長(zhǎng)鏈非編碼RNA 膀胱癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1、癌癥易感性候選物9在惡性胸腔積液中的表達(dá)及診斷價(jià)值Δ

謝詩琪，石志浩，陳萍，李堅(jiān)

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001

胸腔積液是由多種不同原因引起的胸膜疾病[1]，胸腔積液的病因診斷仍然是臨床醫(yī)師需面臨的一大挑戰(zhàn)[2]。根據(jù)病因胸腔積液可分為良性胸腔積液和惡性胸腔積液。惡性胸腔積液多來源于惡性腫瘤的胸膜轉(zhuǎn)移，僅少數(shù)是由于原發(fā)性胸膜腫瘤（惡性胸膜間皮瘤）所致，是滲出性胸腔積液第二大常見病因，胸腔積液多是晚期或轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的標(biāo)志，多提示患者預(yù)后不良[3]。原發(fā)性肺癌是引起惡性胸腔積液最常見的原因，占所有惡性胸腔積液的50%以上，其次是乳腺癌（16.8%）和惡性淋巴瘤（11.5%）[4-6]。臨床和影像學(xué)表現(xiàn)可對(duì)胸腔積液病因診斷提供輔助信息，但不能作為確診依據(jù)。胸腔積液或胸膜組織標(biāo)本檢出腫瘤細(xì)胞是診斷惡性胸腔積液的金標(biāo)準(zhǔn)，但胸腔穿刺胸腔積液脫落細(xì)胞檢測(cè)的陽性率尚不能令人滿意[7]，盡管胸腔鏡胸膜活檢對(duì)惡性胸腔積液的確診率超過90%[7-8]，但由于該操作為有創(chuàng)性檢查且對(duì)技術(shù)要求較高使其臨床使用受到一定局限。良惡性胸腔積液在治療方案及預(yù)后評(píng)估方面迥然不同，因此，早期鑒別診斷尤為重要。隨著近年來無創(chuàng)分子診斷技術(shù)的迅速發(fā)展，為臨床通過檢測(cè)胸腔積液標(biāo)本中的腫瘤特異性分子標(biāo)志物來診斷惡性胸腔積液提供了更多的選擇[9-10]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類非編碼轉(zhuǎn)錄本，通常并不編碼蛋白質(zhì)，其長(zhǎng)度超過200 個(gè)核苷酸，參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中常異常表達(dá)，lncRNA 能進(jìn)入血液、胸腔積液等體液中穩(wěn)定存在，可作為惡性腫瘤診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物[11-13]。lncRNA 膀胱癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（bladder cancer-associated transcript 1，BLACAT1）在多種腫瘤患者的腫瘤組織和血清中表達(dá)明顯上調(diào)，有望成為診斷某些腫瘤的生物標(biāo)志物[14]。lncRNA 癌癥易感性候選物9（cancer susceptibility candidate 9，CASC9）被認(rèn)為可能成為部分腫瘤的治療靶點(diǎn)、診斷及預(yù)測(cè)預(yù)后的生物標(biāo)志物，有可能用于部分腫瘤的診斷和治療過程中[15-16]。研究證實(shí)，臨床多采用多項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)來提高惡性腫瘤的診斷效能[17]，但目前關(guān)于BLACAT1 和CASC9 作為生物標(biāo)志物在良惡性胸腔積液鑒別診斷中的價(jià)值尚未見報(bào)道。因此，本研究選取良惡性胸腔積液患者為研究對(duì)象，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法檢測(cè)胸腔積液中BLACAT1 和CASC9 的表達(dá)水平，并與經(jīng)典的腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和細(xì)胞角質(zhì)蛋白19 片段抗原21-1（cyto-keratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1）進(jìn)行比較，探討上述腫瘤標(biāo)志物在良惡性胸腔積液鑒別診斷中的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年7 月至2021 年7 月江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院收治的初治胸腔積液患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①惡性胸腔積液患者的原發(fā)腫瘤均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，包括纖維支氣管鏡活檢、胃鏡活檢、經(jīng)胸腔穿刺肺活檢及區(qū)域淋巴結(jié)穿刺活檢；②惡性胸腔積液的性質(zhì)最終經(jīng)細(xì)胞學(xué)或組織病理學(xué)檢查確定，如胸腔積液脫落細(xì)胞學(xué)檢查及胸膜活檢；③良性胸腔積液的病因均通過綜合臨床表現(xiàn)、體征、實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)檢查進(jìn)行診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：①接受過正規(guī)抗腫瘤治療；②嚴(yán)重肝腎功能不全；③多器官功能衰竭；④嚴(yán)重出血、凝血功能障礙；⑤認(rèn)知水平低下或存在嚴(yán)重精神障礙。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入96 例胸腔積液患者，其中良、惡性胸腔積液患者各48 例。良性胸腔積液患者中男30 例，女18 例；年齡18～85 歲，平均（66.04±15.51）歲；疾病類型：結(jié)核性胸腔積液14 例，肺炎旁胸腔積液17 例，心功能不全6 例，低蛋白血癥3例，膿胸2 例，自發(fā)性液氣胸6 例。惡性胸腔積液患 者 中 男32 例，女16 例；年 齡33～94 歲，平 均（67.94±11.71）歲；疾病類型：肺癌46 例[肺腺癌43例，肺鱗狀細(xì)胞癌2 例，小細(xì)胞肺癌（small-cell lung cancer，SCLC）1 例]，食管癌1 例，乳腺癌1 例。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

血漿總RNA 提取Trizol 試劑、互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，提取RNA 過程中使用的氯仿、異丙醇、75%乙醇、DEPC 水均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。QuantStudio?5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 胸腔積液標(biāo)本采集和處理 通過胸腔穿刺術(shù)收集所有患者胸腔積液標(biāo)本200 ml，乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝，30 min 內(nèi)完成以下處理步驟：1060 r/min、4 ℃離心5 min，離心半徑為10 cm；棄上清留取沉淀，向沉淀中加入紅細(xì)胞裂解劑吹打混勻，靜置5 min，以520 r/min、4 ℃離心5 min，離心半徑為10 cm，如遇沉淀中血紅素含量較多時(shí)，該步驟可重復(fù)1 次；棄去上清液，加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）吹打混勻洗滌沉淀，以1060 r/min、4 ℃離心5 min，離心半徑為10 cm，同時(shí)根據(jù)情況可重復(fù)該步驟洗滌沉淀；最終留取沉淀加入1 ml的Trizol 液吹打混勻，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，-80 ℃保存?zhèn)溆?。另外留?0 ml胸腔積液標(biāo)本采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)CEA、CYFRA21-1 水平，CEA的 正 常 值 參 考 范 圍 為0～5 ng/ml，CYFRA21-1 的正常值參考范圍為0.21～7.00 ng/ml。

1.3.2 胸腔積液RNA 的提取及逆轉(zhuǎn)錄cDNA 的合成 將凍存標(biāo)本室溫解凍，取500 μl 加入100 μl氯仿振蕩混勻后靜置5 min，采用低溫高速離心機(jī)12 275 r/min、4 ℃離心15 min，取200 μl 上層水相，加入等量異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置10 min；然后12 275 r/min、4 ℃離心10 min，可見底部微量白色沉淀，棄上清液加入500 μl 75%乙醇上下混勻清洗沉淀，以7970 r/min、4 ℃離心5 min，留取沉淀，于室溫下干燥5～10 min 至無色透明，溶于適量DEPC 水，測(cè)定RNA 濃度及純度，-80 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，于冰上配置20 μl 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃5 s，85 ℃15 min，4 ℃隨機(jī)，合成cDNA 放置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)胸腔積液中BLACAT1、CASC9 的 相 對(duì) 表 達(dá) 量 取2 μl 的cDNA 作為引物模板，于冰上配置20 μl 反應(yīng)體系，PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s、95 ℃變性5 s、60 ℃退火和延伸5 s，共40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算BLACAT1、CASC9 的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計(jì)算曲線下面積（area under the curve，AUC），評(píng)估CEA、CYFRA21-1、BLACAT1、CASC9 單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)惡性胸腔積液的診斷效能，兩個(gè)及以上的腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)對(duì)惡性胸腔積液診斷效能的評(píng)估采用逐步Logistic 回歸分析方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BLACAT1、CASC9 相對(duì)表達(dá)量的比較

惡性胸腔積液中BLACAT1、CASC9 的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于良性胸腔積液，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表2）

表2 良惡性胸腔積液中BLACAT1、CASC9 相對(duì)表達(dá)量的比較[M（P25，P75）]

2.2 不同臨床特征腫瘤患者惡性胸腔積液中BLACAT1、CASC9 相對(duì)表達(dá)量的比較

不同年齡、性別、吸煙情況、病理類型及有無糖尿病或心血管疾病腫瘤患者惡性胸腔積液中BLACAT1 相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同性別、吸煙情況、病理類型及有無糖尿病或心血管疾病腫瘤患者惡性胸腔積液中CASC9 相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；年齡＞65 歲腫瘤患者惡性胸腔積液中CASC9 的相對(duì)表達(dá)量高于年齡≤65 歲患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.204，P=0.028）。（表3）

表3 48例不同臨床特征腫瘤患者惡性胸腔積液中BLACAT1、CASC9的相對(duì)表達(dá)量

2.3 CEA、CYFRA21-1、BLACAT1、CASC9 單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)惡性胸腔積液的診斷效能

CEA 單獨(dú)檢測(cè)診斷惡性胸腔積液的AUC為0.918（95%CI：0.863～0.974），高 于BLACAT1、CASC9、CYFRA21-1 單獨(dú)檢測(cè)，此時(shí)的靈敏度、特異度分別為87.2%、81.2%。BLACAT1+CASC9+CEA 聯(lián)合檢測(cè)診斷惡性胸腔積液的AUC 為0.938（95%CI：0.888～0.989），高于BLACAT1+CASC9、BLACAT1+CASC9+CYFRA21-1 聯(lián)合檢測(cè)的AUC，此時(shí)的靈敏度、特異度分別為91.5%、81.2%。（圖1、表4）

表4 CEA、CYFRA21-1、BLACAT1、CASC9 單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)惡性胸腔積液的診斷效能

圖1 BLACAT1、CASC9、CEA和CYFRA21-1單獨(dú)及聯(lián)合診斷惡性胸腔積液的ROC曲線

3 討論

惡性胸腔積液是腫瘤患者的常見并發(fā)癥，約15%的腫瘤患者疾病進(jìn)展過程中會(huì)出現(xiàn)惡性胸腔積液[3]，其中10%以胸腔積液癥狀為首發(fā)表現(xiàn)，常預(yù)示著腫瘤已進(jìn)展至晚期[18]。胸腔積液或胸膜組織標(biāo)本檢出腫瘤細(xì)胞或腫瘤組織即可確診惡性胸腔積液，但一項(xiàng)前瞻性研究顯示，胸腔穿刺胸腔積液脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)對(duì)惡性胸腔積液陽性檢出率為46%[7]，閉式胸膜活檢通常并不能進(jìn)一步提高惡性胸腔積液的陽性檢出率[3,19]。近年來，腫瘤生物標(biāo)志物在腫瘤診斷中的應(yīng)用價(jià)值逐漸引起臨床的重視[20]，胸腔積液中高靈敏度、高特異度的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)陽性可以盡早提示胸腔積液的惡性性質(zhì)，有助于早確診、早處理以改善患者的預(yù)后。

BLACAT1基因定位于人類染色體1q32.1，發(fā)揮致癌基因的作用，在多種類型的腫瘤組織中異常表達(dá)，能夠通過各種機(jī)制促使腫瘤的惡性進(jìn)展[21]。研究發(fā)現(xiàn)，BLACAT1 在包括肺腺癌、乳腺癌及食管癌等12 種腫瘤患者血清中的表達(dá)情況與腫瘤組織相似，BLACAT1 在這12 種腫瘤患者的血清及腫瘤組織中的表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，血清BLACAT1 對(duì)這些腫瘤的診斷效能較高[14]。Xu 等[22]研究顯示，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）組織中BLACAT1 高表達(dá)患者的總生存期和無進(jìn)展生存期均明顯短于低表達(dá)患者；體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BLACAT1 高表達(dá)促進(jìn)了NSCLC 細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、轉(zhuǎn)移及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。一項(xiàng)Meta分析顯示，BLACAT1 在腫瘤組織中的表達(dá)水平可作為肺癌、食管癌等多種腫瘤患者預(yù)后的生物標(biāo)志物，BLACAT1 高表達(dá)與患者較短的生存期、較低的組織學(xué)分級(jí)、較晚的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[23]。Chen 等[24]的 研 究 發(fā) 現(xiàn)，BLACAT1 在SCLC組織和細(xì)胞中的表達(dá)均明顯上調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良密切相關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，BLACAT1 在阿法替尼耐藥NSCLC 細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)BLACAT1 的表達(dá)可通過調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)NSCLC細(xì)胞對(duì)阿法替尼的耐藥性[25]。上述研究均證實(shí)，BLACAT1 可作為多種腫瘤診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物，并可能作為某些腫瘤的治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，BLACAT1 在惡性胸腔積液（大多數(shù)來源于肺癌的胸膜轉(zhuǎn)移）中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于良性胸腔積液，提示胸膜上轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的BLACAT1 釋放到了胸腔積液中，從而使檢測(cè)胸腔積液BLACAT1 作為診斷惡性胸腔積液的生物標(biāo)志物成為可能，ROC 曲線結(jié)果顯示，BLACAT1 診斷惡性胸腔積液的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度均較高，具有良好的診斷效能。

有研究最早在食管鱗狀細(xì)胞癌中檢測(cè)到了CASC9 高表達(dá)，隨后又在多種惡性腫瘤中檢測(cè)到CASC9 的表達(dá)異常升高，被證實(shí)CASC9具有原癌基因的作用[26]。Zhao 等[27]的研究結(jié)果顯示，CASC9在NSCLC 組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，CASC9 高表達(dá)NSCLC 患者的總生存期明顯短于CASC9 低表達(dá)患者；體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CASC9 可通過調(diào)控miRNA-335-3p/S100A14 信號(hào)通路促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。有研究顯示，CASC9 在NSCLC 組織中高表達(dá)，ROC 曲線分析結(jié)果表明，CASC9 診 斷NSCLC 的AUC 為0.734（95%CI：0.669～0.799），提示其可能作為診斷NSCLC 的潛在標(biāo)志物；進(jìn)一步分析結(jié)果表明，CASC9 高表達(dá)與NSCLC 患者的病理類型、TNM 分期、預(yù)后密切相關(guān)[28]。本研究結(jié)果顯示，CASC9 在惡性胸腔積液中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于良性胸腔積液；ROC 曲線分析結(jié)果顯示，CASC9診斷惡性胸腔積液的靈敏度、特異度均較高，具有良好的診斷效能，與申燕[28]的研究結(jié)果一致。

研究表明，多項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)能提高惡性胸腔積液的診斷效能[29]，本研究結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。BLACAT1+CASC9 聯(lián)合檢測(cè)診斷惡性胸腔積液的AUC 高于二者單獨(dú)檢測(cè)，同時(shí)靈敏度、準(zhǔn)確度均較高。BLACAT1+CASC9 與CEA 聯(lián)合檢測(cè)進(jìn)一步提高了惡性胸腔積液的診斷效能，雖然包括lncRNA 在內(nèi)的腫瘤標(biāo)志物不是診斷惡性胸腔積液的金標(biāo)準(zhǔn)，但胸腔積液中異常升高的腫瘤標(biāo)志物則高度提示惡性胸腔積液可能，有助于臨床醫(yī)師進(jìn)一步深入檢查以盡早獲取細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)證據(jù)。

綜上所述，BLACAT1、CASC9 在惡性胸腔積液中表達(dá)明顯上調(diào)，對(duì)惡性胸腔積液具有較好的診斷效能，BLACAT1+CASC9 與CEA 聯(lián)合檢測(cè)能夠進(jìn)一步提高診斷效能。