糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的亮氨酸拉鏈蛋白在糖皮質(zhì)激素作用中的角色及分子機(jī)制

周 紅

（遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563006）

1 前言

內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids，GCs）是人體內(nèi)一種重要的甾體類激素，由腎上腺皮質(zhì)中的束狀帶所分泌，受下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamicpituitary-adrenal axis，HPA）的調(diào)控，參與物質(zhì)代謝，協(xié)調(diào)對外源性刺激的生理反應(yīng)，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)［1］。GCs 由于其強(qiáng)大的抗炎與免疫抑制作用被廣泛用于自身免疫性疾病和炎癥相關(guān)性疾病的治療。然而任何藥物都是一把雙刃劍，在發(fā)揮其治療作用的同時(shí)，不可避免地會(huì)存在一定的不良反應(yīng)，GCs也不例外。長期或者大劑量使用會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如免疫抑制、高血壓、高血糖、骨質(zhì)疏松、情緒障礙、庫欣綜合征、糖皮質(zhì)激素抵抗等［2］，尤其是免疫抑制嚴(yán)重限制了GCs 的應(yīng)用。近些年來發(fā)現(xiàn)的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的亮氨酸拉鏈蛋白（glucocorticoidinduced leucine zipper protein，GILZ））能被GCs 穩(wěn)定而快速地誘導(dǎo)表達(dá)［3］，廣泛分布在多種組織和細(xì)胞中，可以介導(dǎo)GCs 的抗炎與免疫抑制作用［4］，而且GILZ 在發(fā)揮作用的同時(shí)沒有GCs的嚴(yán)重不良反應(yīng)，因此研究GILZ 在GCs 中的作用及其分子機(jī)制對尋找替代GCs的藥物及藥物靶點(diǎn)具有重要意義。

2 GILZ的結(jié)構(gòu)

1997 年D'Adamio 等在研究GCs 對淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)并發(fā)現(xiàn)GILZ［3］。人GILZ 屬于TSC22D 蛋白質(zhì)家族的成員，由TSC22D3 基因編碼，是被GCs 調(diào)控的早期靶基因，在免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞中均可被GCs 上調(diào)［5］。目前，研究發(fā)現(xiàn)GILZ 是GCs 的重要下游執(zhí)行分子，但是又不完全等同于糖皮質(zhì)激素的效應(yīng)，因此其作用和角色越來越受到研究者的重視。

人GILZ 蛋白質(zhì)由137 個(gè)氨基酸殘基組成，有3 個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域：N 端結(jié)構(gòu)域（位于第1～75 氨基酸）、亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域（leucine zipper domain，LZ，位于第76～97 氨基酸）、C 端富含脯氨酸及谷氨酸殘基（位于第98～137 氨基酸），不含明顯的DNA 結(jié)合序列。GILZ 發(fā)揮作用需要其同源二聚化，而LZ 結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)GILZ 的同源二聚化中發(fā)揮重要作用。GILZ 的N 端和C 端結(jié)構(gòu)域是GILZ 與其他蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用的結(jié)構(gòu)域，尤其是與轉(zhuǎn)錄和信號分子的相互作用，而這些相互作用對GILZ乃至GCs的抗炎和免疫抑制作用至關(guān)重要［6］。也有研究發(fā)現(xiàn)，GILZ與其他蛋白分子尤其是和轉(zhuǎn)錄因子的相互作用與LZ 結(jié)構(gòu)域、C-末端結(jié)構(gòu)域（特別是121～123 位氨基酸）均密切相關(guān)［7］；而N 端結(jié)構(gòu)域是GILZ-Raf 相互作用調(diào)節(jié)MAPK通路所必需的［8］。

3 GILZ 在GCs 介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路中的作用

GCs產(chǎn)生的藥理學(xué)效應(yīng)包括治療作用和不良反應(yīng)，多數(shù)均為通過糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）介導(dǎo)的效應(yīng)。GR 是NR3C1 基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族成員［9］。由于GCs是親脂性激素，很容易跨過細(xì)胞膜，從而與胞質(zhì)內(nèi)GR 結(jié)合；當(dāng)GCs 與GR 結(jié)合形成激素-受體復(fù)合物后GR 發(fā)生構(gòu)象變化并進(jìn)入細(xì)胞核，然后與糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件（glucocorticoid response elements，GREs）結(jié)合，激活或抑制靶基因的表達(dá)從而發(fā)揮作用。

GCs對基因表達(dá)的調(diào)控作用可以分為反式激活和反式抑制作用兩種［10］。在反式激活作用中，除了抗炎作用蛋白的表達(dá)增加外，參與葡萄糖和脂質(zhì)代謝的酶也被激活，導(dǎo)致高血糖和肌肉萎縮等代謝相關(guān)作用的出現(xiàn)。因此，有研究者提出通過調(diào)節(jié)GR活性將GCs 的治療作用與副作用分離，從而設(shè)計(jì)有利于發(fā)揮反式抑制作用的選擇性GR 激動(dòng)劑（selective glucocorticoid receptor agonists，SEGRA）或調(diào)節(jié)劑（selective glucocorticoid receptor modulators，SEGRM）［11］，然而上述設(shè)想并未實(shí)現(xiàn)。為此，研究者們又將目光聚焦到GCs 誘導(dǎo)的具有抗炎活性的蛋白質(zhì)GILZ，由于GILZ 位于GR 的下游，因此推測不會(huì)產(chǎn)生糖皮質(zhì)激素抵抗的現(xiàn)象［12］。

4 GILZ的作用機(jī)制

隨著人們對GILZ 的抗炎和免疫抑制作用的認(rèn)識，GILZ與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用以及細(xì)胞水平上介導(dǎo)的GCs的免疫抑制作用成為人們的研究焦點(diǎn)。

4.1 GILZ與NF-κB

NF-κB 是非常重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在機(jī)體中發(fā)揮重要而廣泛的調(diào)控作用，尤其是在免疫系統(tǒng)中。NF-κB 調(diào)控的基因幾乎涵蓋機(jī)體所有的免疫反應(yīng)，如與調(diào)控趨化因子、細(xì)胞因子、黏附分子、細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)［13］。NF-κB 以二聚體形式發(fā)揮作用，最常見的二聚體是NF-κB p65 與NF-κB p50 組成的異源二聚體，其中NF-κB p65是最重要的亞單位。

最初，Ayroldi 等［7］發(fā)現(xiàn)GILZ 可直接與NF-κB結(jié)合并抑制其激活。GILZ 的高表達(dá)可抑制NF-κB p65 的核轉(zhuǎn)位，但并不影響NF-κB 的抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）的磷酸化和降解，也不影響IκB 與NF-κB 的結(jié)合。Berrebi 等［14］在巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，GILZ 與NF-κB p65 亞單位結(jié)合，抑制如共刺激分子CD80 和CD86 的表達(dá)。在樹突狀細(xì)胞中，過度表達(dá)的GILZ 會(huì)通過干擾NF-κB 參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)的T 細(xì)胞活化、T 細(xì)胞耐受效應(yīng)［15］。在B細(xì)胞中，缺乏GILZ 會(huì)引起NF-κB 轉(zhuǎn)錄活性增加，導(dǎo)致非致死性B 淋巴細(xì)胞增多癥的發(fā)生［16］。在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，GILZ 通過抑制NF-κB 發(fā)揮抑制環(huán)氧酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）表達(dá)的作用，敲除GILZ 基因則能降低GCs 對COX-2 表達(dá)的抑制作用［17］。在人脂肪細(xì)胞中，GILZ 通過抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)位，抑制TNF-α 的表達(dá)［18］。上述研究表明，NF-κB 與GILZ 發(fā)揮抗炎和免疫抑制作用密切相關(guān)。

4.2 GILZ與轉(zhuǎn)錄激活因子1

核轉(zhuǎn)錄激活因子1（activator protein 1，AP-1）是炎癥反應(yīng)中免疫細(xì)胞激活的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子之一，GILZ 可以通過其N 末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合AP-1，從而抑制AP-1 的活化，該作用有助于GCs 通過GR 非依賴方式調(diào)節(jié)AP-1 的活化。有研究發(fā)現(xiàn)，在GILZ 缺陷小鼠中，B 細(xì)胞中IFN-γ 表達(dá)增加，該作用與GILZ減少后GILZ 結(jié)合AP-1 減少，導(dǎo)致AP-1 核轉(zhuǎn)位增加有關(guān)。因此，AP-1介導(dǎo)的IFN-γ 表達(dá)增加與B 細(xì)胞功能增強(qiáng)以及炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［19］。

4.3 GILZ與MAPK

MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)機(jī)體眾多的生理、病理過程如細(xì)胞生長、分化、應(yīng)激和炎癥反應(yīng)［20］，AP-1復(fù)合物的活性受到c-Jun 和c-Fos 的調(diào)控。GILZ 可以通過與MAPK 家族成員的Raf-1 蛋白激酶發(fā)生相互作用，導(dǎo)致Raf-1 蛋白激酶的磷酸化作用受到抑制，從而抑制MEK／ERK 的磷酸化和AP-1 依賴的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄過程［8］。

5 GILZ對免疫系統(tǒng)的影響

5.1 GILZ對先天性免疫系統(tǒng)的影響

先天性免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵抗細(xì)菌、病毒等外源性有害微生物侵入的第一道防線，包括單核/巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞等。

在巨噬細(xì)胞中，GILZ 是膜聯(lián)蛋白A1（annexin A1，ANXA1）發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵分子。ANXA1 通過GILZ 抑 制TNF-α 和IL-6 的 表 達(dá)，進(jìn) 而 抑 制MAPK 通路的激活，達(dá)到抑制巨噬細(xì)胞對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）反應(yīng)的目的［21］。在人肺泡巨噬細(xì)胞中，GILZ 能下調(diào)Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）的表達(dá)，減少前炎癥細(xì)胞因子的釋放，從而抑制巨噬細(xì)胞的吞噬和殺傷作用［22］。在膿毒性休克小鼠模型中，單核/巨噬細(xì)胞中的GILZ 可以抑制全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生［23］。因此，GILZ目前已經(jīng)成為治療膿毒癥的潛在靶點(diǎn)。

在樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）中，GILZ 可抑制組織相容復(fù)合體Ⅱ（histocompatibility complex，MHC Ⅱ）類分子、共刺激因子的產(chǎn)生以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）的生成［24］。在敲除GILZ（GILZ-KO）的骨髓源性DC 中，TLR4 和TLR7介導(dǎo)的細(xì)胞因子如IL-1α、IL-1β、IL-6 和IL-23 的產(chǎn)生顯著增加，可以阻止DC激活抗原特異性T細(xì)胞的反應(yīng)。敲除GILZ 的DCs 可增加CD4+和CD8+T 細(xì)胞中IFN-γ 和IL-17 的產(chǎn)生［25］。GILZ 尚可以調(diào)節(jié)DC 的抗原捕獲和交叉呈遞能力，調(diào)節(jié)抗原內(nèi)化和提呈功能。此外，DC 中GILZ 過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞未成熟表型的形成和IL-10 的產(chǎn)生，同時(shí)抑制輔助性T 細(xì)胞中Th1、Th17 型細(xì)胞因子的分泌，從而有利于DC耐受表型的形成［15］。

在嗜中性粒細(xì)胞中，GILZ可通過ANXA1抑制中性粒細(xì)胞向炎癥部位的遷移，抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成和炎癥部位嗜中性粒細(xì)胞的聚集，也可誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞凋亡以減輕炎癥反應(yīng)［26］。在GILZ-KO 小鼠中復(fù)制的白色念珠菌感染或者急性結(jié)腸炎模型中，嗜中性粒細(xì)胞的狀態(tài)呈現(xiàn)出更為活躍的表型，而野生型小鼠來源的細(xì)胞則表現(xiàn)出較低的活化程度［27］。在向成熟嗜中性粒細(xì)胞系分化的細(xì)胞系中，過表達(dá)的GILZ 通過激活JNK途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡［28］。在來源于急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）患者肺泡中的嗜中性粒細(xì)胞中，約75%經(jīng)過GCs 治療患者的中性粒細(xì)胞中GILZ表達(dá)上調(diào)［29］。

5.2 GILZ對適應(yīng)性免疫的影響

在T 細(xì)胞中，GILZ 主要通過抑制T 細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮作用，包括MAPK-ERK、PI3K-AKT和NF-κB途徑等［8，30］，這些途徑均與控制TCR 觸發(fā)后的細(xì)胞生長和炎癥過程密切相關(guān)。抑制GILZ 的過度表達(dá)可以抑制與上述途徑相關(guān)的抗CD3誘導(dǎo)的IL-2產(chǎn)生、IL-2受體的表達(dá)以及Fas和FasL 的上調(diào)，表明GILZ 可以抑制T 細(xì)胞的活化［31］。IL-2 是活化T 細(xì)胞的主要白細(xì)胞介素，通過抑制叉型頭轉(zhuǎn)錄因子FoxO3調(diào)控GILZ 的表達(dá)中發(fā)揮作用［32］。此外，抗原誘導(dǎo)的T 細(xì)胞活化可以反過來降低GILZ的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，再次表明GILZ 與T 細(xì)胞的活化密切相關(guān)。與GCs類似，GILZ 促進(jìn)從Th1 到Th2 免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)換。在野生型小鼠中，過表達(dá)的GILZ轉(zhuǎn)基因小鼠的CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生更多的Th2型細(xì)胞因子（IL-4、IL-13）和更少的Th1 型細(xì)胞因子（IL-1β、IFN-γ）［33］。在Sjogren綜合征小鼠模型中，GILZ過表達(dá)可抑制唾液腺細(xì)胞中IL-17 的產(chǎn)生；而在Th17 細(xì)胞活性增強(qiáng)的銀屑病患者中，GILZ表達(dá)則為抑制狀態(tài)［34-35］。

GILZ 還與Treg 的分化有關(guān)。我們知道，Treg 是在骨髓中積聚的T細(xì)胞亞群，通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、維持對自身抗原的耐受性，防止自身免疫性疾病的發(fā)生。T 細(xì)胞中GILZ 敲除的小鼠可出現(xiàn)免疫穩(wěn)態(tài)的喪失和自身免疫反應(yīng)，其外周（而非胸腺）Treg 生成受損。采用化學(xué)方式誘導(dǎo)Th1 型結(jié)腸炎的發(fā)生，GILZ-KO 小鼠表現(xiàn)出更強(qiáng)的炎癥易感性。GCs 治療可增加野生型小鼠的Treg 數(shù)量和功能，減輕結(jié)腸炎癥狀；但GILZ 缺陷小鼠則無此反應(yīng)，表明GCs 的免疫抑制作用至少部分依賴于GILZ，與其調(diào)控Treg的功能密切相關(guān)［36］。

GILZ 在骨髓、脾臟或其他外周器官的B 細(xì)胞中均高度表達(dá)。在骨髓細(xì)胞中，GILZ 在B 細(xì)胞發(fā)育的各階段都有表達(dá)［16］。與T 細(xì)胞活化類似，B 細(xì)胞受體（B cell receptor，BCR）的活化可抑制GILZ 的表達(dá)，GILZ 下調(diào)則反過來促進(jìn)B 細(xì)胞的活化［37］。在GILZ-KO 小鼠模型中，GILZ 介導(dǎo)GCs 對B 細(xì)胞生長和凋亡的調(diào)控作用消失［16］。敲除GILZ 小鼠的B 細(xì)胞中IFN-γ的產(chǎn)生增加，對炎癥刺激的反應(yīng)增強(qiáng)［19］。

6 GILZ 在自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展中的作用以及潛在應(yīng)用價(jià)值

自身免疫性疾病是因機(jī)體免疫功能紊亂而出現(xiàn)的慢性疾病，嚴(yán)重危害人類的身體健康和生存質(zhì)量。常見的自身免疫性疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化癥等［38］。

來自系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的臨床研究顯示，人外周血單個(gè)核細(xì)胞、B 細(xì)胞中GILZ mRNA 呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，低表達(dá)程度與病情的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)；經(jīng)過GCs 治療的患者其GILZ mRNA 表達(dá)顯著增加［14，39］，表明GILZ表達(dá)降低程度與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。在靶向納米載體中輸注含有編碼GILZ mRNA 的納米顆粒，該納米藥物可有效控制系統(tǒng)性紅斑狼瘡的疾病進(jìn)展［40］。

在膠原誘導(dǎo)的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型中，GCs治療能減輕模型小鼠的相關(guān)指標(biāo)，GILZ的表達(dá)也隨之改變。采用siRNA 沉默小鼠的GILZ，小鼠關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度增加。在體外實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)GILZ則能抑制人類滑膜細(xì)胞中趨化因子和細(xì)胞因子產(chǎn)生。上述結(jié)果表明，GILZ 是關(guān)鍵的內(nèi)源性調(diào)節(jié)分子，并可能成為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在治療靶點(diǎn)［41］。

基于過表達(dá)GILZ 能減緩自身免疫性疾病的發(fā)生、減輕其嚴(yán)重程度的認(rèn)識，人們制備了含有GILZ全長的融合蛋白TAT-GILZ。在二硝基苯磺酸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中，TAT-GILZ 通過抑制NF-κB的活化從而調(diào)控腸道中的CD4+T 細(xì)胞的功能，減輕了IL-10 基因敲除小鼠自發(fā)性結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度［42］。在B 細(xì)胞條件性敲除GILZ 小鼠的結(jié)腸炎模型中，TAT-GILZ治療3天即可逆轉(zhuǎn)模型小鼠的結(jié)腸炎表現(xiàn)［19，43］。在急性腎損傷模型中，TAT-GILZ 能促進(jìn)N2嗜中性粒細(xì)胞的生長，并抑制N1表型，恢復(fù)N1/N2平衡，從而有利于腎臟功能的恢復(fù)［44］。

在模擬人多發(fā)性硬化癥的實(shí)驗(yàn)性腦脊髓炎小鼠模型中，采用來自GILZ 的多肽（具有富含脯氨酸的羧基端）進(jìn)行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多肽可以通過結(jié)合NF-κB p65 從而抑制前炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)、減輕疾病的嚴(yán)重程度［45］。

7 結(jié)語

近年來，為得到既保留GCs 的抗炎作用，又減少GCs 免疫抑制作用的藥物，作為GCs 作用路徑的下游分子，GILZ 受到了極大的關(guān)注。GILZ 的表達(dá)情況與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，增加其表達(dá)或者補(bǔ)充該蛋白可有效降低自身免疫性疾病的嚴(yán)重程度。因此，深入研究GILZ的作用及其分子機(jī)制，有助于尋找替代GCs 用于治療炎癥性和自身免疫性疾病的藥物。