新型酞菁類光敏劑的合成及其在光動力學抗菌化學療法中的應用

劉曉龍，趙 鑫

（1. 延安大學醫(yī)學院，陜西 延安 716000；2. 錦州醫(yī)科大學醫(yī)療學院，遼寧 錦州 121000）

自1942年青霉素投入使用以來，人類就進入了抗生素治療細菌感染的時代［1］。然而抗生素的濫用導致耐藥細菌廣泛流行，特別是臨床常見的革蘭氏陽性耐藥菌，如肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）［2-3］、耐萬古霉素腸球菌（vancomycin-resistant enterococcus，VRE）［4］和 耐 青 霉素肺炎鏈球菌（penicillin-resistant streptococcus pneumoniae，PRSP）［5-7］等。

光動力學療法（photodynamic therapy，PDT）是光敏劑（photosensitizers，PS）在適當波長的光照下，產(chǎn)生對靶細胞有毒的單線態(tài)氧（1O2）（圖1），殺死靶細胞的一種治療方法。光動力學抗菌化學療法（photodynamic antimicrobial chemotherapy，PACT）是PDT 的衍生療法，其對敏感細菌和耐藥細菌的滅活顯示出極大潛力［8-10］。迄今為止，PACT 已被證明對多種革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌均有滅活效果［11-14］，且細菌很難對活性氧或自由基產(chǎn)生耐藥［15-16］。光敏劑作為PDT/PACT 中的關(guān)鍵材料，要求其具有獨特的結(jié)構(gòu)。近年來，已有以四吡咯為核心的卟啉、卟吩、酞菁等化合物作為PS的研究［17-19］。特別是酞菁（phthalocyanine，PC）化合物，由于其獨特的芳香結(jié)構(gòu)使其在經(jīng)600～800 nm［20-21］波長的光照后能高效率地產(chǎn)生1O2，被認為是一種優(yōu)良的光敏劑。然而PCs在大多數(shù)溶劑中的低溶解性和易發(fā)生聚合等缺點，嚴重地影響菌體內(nèi)單線態(tài)氧的產(chǎn)生效率和利用率，最終使其在PACT 中的使用受到限制。因此，本文通過增加水溶性取代基合成了4 個酞菁化合物，并針對Klebsiella pneumoniae、VRE 和MRSA 3種耐藥菌進行PACT和最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）實驗。

圖1 PACT過程中的能量轉(zhuǎn)移示意圖

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

所有化學試劑購自西格瑪-奧德里奇公司，且無需進一步純化。肺炎克雷伯菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐萬古霉素腸球菌3 種耐藥菌均來自于西京醫(yī)院。細菌菌株的培養(yǎng)采用從OXOID Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基和Mueller-Hinton（MH）肉湯。四甲基硅烷（Tetramethyl silane，TMS）作為內(nèi)標，并在INOVA400 液體超導核磁共振譜儀（瓦里安，美國）上以400 MHz 記錄1H NMR 光譜。在UV8453 光譜儀（安捷倫，美國）上記錄UV-可見吸收光譜。使用Vario ELⅢ元素分析儀進行元素分析。在微型TOF-Q（布魯克）質(zhì)譜儀上獲得高分辨質(zhì)譜（High Resolution Mass Spectrometry，HRMS）結(jié)果。

1.2 有機合成

酞菁化合物6-9的合成按圖2所示路線進行。

1.2.1 中間體合成過程

1.2.1.1 鄰苯二甲酰亞胺（1）的合成 鄰苯二甲酸酐（5 g，33.7 mmol）、尿素（2.45 g，40.8 mmol）于研缽中，混合研細后加入到提前預熱好的100 mL三頸瓶中，攪拌下緩慢加熱到140℃，混合物逐漸變成熔融態(tài)，并有大量氣體放出，且瓶頸上有白色針狀晶體析出，隨后反應體系體積突然增加到原來體積的3 倍，立即給燒瓶中加入40 g 水，冷卻后抽濾，水重結(jié)晶，抽濾，干燥。

1.2.1.2 4-硝基鄰苯二甲酰亞胺（2）的合成 10 mL濃硫酸于50 mL 雙頸瓶中，攪拌下加入3.6 mL 濃硝酸，冰浴條件。待體系溫度低于12℃后，并保持溫度在12～15℃，緩慢加入1（2 g，13.6 mmol），加完后撤去冰浴，室溫反應，反應液逐漸由無色變?yōu)辄S色渾濁液。3 h后升溫至55℃，反應0.5 h，溶液由渾濁變澄清。將上述溶液冷卻到40℃以下后緩慢倒入45 g冰中，立即有大量黃色固體析出，冷卻，抽濾，收集濾液，干燥，乙醇重結(jié)晶，濾去不溶物，冷卻，抽濾。

1.2.1.3 4-硝基鄰苯二甲酰胺（3）的合成 稱取2.4 g（12.5 mmol）4-硝基鄰苯二甲酰亞胺于50 mL圓底燒瓶中，加入12 mL 濃氨水，室溫反應3 h。待反應結(jié)束后，抽濾，5%氨水洗滌，干燥。

1.2.1.4 4-硝基鄰苯二甲腈（4）的合成 量取10 mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺（N，N-Dimethylformamide，DMF）于50 mL 雙頸瓶中，冰鹽浴條件下用恒壓漏斗滴加370 μL 氯化亞砜，滴加完畢后，繼續(xù)攪拌10 min后，分次加入對硝基鄰苯二甲酰胺0.5 g（2.4 mmol），以上步驟保證溫度在5℃以下，繼續(xù)攪拌45 min 后升至室溫繼續(xù)反應2 h 得淺黃色透明溶液。將上述溶液倒入6 g 冰中立即有米黃色固體析出，冷卻，抽濾，5%的碳酸鈉溶液洗滌，干燥。

圖2 酞菁化合物的合成路線

1.2.1.5 中間體5的合成 稱取1.18 g（8.55 mmol）4-硝基鄰苯二甲腈，于50 mL 雙頸瓶中，加入15 mL干燥的二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO），完全溶解得到粉紅色溶液，攪拌下將1.18 g（8.6 mmol）對羥基苯甲酸和1.75 g（12.5 mmol）碳酸鉀倒入燒瓶中，氮氣保護下反應，4 h 和24 h 后分別再次加入1.75 g（12.5 mmol）碳酸鉀。隨反應的進行體系顏色逐漸變?yōu)樽丶t色，橘黃色，反應兩天后，薄層色譜法監(jiān)測并與兩種原料對比發(fā)現(xiàn)有新物質(zhì)產(chǎn)生，繼續(xù)反應1 d。待反應停止后將溶液加入300 mL 水中，有米黃色黏稠狀固體析出，濃鹽酸調(diào)pH 值到1，冷卻，抽濾，少量水洗滌，干燥。

1.2.2 酞菁化合物6-9的合成過程

1.2.2.1 對羥基苯甲酸取代酞菁（6）的合成 稱取480 mg（1.81 mmol）化合物5，35 mL 干燥的正戊醇，1 mL 1,8-二偶氮雜雙螺環(huán)［5.4.0］十一-7-烯于100 mL 雙頸瓶中，160℃回流，氮氣保護。10 h后停止反應，將溶液倒入90 mL 甲醇∶水=1∶3 的溶液中，有黑色固體絮狀物析出，靜置，抽濾，乙醇、甲醇、丙酮、水分別洗滌兩次直到濾液為無色且pH 為中性，干燥。

1.2.2.2 四硝基取代鎳酞菁（7）的合成 取200 mg（1.16 mmol）化合物4 和74.2 mg（0.34 mmol）三氯化鎳，20 mL 無水乙醇于50 mL 燒瓶，升溫至160℃回流3 h，停止反應，冷卻至室溫，抽濾，乙醇、甲醇、丙酮、水分別洗滌兩次直到濾液為無色且pH 為中性干燥，得藍綠色固體115.9 mg。將所得產(chǎn)物用N,N-二甲基甲酰胺和無水乙醚兩種溶重結(jié)晶，抽濾。

1.2.2.3 四硝基取代酞菁（8）的合成 稱取173.13 mg（1 mmol）化合物4于100 mL雙頸瓶中，加入30 mL 干燥的正戊醇，攪拌下加入1 mL 的1,8-二偶氮雜雙螺環(huán)［5.4.0］十一-7-烯，氮氣保護，160℃回流10 h。反應體系逐漸由無色溶液變?yōu)樽鼐G色直到黑色溶液。反應停止，冷卻至室溫后將反應液倒入5 mL 甲醇∶水=1∶3 的溶液中攪拌后有黑色固體析出，靜置，溶液分層，上層是黑色，下層為棕黃色，抽濾得黑色固體，用乙醇、甲醇、丙酮、水分別洗滌直到濾液為中性。

1.2.2.4 四氨基取代酞菁（9）的合成 稱取250 mg（0.33 mmol）化合物8，1.25 g 硫化鈉于50 mL 燒瓶中，加入20 mL H2O，50℃下回流5 h。反應停止后，過濾，用鹽酸（0.5 mmol/L），氫氧化鈉（1.0 mmol/L）溶液反復洗滌3次，再用水洗至中性，70℃烘干。

1.3 抗菌活性評價

1.3.1 MIC 的測定 MIC 的測定選用常量肉湯稀釋法，參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的具體操作方法［22］。以化合物6-9 作為抑菌藥物，對肺炎克雷伯菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐萬古霉素腸球菌三種細菌進行MIC 評價。將固體Luriae-Bertani（LB）平板上的上述細菌單菌落轉(zhuǎn)移到10 mL Muellere-Hinton（MH）培養(yǎng)基中，在35℃下培養(yǎng)2～6 h，獲得108CFU/mL 菌液。準備750 μg/mL 的化合物6-9的二甲基亞砜溶液，將制備的6-9溶液用MH培養(yǎng)基稀釋至1 mL，使每管中化合物6-9 的濃度分別 為375 μg/mL、187 μg/mL、93 μg/mL、46 μg/mL、23 μg/mL、12 μg/mL、6 μg/mL、3 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL和0.5 μg/mL。1 mL細菌培養(yǎng)物依次添加到制備的溶液中，然后將混合物在37℃下孵育24 h，觀察化合物的滅菌效果。

1.3.2 化合物6-9 的PACT 實驗 PACT 實驗根據(jù)文獻所述方法進行［23］。37℃下挑取肺炎克雷伯菌，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐萬古霉素腸球菌的單克隆體在20 mL 液體LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。4°C 下離心（4000 rpm，10 min）收集菌斑，用0.01 M的PBS 清洗3～6 次，稀釋至O.D.600=0.5。準備濃度分別為4 μM，8 μM，12 μM，16 μM，20 μM 的化合物6-9 溶液。取0.5 mL 不同濃度的樣品與0.5 mL的菌液混合在37℃的條件下孵育30 min，用400-800 nm的氙燈光源（350 mW）照射3 min，總光劑量為35 J/cm2。光源照射后的樣品再離心（4°C，4 000 rpm，10 min），棄去上清液，用0.01 M 的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）重懸兩次后，用0.01 M的PBS 稀釋2.5×103倍，取15 μL 均勻涂布在LB 固體培養(yǎng)基上，37℃下在恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，計算生長出的單克隆體的個數(shù)，以未光照的樣品為空白，計算樣品對這3種菌的光動力學滅活率，為了便于誤差分析，每個實驗重復3遍。

2 結(jié)果

2.1 化合物4-9的表征結(jié)果

化合物4（產(chǎn)率：55.4%）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 8.56-8.58（d，1H），8.28（s，1H），8.19-8.22（d，1H）。

化合物5（產(chǎn)率：43.4%，米黃色固體）。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ 8.15-8.17（d，2H），7.77-7.79（d，1H），7.36（s，1H），7.29-7.31（d，1H），7.13-7.15（d，2H）。

化合物6（產(chǎn)率：47%，藍黑色固體）。元素分析：C32H22N12?8.2H2O，理論值：碳（C），54.43%；氫（H），3.12%；氮（N），23.82%。實際值：碳（C），54.35%；氫（H），3.12%；氮（N），23.73%。UV-vis（DMF，λmax，nm）：606，637，663，666，699。HRMS（ESI）理論值：C60H33N18O12［M-H］-1057.2220，實際值：1057.1988。

化合物7（產(chǎn)率：49%，墨綠色固體）。元素分析：C32H22N12Ni?6.2H2O，理論值：碳，62.20%；氫，4.00%；氮，11.05%。實際值：碳，60.15%；氫，3.82%；氮，11.13%。UV-vis（DMF，λmax，nm）：636，671。 HRMS（ESI）理 論 值C32H13N12O8Ni［M+H］+708.1134，實際值：708.1202。

化合物8（產(chǎn)率：36.74%，黑色固體）。元素分析：C32H14N12O8?5.6H2O，理論值：碳（C），56.48%；氫（H），3.15%；氮（N），21.18%。實際值：碳（C），56.35%；氫（H），3.22%；氮（N），21.35%。UV-vis（DMF，λmax，nm）：661，728。HRMS（ESI）理論值：C32H14N12O8［M+H］+695.1134，實際值：695.1189。

化合物9（產(chǎn)率：60%，黑色固體）。元素分析：C32H22N12?8.2H2O，理論值：碳（C），氫（H）3.12%；氮（N）%。實際值：碳（C），54.35%；氫（H），3.12%；氮（N），23.73%。UV-vis（DMF，λmax，nm）：661，732。HRMS（ESI）理論值：C60H33N18O12［M+H］+575.2166，實際值：575.2102。

元素分析結(jié)果、紫外數(shù)據(jù)及高分辨質(zhì)譜可得化合物4-9的結(jié)構(gòu)為圖2中的目標結(jié)構(gòu)。

2.2 MIC結(jié)果

化合物6-9 對肺炎克雷伯菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐萬古霉素腸球菌的MIC 結(jié)果如表1所示。從表中結(jié)果可以看出，化合物6-9 對所有的測試菌的MIC 值均大于128 μg/mL，表明化合物6-9本身不能滅活3種測試菌。

表1 化合物6-9的MIC值（μg/mL）

2.3 光動力學滅菌結(jié)果

從化合物6-9 的MIC 結(jié)果可以看出所有化合物對三種耐藥細菌均無滅活作用。在進一步的PACT 實驗中我們依然選用肺炎克雷伯菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐萬古霉素腸球菌這3 種耐藥菌作為待測菌株。針對不同濃度化合物6-9的光動力滅菌效果見圖3。圖3 中的結(jié)果顯示隨著化合物6-9 濃度的增加，這4 種化合物對3 種耐藥細菌的光滅活作用均增強，表明化合物6-9 的光滅活作用均呈劑量依賴性。特別是化合物6，當其濃度為4 μmol/L 時，對3 種耐藥菌的滅活率約80%，當濃度為6 μmol/L 時對三種耐藥細菌的滅活率均超過90%（圖3A）；對硝基取代的鎳酞菁7 而言，其濃度為10 μmol/L 時對Klebsiella pneumoniae 和VRE的滅活率約50%，而對MRSA 的滅活率僅為20%（圖3B）；化合物8 雖然對3 種耐藥菌都有一定的滅活效果，但對3 種菌的光滅活作用均很弱（10 μmol/L 時的滅菌率低于40%，圖3C）；氨基取代的酞菁化合物9 顯示出與化合物7 相似的光滅活效果，其在10 μmol/L 下 對MRSA 的 滅 活 率 超 過40%，而 對VRE 和MRSA 兩種耐藥菌的滅活率不到40%（圖3D）。

圖3 化合物6-9的光動力學滅菌結(jié)果

3 討論

PACT 作為一種能有效滅活耐藥細菌的方法，其光敏劑的選擇意義重大。本研究中通過有機合成的方法合成了4 種酞菁類化合物（6-9），并將這4種酞菁化合物作為光敏劑測試了其對肺炎克雷伯菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐萬古霉素腸球菌這3種耐藥細菌的MIC值和光動力滅菌效果。實驗結(jié)果表明化合物6-9 對3 種耐藥菌的MIC 值均＞128 μg/mL，表明化合物本身對3 種細菌均無滅活作用；PACT 實驗結(jié)果表明，化合物6-9 分別對3 種耐藥菌有一定程度的滅活作用，特別是苯甲酸取代的化合物6，隨其濃度的升高，光動力滅菌效果增強，當其濃度為6 μmol/L 時對3 種耐藥細菌的滅活率均超過90%，顯示出優(yōu)秀的光動力滅菌效果。上述結(jié)果表明，酞菁化合物是一類優(yōu)秀的光敏劑，且通過增加酞菁化合物的溶解度可有效提高其光動力滅菌效果。