下調(diào)lncRNA OIP5-AS1可通過miR-217/USP7軸抑制肝癌細(xì)胞EMT及侵襲遷移

劉星，劉小梯，符秋紅，陳學(xué)東

(1.深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院，廣東 深圳，518110；2.邵陽學(xué)院 醫(yī)學(xué)部，湖南 邵陽，422000)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的肝癌病理類型，是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，長期預(yù)后差及死亡率高是其主要特點(diǎn)[1-2]。雖然HCC的診斷和治療水平有了較大提高，但由于對其復(fù)雜的分子發(fā)病機(jī)制認(rèn)識不足，難以避免HCC的頻繁復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3-4]。因此，進(jìn)一步闡明HCC惡性腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制，有利于制定更有效的治療策略。

人類基因組研究表明約90%的人類基因組DNA序列能夠被轉(zhuǎn)錄，在這些轉(zhuǎn)錄本中只有約2%的轉(zhuǎn)錄本能夠編碼并翻譯成蛋白質(zhì)，而其余較多不能編碼并翻譯為蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本則被稱為非編碼RNA(noncoding RNAs,ncRNAs)[5]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)和微RNA(microRNAs，miRNAs)是非編碼RNA的主要組成部分[6]。IncRNA的特點(diǎn)是長度超過200 bp核苷酸且沒有蛋白質(zhì)編碼功能，其在多種惡性腫瘤中調(diào)控腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[7]。例如，lncRNA TMPO-AS1可調(diào)控食管癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程[8]。IncRNA AGAP2-AS1作為miR-4668-3p的競爭內(nèi)源性RNA(ceRNA)，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT過程[9]。IncRNA ZNFX1-AS1作為miR-144的ceRNA調(diào)控EZH2的表達(dá)，并促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[10]。

IncRNA OIP5-AS1位于人類15號染色體上，多項研究證實它在多種人類疾病中發(fā)揮重要作用，其中較多的是惡性腫瘤。有研究報道lncRNA OIP5-AS1通過AKT /NF-κB通路靶向miR-26a-5p，從而促進(jìn)動脈粥樣硬化的進(jìn)展[11]；lncRNA OIP5-AS1可通過miR-448/PON1軸和TLR3/NF-κB信號通路的失活來緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎進(jìn)展[12]。在腫瘤的研究中證實lncRNA OIP5-AS1通過調(diào)節(jié)miR-137/ZNF217信號軸調(diào)控卵巢癌進(jìn)展[13]；lncRNA OIP5-AS1通過靶向miR-429/FOXD1/ERK通路在胰腺癌細(xì)胞中發(fā)揮致癌作用[14]。但lncRNA OIP5-AS1/miR-217/USP7分子軸調(diào)控肝癌細(xì)胞的EMT 及侵襲遷移機(jī)制的研究目前尚無文獻(xiàn)報道。本研究旨在探討lncRNA OIP5-AS1通過調(diào)控miR-217/USP7分子軸進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞的EMT 及侵襲遷移過程的機(jī)制，為肝癌的診治提供新的靶標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

正常肝細(xì)胞株HL-7702及肝癌細(xì)胞株(MHCC97H，Hep3B，HepG2和HCCLM3)購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、DMEM培養(yǎng)基購于美國賽默飛公司；青霉素、鏈霉素和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒均購于北京索萊寶科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑盒 Lipofectamine?3000、PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒TB GreenTMPremix Ex TaqTMII均購于日本TaKaRa 公司； TRIzol-Reagent購于美國Invitrogen公司；N-cadherin，Vimentin，E-cadherin，USP7和GAPDH一抗購于Proteintech中國公司；辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記二抗均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Transwell實驗用侵襲小室購于美國康寧公司；蛋白質(zhì)印跡及IP蛋白裂解液均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；實驗中涉及到的質(zhì)粒、干擾片段、miRNA的模擬物和抑制劑均委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計并合成。

1.2 方法

1.2.1 sh-lncRNA OIP5-AS1，shOIP5-AS1-1與shOIP5-AS1-2質(zhì)粒以及miR-217 3′ UTR熒光素酶報告基因表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)lncRNA OIP5-AS1基因組序列和質(zhì)粒載體多克隆酶切位點(diǎn)設(shè)計lncRNA OIP5-AS1上下游引物，同時針對lncRNA OIP5-AS1剪切位點(diǎn)不同設(shè)計shOIP5-AS1-1與shOIP5-AS1-2引物序列，設(shè)計特異性擴(kuò)增針對mRNA 3′ UTR區(qū)域DNA序列。通過PCR擴(kuò)增目的基因，提取目的基因和質(zhì)粒DNA、雙酶切、T-A連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞等構(gòu)建sh-lncRNA OIP5-AS1，shOIP5-AS1-1與shOIP5-AS1-2質(zhì)粒載體和空白對照質(zhì)粒同時構(gòu)建熒光素酶基因共表達(dá)的miR-217 靶向mRNA 3′ UTR嵌合基因共表達(dá)質(zhì)粒載體。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

正常肝細(xì)胞HL-7702及肝癌細(xì)胞株(MHCC97H，Hep3B，HepG2和HCCLM3)用含有10%FBS，100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)，將處于對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞以2×105個/孔的密度接種到6 孔板中，按照轉(zhuǎn)染試劑盒 Lipofectamine?3000說明書將相應(yīng)的質(zhì)粒、干擾片段及模擬物分別轉(zhuǎn)染至分組的實驗細(xì)胞中，通過qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡實驗檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.2.3 qRT-PCR實驗檢測lncRNA OIP5-AS1和miR-217的表達(dá)

用TRIzol法提取細(xì)胞中RNA，紫外分光光度計檢測提取RNA的濃度及純度。按照TaKaRa PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟對提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以制備cDNA，按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMII試劑盒說明書的步驟檢測lncRNA OIP5-AS1和miR-217的表達(dá)情況，實驗以GAPDH和U6為內(nèi)參對照。每個實驗樣品均設(shè)置3個復(fù)孔，每組獨(dú)立實驗均至少重復(fù)3 次。相應(yīng)基因的qRT-PCR引物序列見表1。

表1 正向和反向引物的序列Table 1 Sequence of forward and reverse primers

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測N-cadherin，Vimentin，E-cadherin和USP7表達(dá)

采用蛋白質(zhì)印跡法及IP裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白質(zhì)，通過BCA法檢測并定量蛋白質(zhì)濃度，分別取等量蛋白質(zhì)經(jīng)充分煮沸變性后采用10% SDS-PAGE電泳(80 V，120 min)分離蛋白質(zhì)；電轉(zhuǎn)膜法將電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫條件下封閉1 h；加入目的條帶相應(yīng)的一抗(體積稀釋比例均為1∶1 000)，4 ℃孵育反應(yīng)過夜；TBST洗膜3次，10 min/次，加入相應(yīng)屬性HRP標(biāo)記二抗(體積稀釋比例均為1∶2 000)室溫條件下孵育1 h；TBST洗膜3次，10 min/次；最后利用化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析儀觀察N-cadherin，Vimentin，E-cadherin和USP7的蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 Transwell實驗檢測肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力

取對數(shù)期生長的肝癌細(xì)胞，胰酶消化后用無血清培養(yǎng)基重懸至適當(dāng)細(xì)胞濃度，在進(jìn)行遷移實驗時，Transwell上室中加入200 μL無血清細(xì)胞懸液，Transwell下室中加入600 μL含有20%血清的培養(yǎng)基，置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)24 h，棄除所有的培養(yǎng)基后甲醛固定30 min，用棉簽擦除上室中未發(fā)生遷移的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，清洗并干燥后在顯微鏡下拍照并計數(shù)。在進(jìn)行侵襲實驗時，需提前在Transwell上室底部預(yù)鋪Matrigel基質(zhì)膠，其余操作與遷移實驗一致。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞ClncRNA OIP5-AS1、miR-217和USP7的靶向關(guān)系

取對數(shù)期生長的肝癌細(xì)胞按照細(xì)胞傳代的方法接種至24 孔板中，構(gòu)建lncRNA OIP5-AS1和USP7pmirGLO熒光素酶報告基因表達(dá)載體，獲得lncRNA OIP5-AS1，USP7野生型載體(pmirGLO-lncRNA OIP5-AS1-WT/pmirGLO-USP7-WT)以及l(fā)ncRNA OIP5-AS1，USP7突變載體(pmirGLO-lncRNA OIP5-AS1-MUT/pmirGLO-USP7-MUT)，根據(jù)實驗分組將相應(yīng)的質(zhì)粒和模擬物按照細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染至接種好的細(xì)胞中，恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)48 h，按照雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測試劑盒的操作說明，用酶標(biāo)儀檢測熒光素酶活性。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 IncRNA OIP5-AS1在肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示：與正常肝細(xì)胞HL-7702比較，lncRNA OIP5-AS1在肝癌細(xì)胞系中均呈明顯高表達(dá)(P<0.05或P<0.01，圖1)，且在MHCC97H細(xì)胞中表達(dá)水平最高，因此，選取MHCC97H細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

*P<0.05；**P<0.01。圖1 IncRNA OIP5-AS1在肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)Fig.1 IncRNA OIP5-AS1 is highly expressed in HCC cell lines

2.2 IncRNA OIP5-AS1的表達(dá)影響肝癌細(xì)胞EMT 及侵襲遷移能力

qRT-PCR實驗結(jié)果顯示:在肝癌MHCC97H細(xì)胞中轉(zhuǎn)染sh-lncRNA OIP5-AS1后，lncRNA OIP5-AS1的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05，圖2a)。結(jié)果顯示:與NC組比較,shOIP5-AS1-1組和shOIP5-AS1-2組肝癌細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白N-cadherin和Vimentin表達(dá)均明顯下調(diào)，同時E-cadherin 表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05或P<0.01，圖2b和2c)。Transwell實驗結(jié)果表明:與NC組比較,shOIP5-AS1-1組和shOIP5-AS1-2組肝癌細(xì)胞的侵襲遷移能力也明顯下降(P<0.05，圖2d和2e)。

2.3 LncRNA OIP5-AS1靶向下調(diào)miR-217對USP7的抑制作用

通過Starbase數(shù)據(jù)庫檢索預(yù)測與lncRNA OIP5-AS1可能存在相互作用的miRNA，發(fā)現(xiàn)lncRNA OIP5-AS1與miR-217存在匹配的結(jié)合位點(diǎn)(圖3a)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示:miR-217 mimics 顯著抑制了野生型(WT) lncRNA OIP5-AS1的3′ UTR熒光素酶活性，而對突變型(MUT) lncRNA OIP5-AS1的3′ UTR熒光素酶活性無影響(P<0.05，圖3b)。qRT-PCR實驗檢測結(jié)果顯示:敲降lncRNA OIP5-AS1可顯著上調(diào)miR-217的表達(dá)水平(P<0.05，圖3c)。

(a)qRT-PCR分析MHCC97H細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率；(b)和(c)Westernblot分析E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達(dá)；(d)和(e)Transwell法檢測MHCC97H細(xì)胞的遷移和侵襲。*P<0.05,**P<0.05。圖2 敲降lncRNA OIP5-AS1抑制MHCC97H細(xì)胞EMT及侵襲遷移Fig.2 Knockdown of lncRNA OIP5-AS1 inhibits the EMT, invasion, and migration of MHCC97H cells

(a)和(d)使用Starbase數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測lncRNA OIP5-AS1和miR-217，miR-217和USP7的結(jié)合位點(diǎn)，同時顯示了lncRNA OIP5-AS1和USP7的野生型(WT)和突變型(MUT)3′UTR；(b)和(e)采用雙熒光素酶報告基因法測定MHCC97H細(xì)胞的熒光素酶活性；(c)qRT-PCR分析miR-217在MHCC97H細(xì)胞中的表達(dá)；(f)Western blot分析MHCC97H細(xì)胞中USP7的蛋白表達(dá)。*P<0.05。圖3 IncRNA OIP5-AS1靶向下調(diào)miR-217對USP7的抑制作用Fig.3 IncRNA OIP5-AS1 targeted down-regulates the inhibitory effect of miR-217 on USP7

2.4 MiR-217通過下調(diào)USP7抑制肝癌細(xì)胞的EMT以及侵襲轉(zhuǎn)移

qRT-PCR結(jié)果顯示：在肝癌MHCC97H細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-217 mimics后miR-217表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05，圖4a)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示：在肝癌MHCC97H細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-217 mimics后，EMT相關(guān)蛋白N-cadherin 和Vimentin表達(dá)均明顯上調(diào)，同時E-cadherin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，但共轉(zhuǎn)pcDNA3.1-USP7后USP7和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4b、4c)。Transwell實驗結(jié)果顯示：過表達(dá)miR-217可顯著抑制肝癌MHCC97H細(xì)胞的遷移和侵襲能力(P>0.05，圖4d、4e)，但共轉(zhuǎn)pcDNA3.1-USP7 能夠減弱miR-217的抑制作用。

(a)qRT-PCR分析miR-217在MHCC97H細(xì)胞中的表達(dá)；(b)和(c)Western blot分析MHCC97H細(xì)胞中USP7和EMT相關(guān)蛋白的蛋白表達(dá)。(d)和(e)Transwell法檢測MHCC97H細(xì)胞的遷移和侵襲。*P<0.05。圖4 lncRNA OIP5-AS1/miR-217/USP7分子軸調(diào)控MHCC97H 細(xì)胞EMT及侵襲遷移Fig.4 lncRNA OIP5-AS1/miR-217/USP7 axis regulated EMT, invasion and migration of MHCC97H cells

3 討論

肝癌是世界上最常見的癌癥之一，肝細(xì)胞癌占肝癌病例的絕大多數(shù)[2]。由于肝癌起病隱匿，進(jìn)展迅速，80%的患者喪失了手術(shù)機(jī)會。雖然姑息性手術(shù)切除、射頻消融術(shù)、經(jīng)動脈化療栓塞(TACE)、全身化療、中藥治療可減輕患者癥狀，延緩肝癌進(jìn)展，但這些治療措施并不能明顯提高晚期肝癌患者的生存期，還給患者帶來嚴(yán)重的精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[15-18]。而肝癌治療療效達(dá)不到理想效果的關(guān)鍵原因之一在于肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT及侵襲轉(zhuǎn)移[19]。因此，研究肝癌細(xì)胞EMT及侵襲轉(zhuǎn)移的確切分子機(jī)制對于提高肝癌治療療效是至關(guān)重要的。

研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs在不同腫瘤組織中的表達(dá)存在顯著差異[13-14]，關(guān)于這些差異表達(dá)的lncRNAs與腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制之間的關(guān)系的研究也在逐步開展和深化。研究表明：lncRNA OIP5-AS1在肺癌、乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤等腫瘤中高表達(dá)，且可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[20-22]。本研究對lncRNA OIP5-AS1在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及其在EMT和侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用的機(jī)制進(jìn)行了全面的探索。研究中明確了肝癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA OIP5-AS1的表達(dá)均明顯上調(diào)，下調(diào)lncRNA OIP5-AS1的表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的EMT 及侵襲遷移能力。這表明：lncRNA OIP5-AS1可能參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展，且有望成為肝癌治療新的靶點(diǎn)和診斷標(biāo)志物。目前有研究提出lncRNAs作為miRNAs的ceRNAs，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。如研究報道lncRNA XIST通過充當(dāng)miR-429的分子海綿調(diào)節(jié)ZEB1表達(dá)促進(jìn)胰腺癌發(fā)生發(fā)展[24]；lncRNA-CTS競爭性結(jié)合miR-505上調(diào)ZEB2的表達(dá)，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和EMT[25]；PTTG3P通過海綿吸附miR-383增加致癌基因CCND1和PARP2的表達(dá)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA OIP5-AS1與miR-217具有直接靶向關(guān)系，敲降lncRNA OIP5-AS1顯著上調(diào)miR-217在肝癌MHCC97H細(xì)胞中的表達(dá)水平；過表達(dá)miR-217顯著抑制肝癌MHCC97H細(xì)胞的EMT及侵襲遷移過程。這表明lncRNA OIP5-AS1通過競爭性結(jié)合miR-217并調(diào)控其表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的EMT及侵襲遷移過程。

利用生物信息學(xué)方法進(jìn)一步預(yù)測miR-217的潛在下游靶基因。分析表明USP7可能是miR-217的下游靶基因。USP7是一種進(jìn)化保守的蛋白質(zhì)，最初被認(rèn)為是單純皰疹病毒蛋白的分子伴侶，與生長、發(fā)育和應(yīng)激相關(guān)的幾種細(xì)胞功能密切相關(guān)[27]，如USP7通過去除Axin多聚泛素化修飾從而穩(wěn)定其表達(dá)，并抑制Wnt/β-catenin信號通路進(jìn)而調(diào)節(jié)Wnt依賴性成骨細(xì)胞分化和脂肪細(xì)胞分化[28]。USP7通過穩(wěn)定Foxp3促進(jìn)調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞的發(fā)育和功能，而敲除Treg細(xì)胞中的USP7則在小鼠中引起致命的全身性自身免疫[29]。USP7在腫瘤發(fā)生中的作用同樣也很重要，文獻(xiàn)[30]報道USP7在肝癌組織中高表達(dá)并與較差的生存預(yù)后相關(guān)，且可通過去泛素化作用來穩(wěn)定TRIP12，從而使p14(ARF)失活并促進(jìn)肝癌進(jìn)程。過表達(dá)miR-217可顯著下調(diào)USP7的表達(dá)，同時過表達(dá)USP7可逆轉(zhuǎn)miR-217的抑制作用。結(jié)果表明：lncRNA OIP5-AS1可通過負(fù)性調(diào)控miR-217，上調(diào)USP7的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的EMT和侵襲遷移能力。

綜上所述，lncRNA OIP5-AS1可通過靶向下調(diào)miR-217對USP7的抑制作用，進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞的EMT和侵襲遷移過程。因此，本研究加深了對肝癌細(xì)胞EMT及侵襲轉(zhuǎn)移的確切分子機(jī)制的認(rèn)識，為肝癌的診斷和治療提供了重要理論依據(jù)。