食物蛋白源生物活性肽的研究進(jìn)展

胡子聰，于阿立，劉香云，周靈蝶，王進(jìn)勝，房翠蘭*

1. 中糧東海糧油工業(yè)（張家港）有限公司（張家港 215634）；2. 重慶市九龍坡區(qū)疾病預(yù)防控制中心（重慶 400039）

生物活性肽是一類對生命有機(jī)體具有重要生理功能的肽類功能分子，它是利用酶、微生物、酸和堿等使蛋白質(zhì)水解得到的由2個(gè)或2個(gè)以上氨基酸殘基組成、分子量小于6 kDa的具有特殊活性的肽類[1]，并且由于其促進(jìn)健康的特性而對人類產(chǎn)生積極作用，如抗高血壓、抗血栓、抗氧化、降膽固醇、調(diào)節(jié)免疫等[2]。研究發(fā)現(xiàn)多種生物活性肽，一方面它們存在于谷物類、豆物類、乳源性和水生生物的蛋白質(zhì)中，另一方面是由這些食物原料經(jīng)加工處理后產(chǎn)生，在特定食品加工過程中，如乳制品、釀酒及腌肉制品的發(fā)酵過程中，產(chǎn)生大量生物活性肽[3-4]。因此在查閱大量文獻(xiàn)資料的基礎(chǔ)上，對生物活性肽的制備方法和生理功能展開綜述。

1 生物活性肽的制備方法

生物活性肽具有顯著的生物活性，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，市場上對生物活性肽的需求量也逐漸增加，因此制備活性高、產(chǎn)量高的生物活性肽是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，生物活性肽的制備方法主要包括酶解法、輔助法、發(fā)酵法。

1.1 酶解法

酶解法（EH）即利用蛋白酶催化作用蛋白質(zhì)生成氨基酸和多肽的過程，木瓜蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和肌動蛋白酶是常用的酶。該法被廣泛用于制備生物活性肽，其優(yōu)點(diǎn)在于工藝流程簡單、提取速度快、酶解條件容易控制，制備的生物活性肽性能比較穩(wěn)定，在酸性條件和較高溫度條件下結(jié)構(gòu)保持完整。此外酶解法利用特定的蛋白酶類，可以有目的地對特定肽段進(jìn)行剪切，以期獲得所需功能活性的肽[5]。表1列舉了采用酶解法對不同蛋白質(zhì)原料制備生物活性肽，可以明顯看出來自食品加工副產(chǎn)品的大多數(shù)蛋白質(zhì)構(gòu)成獲得富集的生物活性肽級分的底物，這樣就能減少副產(chǎn)物對環(huán)境所造成的污染，提高產(chǎn)品的附加值。通過這些食物蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的生物活性肽，表現(xiàn)出廣泛的生物學(xué)特性，如降血壓、抗氧化等。

表1 不同原料酶解法制備活性肽

然而，由于食物和副產(chǎn)物基質(zhì)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，酶與底物相互作用的程度有限，所需酶解時(shí)間長，難以實(shí)現(xiàn)最佳酶解效果和原料的最大化利用，并且易產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物，如苦味肽等[6]。因此近年來大量的研究工作集中在開發(fā)一種高效和工業(yè)上可行的工藝和預(yù)處理方法（如高壓靜水壓力輔助酶解法等），以提高水解效率。

1.2 高靜水壓輔助酶解法

高靜水壓（HHP）法最早用于消滅牛奶中的微生物，近年來該方法作為一種非熱加工技術(shù)，被廣泛用于規(guī)?；氖称奉A(yù)處理工藝中。由于HHP法通過加壓（100～1 000 MPa）誘導(dǎo)單體、寡聚體和聚集物的形成，無需添加化學(xué)試劑或使用高溫，對二硫鍵和肽鍵等共價(jià)鍵幾乎沒有影響[15]，蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)沒有被改變，并且對食品營養(yǎng)成分、風(fēng)味物質(zhì)沒有影響，能最大限度地保持食品原有的風(fēng)味和營養(yǎng)。

采用HHP處理食品蛋白時(shí)，加壓可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開，暴露出蛋白酶的靶點(diǎn)，提高酶水解的敏感性（如圖1所示）。若在酶水解的同時(shí)或酶解之前，用HHP對食物蛋白進(jìn)行預(yù)處理，可以更高效地獲取蛋白質(zhì)來源的生物活性肽。Boukil等[16]利用胰蛋白酶水解牛乳清蛋白（β-LG）生產(chǎn)活性肽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在胰蛋白酶水解前，在400 MPa下對β-LG預(yù)加壓處理10 min可以改善肽譜，提高肽產(chǎn)率和生物活性肽的生成。HHP除了提高酶對蛋白質(zhì)的水解效率外，還能改善產(chǎn)物肽的活性。Zhou等[17]在研究HHP和EH對銀杏籽蛋白（GSPs）水解和致敏性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶在壓力300 MPa時(shí)表現(xiàn)出最高的GSPs水解，所得產(chǎn)物肽的分子量均低于10 kDa，抗原性降低95%以上。

圖1 酶解法（EH）、高靜水壓（HHP）預(yù)處理后酶解法和高靜水壓酶解同時(shí)處理食物蛋白生產(chǎn)生物活性多肽的機(jī)理

1.3 發(fā)酵法

發(fā)酵法用于食品工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵乳制品、豆類制品、魚肉制品的發(fā)酵劑和非發(fā)酵劑細(xì)菌（如黑曲霉、米曲霉、枯草芽孢桿菌、乳酸菌等，如表2所示），在生長代謝過程中產(chǎn)生的蛋白酶，將活性肽片段從底物蛋白中水解釋放出來，這是發(fā)酵法制備生物活性肽的基礎(chǔ)。與利用工業(yè)酶制劑水解生產(chǎn)活性肽相比，發(fā)酵法的主要優(yōu)勢在于：發(fā)酵過程中底物蛋白既能作為菌種生長繁殖的營養(yǎng)物質(zhì)，也是菌種分解的目標(biāo)產(chǎn)物，這樣的結(jié)構(gòu)體系可減少廢物排放，使資源得到充分利用；發(fā)酵過程中可對某些苦味肽基團(tuán)進(jìn)行修飾和重組，獲得的活性肽能達(dá)到基本無苦味，可以有效運(yùn)用到保健食品領(lǐng)域；微生物傳代時(shí)間短，可以連續(xù)利用微生物代謝產(chǎn)生的復(fù)合酶系，釋放出更多的特定活性肽，生產(chǎn)效率較高。

在利用發(fā)酵法時(shí)，需選擇合適的菌種，控制最佳的發(fā)酵條件，如表2所示，利用不同菌種發(fā)酵，最佳的發(fā)酵條件存在差異。因此根據(jù)發(fā)酵工藝的差異，將發(fā)酵法分為固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵。在固態(tài)發(fā)酵中，選擇合適的菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到產(chǎn)量多、活性好、抗雜菌能力強(qiáng)的發(fā)酵基團(tuán)。將經(jīng)過預(yù)處理的原料與發(fā)酵基團(tuán)充分混合均勻，進(jìn)入發(fā)酵生產(chǎn)過程[18]。由于固態(tài)發(fā)酵屬于需氧發(fā)酵，發(fā)酵過程需要接觸外界空氣，容易受到雜菌的污染，因此根據(jù)不同菌種的生長繁殖特性，提供合適的營養(yǎng)條件，使目標(biāo)菌體具有絕對的生長優(yōu)勢，從而抑制雜菌生長。液態(tài)發(fā)酵利用真菌和細(xì)菌進(jìn)行的混合發(fā)酵，能夠充分利用細(xì)菌和真菌的優(yōu)勢，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的蛋白酶活性強(qiáng)，酶系豐富，發(fā)酵速度更快，與固態(tài)發(fā)酵相比，液態(tài)發(fā)酵周期短、生產(chǎn)效率高、菌種生長狀況好，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[19]。Torino等[20]研究扁豆液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵對生產(chǎn)具有抗氧化和抗高血壓性質(zhì)的水溶性組分的影響，試驗(yàn)結(jié)果顯示，液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的功能性水溶性提取物含較多總酚和抗氧化物。

表2 不同原料發(fā)酵法制備活性肽

但微生物發(fā)酵法在制備生物活性肽也有一定的缺點(diǎn)，如很多的產(chǎn)酶菌本身有毒或分泌的產(chǎn)物對人體有害，發(fā)酵法的關(guān)鍵技術(shù)就是選擇合適的菌種，而已證明無毒、可用于食品研發(fā)的菌種并不多，安全問題、作用機(jī)理成為阻礙微生物發(fā)酵法制備活性肽的最大障礙。

1.4 其他方法

基因重組法合成生物活性肽就是在已知氨基酸和核酸序列的前提下，人工設(shè)計(jì)合成表達(dá)活性肽的基因，并將其與適當(dāng)?shù)妮d體重組，將其導(dǎo)入受體菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得目的活性肽[29]。通過這種方法得到的肽產(chǎn)量和純度有很大提高，是大量獲得某特定生物活性肽的有效途徑之一。該法常用于新型活性肽的開發(fā)，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣闊。王東波等[30]利用基因重組技術(shù)高效制備具有促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖功能的垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽（PACAP 27）衍生多肽RP2，結(jié)果表明，RP2純度達(dá)96%，可有效促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞的增殖，從而有望成為一種新型角膜損傷治療候選藥物。

2 生物活性肽的生理功能

2.1 抗氧化

生命有機(jī)體在生長發(fā)育、新陳代謝過程中，由于內(nèi)部因素（細(xì)胞的吞噬作用、呼吸作用等）和外部因素（暴露于輻射、污染物中）作用，體內(nèi)的氧化平衡會被打破，細(xì)胞穩(wěn)態(tài)受到干擾，機(jī)體會受到一定程度的氧化應(yīng)激損害，并誘發(fā)多種慢性病和急性病，如動脈粥樣硬化、癌癥、神經(jīng)紊亂和糖尿病等[31]。

抗氧化肽一般由5～16個(gè)氨基酸殘基組成，并在N-末端包含疏水性氨基酸[32]，具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定性好、安全高效等特點(diǎn)。從食物或食品加工副產(chǎn)物中制備的抗氧化肽能夠通過清除自由基而發(fā)揮抗氧化的作用。Mendis等[33]利用酶法制備鱈魚皮膚明膠水解物，并分離出一種序列為His-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Leu的活性肽，該肽對超氧化物、1, 1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）的清除活性最高。Ohata等[34]在對發(fā)酵肉醬中抗氧化肽分離純化并研究其清除DPPH自由基和羥基自由基活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，肉醬發(fā)酵過程中產(chǎn)生的三肽（Gln-Tyr-Pro）具有很強(qiáng)的DPPH自由基和羥基自由基清除活性，而這種高強(qiáng)度的抗氧化性可能與氨基酸序列中Tyr-Pro序列有關(guān)。

此外抗氧化肽還可以通過維持氧化還原平衡、提升抗氧化酶活性來降低細(xì)胞中氧化應(yīng)激水平。Xu等[35]研究富硒大米蛋白酶解產(chǎn)物（SPHs-3）的活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，用質(zhì)量濃度100 μg/mL的SPHs-3處理由Pb2+暴露引起中毒的人肝癌細(xì)胞系（HepG-2）中PC12細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞，會使這些細(xì)胞的活力提升24.9%和23.0%，同時(shí)也會增強(qiáng)SOD活性和提高GSH含量，從而保護(hù)這2種細(xì)胞免受Pb2+毒害。

2.2 降血壓

高血壓是與腦血管、心臟和腎臟并發(fā)癥緊密聯(lián)系在一起的疾病。人體的血壓和血管張力是由血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）對腎素-血管緊張素系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。從腎臟釋放的腎素將血管緊張素原轉(zhuǎn)化為ACE-I，ACE能將ACE-I水解為ACEII，使血管進(jìn)一步收縮，導(dǎo)致動脈血壓在中長期內(nèi)增強(qiáng)，因此抑制ACE活性對降血壓和治療心血管疾病治療具有顯著作用[36]。

雖然利用化學(xué)方法合成的ACE抑制劑用于臨床治療已逾30年，且效果顯著，但長期使用會造成干咳和血管神經(jīng)性水腫[37]。天然的ACE抑制肽是預(yù)防和治療高血壓的一種有希望的替代藥品。Kim等[38]以玉米麩質(zhì)為原料，經(jīng)淀粉消化和熱變性處理后，用6種工業(yè)蛋白酶對其進(jìn)行水解，得到具有ACE抑制活性的肽。蛋白質(zhì)酶促水解得到的ACE抑制肽具有抗高血壓活性，Yang等[39]對玉米蛋白粉進(jìn)行去除淀粉的預(yù)處理之后，通過堿性蛋白酶水解，使用凝膠過濾法從樣品的水解產(chǎn)物中分離出ACE抑制肽。應(yīng)用氨基酸分析和HPLC-MS分析，確定該肽的氨基酸序列為Ala-Tyr，按50 mg/kg體重的劑量飼喂自發(fā)性高血壓大鼠，2 h后觀察到收縮壓最大降低9.5 mm Hg。

2.3 免疫調(diào)節(jié)

生物活性肽通過調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖、某些細(xì)胞因子的產(chǎn)生和刺激巨噬細(xì)胞活性對機(jī)體產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)活性[40]。這類肽主要來源于牛奶、玉米、魚類等食品中蛋白質(zhì)酶解或腸道消化[41]。由于分子量小、不具免疫原性，因此進(jìn)入機(jī)體后不會誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)。Mercier等[42]通過研究乳清蛋白的酶消化物對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外增殖的影響來評估它們的免疫調(diào)節(jié)特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳清蛋白通過胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶消化釋放免疫活性肽，當(dāng)乳清蛋白分離物濃度100 mg/mL時(shí)能顯著增強(qiáng)淋巴細(xì)胞體外增殖。肽的理化特性，如荷點(diǎn)狀況、親疏水性、肽鏈長度、氨基酸組成等對其活性影響很大。Cian等[43]對一種紅色海藻進(jìn)行酶解，其產(chǎn)物具有高的水解度，其組成中含有天冬氨酸、丙氨酸和谷氨酸，研究該產(chǎn)物在體外對原脾細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種酶解產(chǎn)物可促進(jìn)大鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖，降低TNF-α和其他促炎因子的產(chǎn)生，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用。

2.4 其他生理功能

除了上述提到的生物活性作用之外，生物活性肽還能調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)。從食物蛋白（牛奶酪蛋白、小麥面筋蛋白和血紅蛋白等）中衍生出來的外啡肽，具有穩(wěn)定性好、副作用小的特點(diǎn)。這類多肽對阿片受體具有良好的親和力，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周器官均起調(diào)節(jié)作用[44]。

如今營養(yǎng)過剩和肥胖所導(dǎo)致的2型糖尿病，是人類面臨的主要的健康問題。二肽基肽酶IV（DPPIV）是一種絲氨酸蛋白酶，能夠優(yōu)先從不同底物的N末端切割X-脯氨酸或X-丙氨酸二肽，其抑制作用會降低其對胰高血糖素樣肽（GLP-1）和葡萄糖依賴性促胰島素肽（GIP）的作用，保持較低的GLP-1降解，從而達(dá)到降低血糖的作用[45]。研究發(fā)現(xiàn)從魚類、海鮮、牛奶或肉類的水解產(chǎn)物制備的生物活性肽能夠抑制DPPIV的活性，達(dá)到控制2型糖尿病的目的[46]。

3 結(jié)語

來源于食物蛋白中的生物活性肽，具有生理功能多樣、安全性高、價(jià)格低廉、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，受到食品、醫(yī)藥領(lǐng)域的研究與關(guān)注。我國擁有大量豐富的蛋白質(zhì)資源，在食品工業(yè)中，大量原料利用率不高，農(nóng)副產(chǎn)品加工中產(chǎn)生的大量下腳料和工業(yè)廢物中含有大量蛋白質(zhì)。采用合適、高效的策略進(jìn)行蛋白質(zhì)的精深加工，制備生物活性肽，既可節(jié)約資源又能保護(hù)環(huán)境。未來生物活性肽的研究側(cè)重于提高制備技術(shù)水平、延長食源性生物活性肽的保存時(shí)間及提高其穩(wěn)定性等方面。