰分含量為4.0%±0.3%、總膳食纖維含量為45.2%。從結(jié)果可以看出，青楷槭樹葉中碳水化合物含量相對其他成分明顯更多，可作為今后對于青楷槭樹葉中的碳水化合物分析的參考，便于對青楷槭食品材料的功能性進行研究。

表1 青楷槭樹葉基本成分含量 單位：%

2.2 青楷槭樹葉礦物質(zhì)含量

根據(jù)表2可知，青楷槭樹葉內(nèi)礦物質(zhì)含量。其中，鉀含量最高，為2 247.8±11.2 mg/100 g，其次為鈣1 390.2±24.6 mg/100 g、鎂706.0±12.6 mg/100 g、磷405.2±22.7 mg/100 g。經(jīng)分析，微量元素鐵、錳、銅及鋅含量也分別為25.8±1.1，33.5±2.2，1.7±0.7和4.9±2.3 mg/100 g。鉀在人體內(nèi)承擔(dān)著維持血壓、保持細胞形態(tài)和維持酸堿平衡等重要生理作用，還具有能量代謝，細胞膜的運輸?shù)淖饔肹17]。試驗證明，青楷槭樹葉可作為K、Ca、Mg、Fe等礦物質(zhì)的良好補充來源。

表2 青楷槭樹葉礦物質(zhì)含量

2.3 青楷槭樹葉游離糖含量

根據(jù)表3可知青楷槭樹葉內(nèi)游離糖含量。其中，果糖含量最高，約3.5%，其次為葡萄糖，約2.5%，蔗糖含量約0.9%，未發(fā)現(xiàn)含有乳糖。果糖可以促進腸道益生菌的增殖，能夠促進腸胃蠕動，對于便秘和腹瀉都有緩解作用，還可促進腸胃對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[18]，增強免疫力[19]。試驗證明，青楷槭樹葉可為人體補充一定糖分，促進腸道吸收。

表3 青楷槭樹葉游離糖含量

2.4 青楷槭樹葉及其乙醇提取物酚類化合物含量

如表4所示，青楷槭樹葉的總酚和總黃酮含量分別為115.48±1.20 mg/g和21.4±1.20 mg/g，青楷槭樹葉乙醇提取物的總酚和總黃酮含量分別為350.67±1.20 mg/g和57.42±0.48 mg/g。青楷槭樹葉及其乙醇提取物的總酚含量均高于總黃酮。青楷槭樹葉乙醇提取物的總酚和總黃酮含量高于青楷槭樹葉，由此可得，青楷槭樹葉乙醇提取物生理活性成分含量較高。

表4 青楷槭樹葉及其青楷槭樹葉及其乙醇提取物酚類化合物含量

2.5 青楷槭樹葉乙醇提取物DPPH自由基清除能力

如圖1所示，在試驗質(zhì)量濃度范圍0～0.5 mg/mL內(nèi)，抗壞血酸、青楷槭樹葉乙醇提取物的DPPH自由基清除率隨樣品濃度的增大而增大，在質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時清除率分別達到93.42%和91.72%。BHT在樣品質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL時，DPPH清除率達到最大，為48.62%。在較低質(zhì)量濃度（0～0.05 mg/mL）時，青楷槭樹葉乙醇提取物的DPPH自由基清除率始終高于抗壞血酸和BHT，且差異均顯著（p＜0.05），在較高質(zhì)量濃度（0.1～1 mg/mL）時，抗壞血酸清除率高于青楷槭樹葉乙醇提取物和BHT。總體上DPPH自由基清除能力的順序為抗壞血酸＞青楷槭樹葉乙醇提取物＞BHT。

圖1 青楷槭樹葉乙醇提取物DPPH自由基清除率

2.6 青楷槭樹葉乙醇提取物ABTS自由基清除能力

如圖2所示，在試驗質(zhì)量濃度范圍（0～1.00 mg/mL）內(nèi)，BHT、青楷槭樹葉乙醇提取物的ABTS陽離子自由基清除率隨樣品濃度的增大而增大，在質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL時清除率分別達到93.43%和93.42%，抗壞血酸在質(zhì)量濃度0.5 mg/mL時清除率達到最大，為93.68%。在質(zhì)量濃度范圍為0～0.5 mg/mL時，樣品與與陽性對照之間存在顯著差異（p＜0.05），其中抗壞血酸的ABTS陽離子自由基清除率在質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時，顯著大于BHT和青楷槭樹葉乙醇提取物，青楷槭樹葉乙醇提取物在質(zhì)量濃度0.01和0.05 mg/mL時的清除率高于BHT。在質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL時，BHT和青楷槭樹葉乙醇提取物之間無顯著差異（p＞0.05）。總體上ABTS陽離子自由基清除能力的順序為抗壞血酸＞BHT＞青楷槭樹葉乙醇提取物。

圖2 青楷槭樹葉乙醇提取物ABTS自由基清除率

2.7 青楷槭樹葉乙醇提取物對Fe3+的還原能力

如圖3所示，在試驗質(zhì)量濃度范圍（0～1.00 mg/mL）內(nèi)，抗壞血酸、BHT和青楷槭樹葉乙醇提取物的鐵還原能力隨樣品質(zhì)量濃度增大而增大，且均存在顯著性差異（p＜0.05）。在質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL時吸光度分別達到3.28，0.38和1.12。相同質(zhì)量濃度下，抗壞血酸鐵還原能力始終均為最高水平，BHT始終均為最低水平。經(jīng)過綜合比較，鐵還原能力順序為抗壞血酸＞青楷槭樹葉乙醇提取物＞BHT。

圖3 青楷槭樹葉乙醇提取物Fe3+還原能力

3 結(jié)論

根據(jù)試驗結(jié)果可知，青楷槭樹葉富含有較高的膳食纖維，可研發(fā)以青楷槭樹葉為原料的功能性食品。青楷槭樹葉中的鉀和果糖也在人體內(nèi)起著重要作用。青楷槭樹葉的乙醇提取物的總酚總黃酮含量較高，且具有良好的自由基清除能力和抗氧化能力，可以推斷出自由基清除能力和抗氧化能力與酚類物質(zhì)含量、種類有關(guān)系。

綜上所述，青楷槭樹葉具有作為天然抗氧化劑的良好的發(fā)展?jié)摿Γ蔀殚_發(fā)相關(guān)功能性食品提供新的可能。