響應(yīng)面法優(yōu)化提取牛骨蛋白酶解物及其對酵母增殖的影響

尹玉文，高鳴陽，張艷森，孫國杰*

河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院（石家莊 050000）

酵母菌是一種重要的微生物菌群[1]，在遺傳學(xué)分析、發(fā)酵等多方面具有卓越的優(yōu)勢，在飼料和養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用具有極大的潛力[2]。氮源是微生物生長不可或缺的營養(yǎng)物質(zhì)，也是酵母菌生長所需要的關(guān)鍵營養(yǎng)元素[3]。氮源的種類繁多，每種氮源中含有的營養(yǎng)成分會有所差別[4]，每種微生物所需的氮源也不盡相同，因此為特定的菌種尋找最適的氮源、滿足細(xì)胞生長顯得尤為重要[5]。

牛骨的充分利用主要在于酶法提取營養(yǎng)物質(zhì)的過程[6]。劉政等[7]研究表明，氨基酸形式的氮源對微生物的生長具有重要影響，不但對微生物的生長具有促進(jìn)作用，同時能夠提高微生物發(fā)酵產(chǎn)率。黃菊等[8]通過復(fù)合蛋白酶處理牛骨后可生產(chǎn)高質(zhì)量的蛋白胨，酶解工藝具有水解時間短、操作條件溫和、成本低、產(chǎn)品總氮與生物性好等優(yōu)點(diǎn)，有利于高品質(zhì)骨蛋白胨的研發(fā)與應(yīng)用，可推廣到實(shí)際生產(chǎn)。劉定杭等[9]經(jīng)酶法對牛骨蛋白胨進(jìn)行不同程度的水解，得到11種蛋白胨，并且表明一些目的產(chǎn)品會受到蛋白胨中多肽分布及分子量大小的影響。

水解中使用的酶[10]是影響水解程度和氨基酸成分及產(chǎn)生肽段大小的關(guān)鍵因素。因此，控制酶解過程中的參數(shù)，以便能夠產(chǎn)生促進(jìn)微生物生長的水解產(chǎn)物[11]。試驗以高壓處理的牛骨肉粉為底物，以氨基酸濃度為評價指標(biāo)，從酶解溫度、時間、pH、復(fù)合酶添加量和料液比5個方面進(jìn)行單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗，研究最佳酶解條件，探究牛骨肽作為氮源添加劑對酵母的影響，以期為酵母培養(yǎng)中氮的來源提供理論和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛骨（石家莊農(nóng)貿(mào)市場，牛骨儲存于-20℃）；胰蛋白酶（2 000 U/g）、胃蛋白酶（3 000 U/g）、木瓜蛋白酶（60 000～2 400 000 U/g）、中性蛋白酶（50 000～500 000 U/g）、復(fù)合蛋白酶：均購于東恒華道）；氫氧化鈉、鹽酸等（均為市售分析純）；胰蛋白胨和酵母粉（購于英國OXOID）；Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、氨基酸（AA）含量檢測試劑盒等（購于索萊寶公司）；釀酒酵母（實(shí)驗室保存菌種）。

1.2 儀器與設(shè)備

KDN-1000自動凱氏定氮儀（上海斯嘉電子有限公司）；Ketagalan GL凝膠成像分析系統(tǒng)（美國威泰克有限公司）；DH3600BⅡ電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；LS-B75L型蒸汽滅菌鍋（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司）；玻璃儀器。

1.3 菌種與培養(yǎng)基

釀酒酵母由實(shí)驗室保存。YPD培養(yǎng)基：酵母粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL。酵母浸出粉骨肽葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract osteopeptide dextrose medium，YOD）含酵母粉10 g、骨肽20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL。

1.4 試驗方法

1.4.1 牛骨酶解得到牛骨肽

取100 g新鮮牛骨，通過高溫滅菌鍋于0.1 Pa處理3 h分離油脂，于低溫50 ℃烘干后用粉碎機(jī)將骨塊粉碎，過0.850 mm（20目）篩，按照一定的料液比進(jìn)行酶解，獲得的酶解液經(jīng)過4 000 r/min離心20 min，得到的上清液于50 ℃烘干后獲得牛骨肽。

1.4.2 牛骨脫脂

將處理好的牛骨切成15 cm長條，放入高壓滅菌鍋中于0.1 Pa蒸煮1，2，3，4和5 h，除去油脂，計算脫脂率和蛋白損失率。脫脂后的牛骨放入55 ℃烘箱中烘12 h，烘干后切成5 cm左右的骨塊，粉碎，稱其質(zhì)量。

1.4.3 牛骨肽化學(xué)成分測定

1.4.3.1 粗蛋白的測定

采用凱式定氮法[12]測定粗蛋白含量。

1.4.3.2 脂肪的測定

采用索氏提取法[13]測定脂肪含量。

1.4.3.3 灰分的測定

采用灼燒法[14]測定灰分含量。

1.4.3.4 水分的測定

采用105 ℃恒重法[15]測定水分含量。

1.4.3.5 游離氨基酸的測定

采用茚三酮法[16]，按照氨基酸（AA）含量檢測試劑盒檢測氨基酸含量。

1.4.3.6 氨基氮的測定[9]

采用電位滴定法測氨態(tài)氮，測定氨基氮含量。

1.4.3.7 骨肽分子量的測定

采用Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠制備試劑盒測定分子量。

1.4.4 單因素試驗

牛骨粉添加量1 g，酶解時間4 h，酶解溫度63 ℃，pH 9，料液比1∶2 g/mL，酶添加量為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%，考察酶添加量對牛骨酶解的影響。

牛骨粉添加量1 g，酶解時間4 h，酶解溫度63 ℃，pH 9，酶添加量0.3%，料液比1∶1，1∶2，1∶3，1∶4和1∶5 g/mL，考察料液比對牛骨酶解的影響。

牛骨粉添加量1 g，酶解時間4 h，酶解溫度63 ℃，酶添加量0.3%，料液比1∶2 g/mL，pH為7，8，9，10和11，考察pH對牛骨酶解的影響。

牛骨粉添加量1 g，酶解時間4 h，酶添加量0.3%，pH 9，料液比1∶2 g/mL，酶解溫度為45，55，65，75和85 ℃，考察酶解溫度對牛骨酶解的影響。

牛骨粉添加量1 g，酶添加量0.3%，酶解溫度63℃，pH 9，料液比1∶2 g/mL，酶解時間為2，3，4，5和6 h，考察酶解時間對牛骨酶解的影響。

Supplementary information is available for this paper at https://doi.org/10.29026/oea.2018.170001

1.4.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇合適的單因素范圍，利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗，并對結(jié)果進(jìn)行分析，因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平

1.4.6 驗證工藝

選取響應(yīng)面得到的最優(yōu)酶解工藝，平行3組，計算氨基酸的濃度，確定酶解的最優(yōu)工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛骨成分分析

牛骨的主要成分見表2?？梢钥闯?，牛骨粗蛋白含量為13.98%，高于牛奶（3.5%）和雞蛋（13.3%）。粗蛋白的高含量證明，牛骨水解物具有作為食品營養(yǎng)特性添加劑的條件。

表2 鮮牛骨主要成分

2.2 牛骨脫脂

圖1為蒸煮時間與脫脂率及蛋白質(zhì)損失率的關(guān)系。隨著蒸煮時間延長，脫脂率增大，但相應(yīng)的蛋白損失也不斷增多。綜合考慮，高溫蒸煮軟化牛骨3 h，脫脂率和蛋白損失率均在可控范圍。牛骨打粉后過0.850 mm（20目）篩后稱其質(zhì)量，得率約為52%。

圖1 蒸煮時間與脫脂率及蛋白質(zhì)損失率的關(guān)系

2.3 蛋白酶的選擇

分別選用5種蛋白酶處理牛骨粉，結(jié)果如圖2所示。隨著酶解時間的延長，蛋白酶的酶解效果越來越好，骨膠蛋白酶水解6 h后，水解效果最好，水解所得的游離氨基酸達(dá)到51.97 μmol/g。骨膠蛋白酶酶解效果最好，原因可能是骨膠蛋白酶中含有多種酶系，可以同時對蛋白質(zhì)肽鏈不同位點(diǎn)進(jìn)行剪切，使其快速被分解成小肽及氨基酸，進(jìn)一步研究骨膠蛋白酶的使用工藝條件。

圖2 多種蛋白酶酶解效果對比

2.4 復(fù)合蛋白酶使用工藝條件研究

2.4.1 單因素氨基酸含量的測定

通過對牛骨酶解過程中的酶解溫度、時間、料液比、pH、復(fù)合蛋白酶添加量5個條件進(jìn)行單因素分析，由圖3（A）可得，牛骨蛋白肽的水解溫度升高，水解得到的氨基酸濃度先升高后下降，溫度達(dá)到55 ℃時，酶解得到的氨基酸濃度最高，為78.39 μmol/g；由圖3（B）可得，牛骨蛋白肽水解pH升高，水解得到的氨基酸濃度先升高后下降，pH 9時，酶解得到的氨基酸濃度最高，為75.25 μmol/g；由圖3（C）可得，牛骨蛋白肽的酶添加量升高，水解得到的氨基酸濃度先升高后保持穩(wěn)定，酶添加量0.3%時，酶解得到的氨基酸濃度達(dá)到最高值88.17 μmol/g；由圖3（D）可得，牛骨蛋白肽的料液比中液體比例增大，水解得到的氨基酸濃度先升高后小幅下降，料液比1∶2 g/mL時，酶解得到的氨基酸濃度達(dá)到最高值70.13 μmol/g；由圖3（E）可得，牛骨蛋白肽酶解時間增大，水解得到的氨基酸濃度先升高后小幅下降，酶解時間6 h時，酶解得到的氨基酸濃度達(dá)到最高值70.01 μmol/g。從5個單因素中選取酶解溫度、酶解時間、酶添加量3個對酶解后氨基酸濃度影響最大的因素，進(jìn)行響應(yīng)面分析。

圖3 牛骨酶解過程的單因素分析

2.4.2 多因素試驗結(jié)果

2.4.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計

試驗結(jié)果數(shù)據(jù)見表3。經(jīng)軟件Design Expert 8.0.5分析，氨基酸濃度與提取溫度（A）、提取pH（B）、酶的添加量（C）的二元多項式模型為Y=91.45-8.09A+2.18B+3.67C+2.97AB-2.75AC+1.53BC-21.32A2-9.94B2-6.89C2。

表3 牛骨肽提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

從表4中的方差分析可知，模型p＜0.000 1，說明以響應(yīng)值（氨基酸濃度）建立的回歸模型極顯著。相關(guān)修正系數(shù)Radj2=0.926 3，表明模型的實(shí)測值與預(yù)測值吻合，失擬項p＞0.05，失擬項不顯著，表明二元多項式對試驗中的擬合較好。A2對試驗結(jié)果影響極顯著（p＜0.01）。由表4中F值大小可得到3個因素對氨基酸濃度的影響順序為溫度＞酶添加量＞pH。

表4 Box-Behnken試驗設(shè)計方差分析表

2.4.2.2 響應(yīng)面圖分析及優(yōu)化

根據(jù)模型繪制出各因素的等高線和響應(yīng)面。如圖4（a）所示，酶解溫度和酶解pH繪制的影響面呈現(xiàn)坡度平緩，表明兩者之間存在交互作用不顯著；圖4（b）所示，酶添加量和酶解溫度所繪制的影響面呈現(xiàn)坡度平緩，表明兩者之間存在交互作用不顯著；圖4（c）所示，酶添加量和酶解pH等繪制的影響面呈現(xiàn)坡度平緩，表明兩者之間存在交互作用不顯著。這與回歸方程分析給出的結(jié)果一致。

圖4 各因素交互作用對牛骨肽提取中氨基酸濃度影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.4.2.3 驗證工藝

根據(jù)軟件Design-Expert 8.0.5預(yù)測的酶解最佳工藝為溫度62.97 ℃、pH 9.11、酶添加量0.33%。考慮到實(shí)際操作，溫度修正為63 ℃，平行3次試驗，得到酶解后氨基酸濃度為91.718 7 μmol/g，與理論值92.972 3 μmol/g接近。確定經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化的酶解工藝可行。

2.5 骨蛋白胨酶解產(chǎn)品分子量分析

由圖5可知，牛骨肽的分子量在7.8～20.1 kDa之間，主要集中在14.4 kDa。

圖5 牛骨肽Tris-Tricine-SDS-PAGE電泳

2.6 產(chǎn)品理化指標(biāo)及培養(yǎng)細(xì)菌生產(chǎn)試驗結(jié)果

2.7 不同蛋白胨培養(yǎng)酵母試驗結(jié)果

圖6顯示酵母菌在YPD和YOD這2種培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)。隨著時間增長，酵母菌的增殖先達(dá)到遲滯期，接著來到快速繁殖的指數(shù)期，最后達(dá)到生長穩(wěn)定期。由圖6可知牛骨制得的骨肽配成的YOD培養(yǎng)基中酵母在第8小時后逐漸進(jìn)入指數(shù)生長期，工業(yè)生產(chǎn)的蛋白胨配成的YPD培養(yǎng)基中酵母在第12小時后逐漸進(jìn)入指數(shù)生長期。綜上所述，從牛骨中獲得的牛骨肽具有替代微生物培養(yǎng)基中蛋白胨的潛力。

表5 蛋白胨理化指標(biāo)檢測結(jié)果

圖6 酵母生長曲線

3 結(jié)論

試驗通過酶解法制備牛骨肽，在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化得到牛骨肽的最佳制備工藝：酶解時間4 h、酶解溫度63 ℃、pH 9.11、料液比1∶2 g/mL、酶添加量0.33%。在此條件下酶解液氨基酸濃度為91.718 7 μmol/g，分子量為7.8～20.1 kDa。

與市售蛋白胨相比，牛骨肽作為酵母氮源添加劑時，培養(yǎng)酵母的過程中能夠使酵母提前3 h進(jìn)入對數(shù)生長期，提高酵母增殖速率。牛骨肽能夠促進(jìn)酵母生長，加快酵母進(jìn)入對數(shù)生長期，是一種高效營養(yǎng)助推器，為酵母發(fā)酵提供高效的營養(yǎng)源，加快發(fā)酵速度，縮短發(fā)酵周期，豐富酵母繁殖環(huán)境，提高酵母發(fā)酵能力。