卵巢癌中同源重組修復(fù)基因逆轉(zhuǎn)突變導(dǎo)致多腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制劑耐藥的研究進(jìn)展△

袁華，李寧，吳令英

國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院婦瘤科，北京 100021

卵巢癌是最常見的婦科生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。2020 年全球估計(jì)新發(fā)卵巢癌31.4 萬例，病死20.8 萬例[1]。2015 年中國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，中國每年新發(fā)卵巢癌超5.2 萬例，病死超2.3 萬例，且呈明顯上升趨勢(shì)[2]。既往研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌的發(fā)生與DNA 雙鏈損傷修復(fù)缺陷密切相關(guān)。

DNA 雙鏈損傷修復(fù)維持著基因組穩(wěn)定和細(xì)胞的生存。G1期細(xì)胞周期的經(jīng)典非同源末端連接修復(fù)（classical non-homologous end-joining，C-NHEJ）和S/G2期的同源重組修復(fù)是主要的DNA 損傷修復(fù)方式。同源重組修復(fù)是高保真的DNA 雙鏈損傷修復(fù)。乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene，BRCA）1、BRCA2、RAD50、RAD51、RAD51C、PALB2、FANCA、ATM、ATR、細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶（cell cycle checkpoint kinase，CHEK）1、CHEK2等均是同源重組修復(fù)的重要基因。同源重組修復(fù)基因若出現(xiàn)異常，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞同源重組修復(fù)缺陷（homologous recombination deficiency，HRD），細(xì)胞會(huì)采用其他易錯(cuò)的修復(fù)方式進(jìn)行DNA 損傷修復(fù)，進(jìn)而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[3]。同源重組修復(fù)缺陷細(xì)胞對(duì)鉑類化療藥物及其他誘導(dǎo)DNA雙鏈損傷的藥物具有較高的敏感性[4]。15%～20%的上皮性卵巢癌患者攜帶BRCA1/2胚系突變（10%～15%）或體細(xì)胞突變（6%～7%），約10%的上皮性卵巢癌患者的BRCA1基因啟動(dòng)子存在過甲基化[5]，而其他同源重組修復(fù)基因的突變頻率為4%～5%[3]。

多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]抑制劑是主要針對(duì)BRCA1/2突變或HRD卵巢癌的靶向治療藥物，作用于BRCA1/2異?；騂RD 卵巢癌細(xì)胞后，細(xì)胞DNA 單鏈損傷不能被修復(fù)，可促進(jìn)DNA 雙鏈損傷、斷裂的發(fā)生，引起DNA 復(fù)制叉停止，導(dǎo)致合成致死，從而靶向殺滅腫瘤細(xì)胞[4]。多項(xiàng)臨床試驗(yàn)證實(shí)，PARP 抑制劑對(duì)BRCA1/2突變或HRD 卵巢癌患者具有較好的療效，特別是用于鉑敏感復(fù)發(fā)卵巢癌患者的維持治療、BRCA1/2突變晚期卵巢癌的一線維持治療及后線治療等[6-14]。此外，PARP 抑制劑在乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌的治療中也顯示出了令人滿意的療效。目前，已被美國食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)的PARP抑制劑包括4種，即奧拉帕利（Olaparib）、盧卡帕利（Rucaparib）、尼拉帕利（Niraparib）、他拉唑帕利（Talazoparib），其中奧拉帕利、尼拉帕利已經(jīng)在中國上市。國產(chǎn)PARP 抑制劑——氟唑帕利也已經(jīng)被批準(zhǔn)用于伴有胚系BRCA1/2基因突變的鉑敏感復(fù)發(fā)卵巢癌的后線治療。因此，將會(huì)有更多的腫瘤患者從PARP 抑制劑的治療中獲益[15]。

但部分?jǐn)y帶同源重組修復(fù)基因突變的上皮性卵巢癌或其他腫瘤患者對(duì)PARP 抑制劑原發(fā)或獲得性耐藥[16-17]。已有研究發(fā)現(xiàn)了PARP 抑制劑耐藥的機(jī)制，主要集中于細(xì)胞同源重組修復(fù)功能的恢復(fù)。同源重組修復(fù)通路上的重要基因（BRCA1/2、RAD51、PALB2等）通過繼發(fā)性逆轉(zhuǎn)突變或基因內(nèi)缺失恢復(fù)相應(yīng)蛋白的功能，可再次激活同源重組修復(fù)功能，進(jìn)而導(dǎo)致PARP 抑制劑耐藥。本文將對(duì)卵巢癌同源重組修復(fù)基因逆轉(zhuǎn)突變導(dǎo)致PARP 抑制劑耐藥的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 同源重組修復(fù)基因逆轉(zhuǎn)突變

2008 年，Edwards 等[18]利 用 攜 帶BRCA2c.6174delT 移碼突變的人胰腺癌細(xì)胞Capan-1，衍生出PARP 抑制劑耐藥克隆的細(xì)胞。該研究發(fā)現(xiàn)，耐藥克隆的細(xì)胞可以形成DNA 損傷誘導(dǎo)的RAD51核聚集灶，能夠抑制細(xì)胞毒性藥物誘導(dǎo)的基因組不穩(wěn)定。進(jìn)一步研究提示，耐藥細(xì)胞系出現(xiàn)繼發(fā)性基因內(nèi)缺失，可形成逆轉(zhuǎn)突變，恢復(fù)BRCA2的開放閱讀框，進(jìn)而恢復(fù)部分BRCA2的功能。隨后，多項(xiàng)研究在臨床接受化療或PARP 抑制劑治療的腫瘤患者中同樣發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中繼發(fā)性同源重組修復(fù)基因逆轉(zhuǎn)突變是重要的耐藥機(jī)制。

Norquist 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，BRCA1/2逆轉(zhuǎn)突變 與化療耐藥相關(guān)。該研究通過對(duì)攜帶BRCA1/2胚系突變的64 例初治卵巢癌和46 例復(fù)發(fā)卵巢癌患者的腫瘤組織進(jìn)行BRCA1/2突變檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，46例復(fù)發(fā)卵巢癌中有13 例（28.3%）存在逆轉(zhuǎn)突變，而64 例初治卵巢癌僅2 例（3.1%）存在逆轉(zhuǎn)突變（P＜0.01）。該研究26 例鉑類耐藥的復(fù)發(fā)患者中有12例（46.2%）存在繼發(fā)性BRCA1/2逆轉(zhuǎn)突變，而19 例鉑類敏感復(fù)發(fā)患者中僅有1 例（5.3%）存在繼發(fā)性BRCA1/2逆轉(zhuǎn)突變（P=0.003）；結(jié)合功能試驗(yàn)提示，攜帶BRCA1/2胚系突變患者的卵巢癌組織繼發(fā)性體細(xì)胞逆轉(zhuǎn)突變可恢復(fù)BRCA1/2的功能，逆轉(zhuǎn)突變的存在可預(yù)測(cè)機(jī)體對(duì)鉑類藥物及對(duì)PARP 抑制劑的耐藥性。

Lheureux 等[20]在1 例長期（＞7 年）接受奧拉帕利治療獲益的BRCA1基因胚系野生型的鉑敏感復(fù)發(fā)性卵巢高級(jí)別漿液性腺癌患者中發(fā)現(xiàn)，該患者在最初診斷時(shí)腫瘤組織中野生型BRCA1基因等位基因缺失、另一等位基因攜帶W353*無義突變，且腫瘤組織中缺乏能夠恢復(fù)BRCA1 蛋白活性的等位基因，提示該患者可能會(huì)被治愈。因此，研究者認(rèn)為腫瘤組織中BRCA1/2雙等位基因缺失/異?？赡苁菍?duì)PARP 抑制劑長期敏感的潛在標(biāo)志。Barber 等[21]通過對(duì)奧拉帕利耐藥的乳腺癌、卵巢癌患者治療前后穿刺腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，患者均存在BRCA2逆轉(zhuǎn)突變，這些突變能夠恢復(fù)BRCA2 蛋白的功能。Waks 等[22]納入8 例接受PARP 抑制劑和化療耐藥的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，患者均攜帶BRCA1/2突變，收集患者治療前后腫瘤組織或細(xì)胞游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）標(biāo)本，通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)，8 例患者中4 例存在BRCA1/2逆轉(zhuǎn)突變，提示逆轉(zhuǎn)突變可能是乳腺癌對(duì)PARP 抑制劑、化療耐藥的重要機(jī)制。

除BRCA1/2基因外，同源重組修復(fù)的其他基因的逆轉(zhuǎn)突變也與PARP 抑制劑耐藥相關(guān)。Kondrashova 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，盧卡帕利耐藥的復(fù)發(fā)卵巢癌患者腫瘤組織中存在RAD51C和RAD51D基因逆轉(zhuǎn)突變，這些逆轉(zhuǎn)突變能夠恢復(fù)開放閱讀框；進(jìn)一步的功能研究證實(shí)，盧卡帕利耐藥與這些逆轉(zhuǎn)突變相關(guān)。

除卵巢癌、乳腺癌外，胰腺癌患者中繼發(fā)性同源重組修復(fù)基因體細(xì)胞逆轉(zhuǎn)突變也與PARP 抑制劑耐藥相關(guān)。研究顯示，1 例63 歲胰腺導(dǎo)管腺癌患者攜帶BRCA26714 位堿基缺失突變，在接受PARP抑制劑治療后逐漸出現(xiàn)耐藥，研究者在耐藥腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到了BRCA2繼發(fā)性逆轉(zhuǎn)突變，該逆轉(zhuǎn)突變能夠恢復(fù)BRCA2 蛋白的功能[24]。

2 cfDNA 檢測(cè)逆轉(zhuǎn)突變

檢測(cè)cfDNA中突變是近年來逐漸興起的重要的療效監(jiān)測(cè)手段。多項(xiàng)研究對(duì)患者外周血cfDNA 的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，同源重組修復(fù)基因繼發(fā)性逆轉(zhuǎn)突變與PARP 抑制劑耐藥相關(guān)，這為動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)PARP 抑制劑的療效提供了可能。Christie 等[25]的研究共納入30 例攜帶BRCA1/2胚系突變的卵巢高級(jí)別漿液性腺癌患者，包括14 例初治患者和16 例復(fù)發(fā)患者，其中24 例患者采集到配對(duì)的腫瘤組織和血漿標(biāo)本。該研究結(jié)果顯示，5 例患者出現(xiàn)基因內(nèi)逆轉(zhuǎn)突變，恢復(fù)BRCA1/2開放閱讀框，且這5 例患者均為復(fù)發(fā)患者；5 例患者中3 例患者同時(shí)在配對(duì)的血漿cfDNA 中檢測(cè)出基因內(nèi)逆轉(zhuǎn)突變，這些患者對(duì)PARP 抑制劑耐藥。Weigelt 等[26]前瞻性納入24 例BRCA1/2胚系突變的卵巢癌、乳腺癌患者，包括19例鉑耐藥/難治性卵巢癌患者和5 例擬接受鉑類化療和（或）PARP 抑制劑治療的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，該研究對(duì)患者血漿cfDNA 進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序結(jié)果顯示，在4 例卵巢癌患者（21%）和2 例乳腺癌患者（40%）血漿cfDNA 中檢測(cè)出了多樣化、多克隆的BRCA1/2逆轉(zhuǎn)突變，其中1 例乳腺癌患者在PARP 抑制劑治療前cfDNA 中就檢測(cè)出了逆轉(zhuǎn)突變，該患者對(duì)PARP 抑制劑原發(fā)耐藥，PARP 抑制劑治療后cfDNA 中逆轉(zhuǎn)突變進(jìn)一步富集；功能研究表明，部分逆轉(zhuǎn)突變可恢復(fù)BRCA1/2 蛋白的功能。Lin 等[27]對(duì)攜帶BRCA1/2胚系或體系突變的卵巢高級(jí)別漿液性腺癌患者治療前和進(jìn)展后血漿cfDNA 進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鉑難治、鉑耐藥復(fù)發(fā)、鉑敏感復(fù)發(fā)卵巢癌患者cfDNA 中逆轉(zhuǎn)突變率分別為18%（2/11）、13%（5/38）、2%（1/48），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.049）；在盧卡帕利治療患者中，治療前cfDNA 中無BRCA1/2逆轉(zhuǎn)突變患者的中位無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）明顯長于有逆轉(zhuǎn)突變患者（9.0 個(gè)月vs1.8 個(gè)月，HR=0.12，P＜0.01）；對(duì)78 例疾病進(jìn)展患者的cfDNA 進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，8 例患者具有BRCA1/2逆轉(zhuǎn)突變。

ARIEL2 研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性卵巢癌患者盧卡帕利治療前cfDNA、腫瘤組織中共檢測(cè)出10 例（8.9%，10/112）患者存在BRCA1/2逆轉(zhuǎn)突變，這10例患者對(duì)盧卡帕利均不敏感，包括6 例疾病進(jìn)展、4例疾病穩(wěn)定，中位PFS 為1.8 個(gè)月（95%CI：1.7～5.4個(gè)月）[28]。ARIEL4 研究中共有23 例（6.6%）患者攜帶BRCA1/2基因逆轉(zhuǎn)突變，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與化療患者（n=10）相比，盧卡帕利治療患者（n=13）的中位PFS 更短（2.9 個(gè)月vs5.5 個(gè)月，HR=2.769，95%CI：0.989～7.755），該 研 究 也 是 第 一 項(xiàng) 證 實(shí)BRCA1/2基因逆轉(zhuǎn)突變可預(yù)測(cè)PARP 抑制劑耐藥的前瞻性隨機(jī)研究[29]。

此外，在前列腺癌患者血漿cfDNA 中也發(fā)現(xiàn)了BRCA2、PALB2基因逆轉(zhuǎn)突變與奧拉帕利耐藥相關(guān)[30-31]。

3 逆轉(zhuǎn)突變的形成機(jī)制

Tobalina 等[32]對(duì)近年來發(fā)表的BRCA1/2逆轉(zhuǎn)突變相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行總結(jié)，共納入327 例患者，其中卵巢癌234 例、乳腺癌27 例、胰腺癌13 例、前列腺癌11 例、原發(fā)灶不明腫瘤42 例，結(jié)果顯示，327 例患者在接受鉑類藥物或PARP 抑制劑治療后均出現(xiàn)耐藥，其中26%（86/327）患者攜帶BRCA1/2逆轉(zhuǎn)突變，對(duì)這些存在逆轉(zhuǎn)突變的患者進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，BRCA1/2基因11 號(hào)外顯子編碼的大多數(shù)氨基酸序列對(duì)產(chǎn)生鉑類化療或PARP 抑制劑耐藥不是必要的；此外，該研究還發(fā)現(xiàn)，BRCA1/2基因內(nèi)缺失導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)突變形成位點(diǎn)的周圍具有DNA 微同源序列的顯著累積，尤其是BRCA2，這種微同源序列的形成與選擇性非同源末端連接（alternative non-homologous end-joining，Alt-NHEJ）修復(fù)有關(guān)。表明抑制Alt-NHEJ 修復(fù)可減少逆轉(zhuǎn)突變的形成，延長PARP抑制劑的持續(xù)時(shí)間。Alt-NHEJ 是一種獨(dú)特的DNA損傷修復(fù)方式，其與同源重組修復(fù)機(jī)制具有相同的底物，但Alt-NHEJ 是一種易錯(cuò)的修復(fù)機(jī)制，具有高度的誘變性，會(huì)引起染色體重排[33-35]。研究認(rèn)為，Alt-NHEJ 是一種補(bǔ)充修復(fù)機(jī)制，在正常細(xì)胞中，同源重組修復(fù)抑制Alt-NHEJ 修復(fù)機(jī)制，而當(dāng)腫瘤細(xì)胞同源重組修復(fù)和C-NHEJ 修復(fù)異常時(shí)，細(xì)胞的DNA 雙鏈破壞主要通過Alt-NHEJ 機(jī)制修復(fù)，進(jìn)而得以存活[33-34]。微同源末端連接（microhomology-mediated end-joining，MMEJ）是Alt-NHEJ 最重要的修復(fù)方式。BRCA1/2等同源重組修復(fù)基因缺陷卵巢癌細(xì)胞的存活依賴MMEJ 修復(fù)，這種易錯(cuò)的修復(fù)方式會(huì)導(dǎo)致同源重組修復(fù)基因逆轉(zhuǎn)突變，進(jìn)而對(duì)PARP 抑制劑耐藥。因此，抑制MMEJ 修復(fù)是克服PARP 抑制劑耐藥的重要方式。

4 逆轉(zhuǎn)PARP 抑制劑耐藥

POLQ基因編碼的Polθ蛋白（polymerase θ）是一種多功能酶。Polθ同時(shí)具有DNA 聚合酶和解旋酶的功能，是Alt-NHEJ 修復(fù)機(jī)制中重要的蛋白[36]。POLQ基因在細(xì)胞中重要的功能是參與MMEJ 修復(fù)。抑制腫瘤細(xì)胞Polθ的功能可減少M(fèi)MEJ 修復(fù)，進(jìn)而有效抑制因同源重組修復(fù)基因逆轉(zhuǎn)突變而導(dǎo)致對(duì)PARP 抑制劑耐藥。

Zatreanu 等[37]通過細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Polθ聚合酶變構(gòu)抑制劑——ART558，能夠抑制Polθ介導(dǎo)的DNA 損傷修復(fù)，ART558 能夠在BRCA1/2突變腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)DNA 損傷和合成致死效應(yīng)，并增強(qiáng)PARP 抑制劑的作用。Zhou 等[38]通過高通量小分子篩選發(fā)現(xiàn)，抗生素新生霉素（novobiocin，NVB）是Polθ的一種特異性抑制劑，可在體外和體內(nèi)選擇性地殺死HRD 腫瘤細(xì)胞；NVB 可直接與Polθ蛋白的ATPase 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制其ATPase 活性，并消耗Polθ；NVB 在轉(zhuǎn)移瘤模型中可殺死HRD的乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞，PARP 抑制劑獲得性耐藥的BRCA缺陷腫瘤細(xì)胞對(duì)NVB 治療敏感。表明NVB 單獨(dú)或與PARP 抑制劑聯(lián)合均可用于HRD 腫瘤的治療，包括PARP 抑制劑獲得性耐藥的腫瘤患者。Pettitt 等[39]通過生物信息學(xué)軟件NetMHCpan 4.0 對(duì)BRCA1/2基因逆轉(zhuǎn)突變序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，這些逆轉(zhuǎn)突變可編碼新的抗原，因此，這些逆轉(zhuǎn)突變患者可能會(huì)從嵌合抗原受體T 細(xì)胞療法（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）、免疫檢查點(diǎn)抑制劑或抗腫瘤疫苗的治療中獲益。期待未來Polθ抑制劑或BRCA1/2基因逆轉(zhuǎn)突變的新抗原能夠有效改善PARP抑制劑耐藥患者的預(yù)后。

Kim 等[40]在鉑耐藥和繼發(fā)性PARP 抑制劑耐藥患者的移植瘤模型中都觀察到了PARP 抑制劑聯(lián)合共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張和Rad3 相關(guān)激酶（ataxia telangiectasia and Rad3-related kinase，ATR）抑制劑的持久療效；且PARP-ATR 抑制劑對(duì)BRCA1/2基因逆轉(zhuǎn)突變引起的PARP 抑制劑耐藥模型同樣具有良好的療效。因此，PARP-ATR 抑制劑是一種非常有前景的治療策略。由于PARP-ATR 抑制劑在基礎(chǔ)研究中的良好療效，Shah 等[41]和Wethington 等[42]開展了PARP-ATR 抑制劑相關(guān)的CAPRI 研究，該研究旨在評(píng)價(jià)ATR 抑制劑（AZD6738）聯(lián)合PARP 抑制劑（奧拉帕利）治療復(fù)發(fā)性卵巢癌的療效，其中隊(duì)列C 是探討奧拉帕利聯(lián)合AZD6738 在PARP 抑制劑獲得性耐藥的復(fù)發(fā)性卵巢癌中的療效，共納入13 例既往接受PARP 抑制劑治療進(jìn)展的鉑敏感復(fù)發(fā)性卵巢高級(jí)別漿液性癌患者，其中9 例為BRCA1/2胚系突變，3 例為BRCA1/2體系突變，1 例為HRD 陽性，既往PARP 抑制劑治療的中位時(shí)間為13 個(gè)月（4～60 個(gè)月）。上述CAPRI 研究結(jié)果顯示：患者的客觀緩解率為46.2%（6/13），6 例患者均為部分緩解，PFS 為7.5 個(gè)月（95%CI：4.7～NR），沒有患者因不良反應(yīng)退出研究。該研究表明奧拉帕利聯(lián)合AZD6738 具有良好的耐受性，首次提出了ATR 抑制劑在HRD 患者中逆轉(zhuǎn)PARP 抑制劑耐藥性的潛力。

此外，其他針對(duì)PARP 抑制劑耐藥性的研究也在進(jìn)行中，包括WEE1 抑制劑、DNA 依賴性蛋白激酶抑制劑等[43-44]。但因同源重組修復(fù)基因逆轉(zhuǎn)突變導(dǎo)致對(duì)PARP 抑制劑耐藥的患者能否從這些藥物中獲益尚不清楚。

5 小結(jié)與展望

綜上所述，BRCA1/2、RAD51、PALB2基因通過繼發(fā)性逆轉(zhuǎn)突變恢復(fù)同源重組修復(fù)功能是PARP抑制劑耐藥的重要機(jī)制。Polθ、ATR 抑制劑等對(duì)這些PARP抑制劑耐藥腫瘤患者具有良好的療效。隨著越來越多的患者接受PARP 抑制劑治療，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)PARP抑制劑治療患者血漿cfDNA中基因突變情況，有助于指導(dǎo)臨床對(duì)腫瘤患者進(jìn)行精準(zhǔn)治療，評(píng)估臨床療效及患者的預(yù)后。