破囊壺菌屬微生物中超長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的生物合成及其代謝工程應(yīng)用

謝曦，陳碧翰，羅俊鍇，郭梓蔚，王琴，肖更生，劉東杰，林蠡，劉袆帆*

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東省嶺南特色食品科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510631）

（2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510631）

超長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（very long chain polyunsaturated fatty acids，VLCPUFAs），是指含有超過(guò)18個(gè)碳原子，2個(gè)以上雙鍵的一類(lèi)脂肪酸。目前VLCPUFAs根據(jù)其雙鍵位置有兩種命名系統(tǒng)，第一種是“ω”命名法，該系統(tǒng)根據(jù)甲基端第一個(gè)雙鍵碳原子的位置命名，這種命名系統(tǒng)多用于劃分結(jié)構(gòu)相似的一類(lèi)脂肪酸。如二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA），因其甲基端第一個(gè)雙鍵落在第三個(gè)碳原子上，因此這類(lèi)脂肪酸統(tǒng)稱(chēng)為“ω3”脂肪酸。而花生四烯酸（arachidonic acid，ARA），因其第一個(gè)碳-碳雙鍵落在第六個(gè)碳原子上，因此稱(chēng)其為“ω6”脂肪酸。第二種為“Δ”命名法，多用于描述雙鍵合成的過(guò)程，它是從羧基端開(kāi)始計(jì)算，以“Δ”引導(dǎo)符號(hào)用數(shù)字標(biāo)注每一個(gè)雙鍵的位置。以ARA（C20:4ω6 Δ5，8，11，14）為例，“20”表示主鏈由20個(gè)碳原子組成；“4”表示主鏈中含4個(gè)雙鍵；“Δ”右上角的數(shù)字表示從主鏈羧基端開(kāi)始計(jì)數(shù)，第5、8、11、14個(gè)碳原子位置各連著一個(gè)雙鍵[1]。大量研究表明，VLCPUFAs（包括EPA和DHA）在維護(hù)生物膜結(jié)構(gòu)和功能、提高機(jī)體免疫能力、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、調(diào)節(jié)脂類(lèi)代謝以及相關(guān)基因表達(dá)等方面作用非凡[2]。VLCPUFAs還對(duì)降低血栓形成、減少心血管疾病發(fā)病率、抵抗癌癥等有積極的預(yù)防和輔助治療作用[3]。同時(shí)，多項(xiàng)臨床研究表明EPA和DHA是構(gòu)成調(diào)節(jié)機(jī)體機(jī)能的最高中樞-大腦皮層灰質(zhì)的主要脂肪酸之一，它可參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、視紫紅質(zhì)激活等，它對(duì)于運(yùn)動(dòng)能力、注意力和記憶功能有正面效應(yīng)[4]。DHA是神經(jīng)保護(hù)素D1（Neuroprotectin D1，NPD1）的前體，可響應(yīng)氧化應(yīng)激和激活神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素，以維持神經(jīng)穩(wěn)態(tài)。也可通過(guò)調(diào)節(jié)抗炎信號(hào)級(jí)聯(lián)來(lái)保護(hù)神經(jīng)元和感光細(xì)胞，從而防止大腦和視網(wǎng)膜損傷[5]。另外一些研究發(fā)現(xiàn)二十碳類(lèi)VLCPUFAs可在哺乳動(dòng)物組織和細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過(guò)不同的途徑合成幾類(lèi)重要的信號(hào)分子，如通過(guò)花生四烯酸在環(huán)加氧酶作用下先轉(zhuǎn)化為環(huán)內(nèi)過(guò)氧化物，之后在不同異構(gòu)酶的作用下轉(zhuǎn)化為前列腺素、血栓素、前列環(huán)素等；花生四烯酸也可在脂加氧酶作用下合成白三烯及其他羥二十四碳四烯酸[6]。因此，適當(dāng)?shù)財(cái)z入VLCPUFAs對(duì)維持人體健康、保持人類(lèi)正常機(jī)體功能上起到重要的作用（圖1）。

目前，EPA、DHA等常見(jiàn)VLCPUFAs產(chǎn)品主要是通過(guò)捕撈深海魚(yú)類(lèi)提取所得，深海魚(yú)類(lèi)是人類(lèi)獲得VLCPUFAs的重要天然來(lái)源，隨著全球氣候變暖、過(guò)度捕撈、環(huán)境污染等因素，使得海洋魚(yú)類(lèi)資源日趨減少，制約了利用海洋魚(yú)類(lèi)提取VLCPUFAs產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。同時(shí)魚(yú)油中VLCPUFAs的構(gòu)成和含量隨著深海魚(yú)類(lèi)的種類(lèi)、季節(jié)、地理環(huán)境的不同而變化，使得提取的魚(yú)油中VLCPUFAs的含量和組成會(huì)產(chǎn)生較大的差別，生產(chǎn)出的魚(yú)油產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，難以滿(mǎn)足市場(chǎng)對(duì)魚(yú)油產(chǎn)品高質(zhì)量的要求[7]。如何研究開(kāi)發(fā)出新的穩(wěn)定、可控、高產(chǎn)、可持續(xù)、低成本的VLCPUFAs來(lái)源從而擺脫VLCPUFAs產(chǎn)業(yè)對(duì)海洋魚(yú)類(lèi)的高度依賴(lài)，已經(jīng)擺在從事VLCPUFAs類(lèi)產(chǎn)品加工、銷(xiāo)售者的面前。

研究表明，海洋微藻、原始真菌和原生生物等能在細(xì)胞膜或儲(chǔ)存性脂質(zhì)中積累ARA、EPA、二十二碳五烯酸（docosapentaenoic acid，DPA）和DHA等多種具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的VLCPUFAs[8,9]。相比于深海魚(yú)油等常規(guī)的VLCPUFAs來(lái)源，微生物源的VLCPUFAs具有無(wú)魚(yú)腥味、低膽固醇、低雜質(zhì)、受環(huán)境影響少、產(chǎn)量質(zhì)量穩(wěn)定、脂肪酸組分簡(jiǎn)單和提取容易等諸多優(yōu)勢(shì)，極具開(kāi)發(fā)價(jià)值。如澳大利亞等一些國(guó)家的生物技術(shù)公司已開(kāi)始嘗試培養(yǎng)海洋微藻或破囊壺菌等海洋微生物以替代深海魚(yú)類(lèi)作為VLCPUFAs原料進(jìn)行EPA和DHA的生產(chǎn)，取得一定的進(jìn)展，已經(jīng)有成批量的產(chǎn)品投放市場(chǎng)。

1 破囊壺菌屬微生物

破囊壺菌（Thraustochytrids）、屬于Stramenopila界、Heterokonta門(mén)、Labyrinthulomycetes綱、Thraustochytriales目、Thraustochytriaceae科的異養(yǎng)型原生生物。破囊壺菌廣泛分布于海洋、鹽水湖以及紅樹(shù)林地區(qū)，因其外觀形態(tài)像“破囊菌”，而釋放孢子的形式像“壺菌”，因此命名為破囊壺菌[10]?？茖W(xué)家前期對(duì)這些微生物的脂質(zhì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)Thraustochytriaceae科中的一部分微生物，包括Thraustochytriumsp.（又稱(chēng)破囊壺菌）、Schizochytriumsp.（又稱(chēng)裂殖壺菌）、Ulkeniasp.、Aurantiochytriumsp.（又稱(chēng)橙黃壺菌）和Hondaeasp.能積累大量EPA、DPA和DHA等多不飽和脂肪酸[11]（圖2）。更有研究指出這些破囊壺菌屬微生物能夠廣泛地利用碳源和氮源作為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，生長(zhǎng)快速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、能積累大量VLCPUFAs，具有大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的潛力[12]（表1）。

表1 破囊壺菌屬微生物中多不飽和脂肪酸的組成及含量 Table 1 Composition and content of polyunsaturated fatty acids from Thraustochytrids

2 破囊壺菌屬微生物的VLCPUFAs的生物合成途徑

自1989年澳大利亞科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)破囊壺菌能積累DHA以來(lái)，科學(xué)家們對(duì)破囊壺菌中多不飽和脂肪酸的生物合成途徑開(kāi)展了研究[21]。目前基本探明了在自然界中，破囊壺菌屬微生物能通過(guò)有氧合成途徑和無(wú)氧合成途徑來(lái)合成VLCPUFAs。

2.1 有氧合成途徑及其關(guān)鍵酶

有氧合成途徑普遍存在于動(dòng)物、植物和真核微生物體內(nèi)，這些生物體內(nèi)的VLCPUFAs主要是以長(zhǎng)鏈脂肪酸為前體，通過(guò)一系列的延長(zhǎng)酶（添加兩個(gè)碳原子）和去飽和酶（導(dǎo)入一個(gè)雙鍵）的交替作用合成的。

2.1.1 脂肪酸延長(zhǎng)酶

脂肪酸的延長(zhǎng)過(guò)程發(fā)生在真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，其經(jīng)由脂肪酸延長(zhǎng)酶催化，向酯酰鏈添加兩個(gè)碳原子來(lái)延長(zhǎng)多不飽和脂肪酸的鏈長(zhǎng)。脂肪酸延長(zhǎng)酶是一個(gè)復(fù)合酶，由四個(gè)復(fù)合體共同催化完成一次延伸反應(yīng)：由β-酮酰基輔酶A合成酶（β-ketoacyl-CoA synthase，KCS）催化兩個(gè)碳鏈的延伸；由酮?；o酶A還原酶催化酮酰基輔酶A的酮基還原為羥基；由β-羥酰輔酶A脫水酶催化脫除一個(gè)水分子；由酮?；o酶A還原酶催化還原烯酰輔酶A。在脂肪酸延長(zhǎng)酶復(fù)合體的四種單體酶中，KCS主要參與脂肪酸延伸過(guò)程的縮合反應(yīng)，與其他三種酶相比，它具有很強(qiáng)的底物特異性，被認(rèn)為是超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成的限速酶[22,23]。根據(jù)序列相似性和底物特異性，真核生物KCS可分為兩類(lèi)。一類(lèi)是FAE型KCS，它最早是通過(guò)轉(zhuǎn)座子標(biāo)記在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)[24]。這種延長(zhǎng)酶主要存在于植物和藻類(lèi)中，以飽和及單不飽和脂酰鏈為底物進(jìn)行延長(zhǎng)。另一類(lèi)是ELO型KCS，最先是在釀酒酵母中被發(fā)現(xiàn)的[25]。該類(lèi)型的KCS主要存在于酵母、真菌和動(dòng)物中，主要以多不飽和脂酰鏈為底物，每次向?；溙砑觾蓚€(gè)碳原子進(jìn)行延伸[26,27]。例如，在釀酒酵母中，三種具有不同底物偏好性的ELO型KCS能催化長(zhǎng)鏈、超長(zhǎng)鏈不飽和脂酰鏈延伸[28]。在微藻Nannochloropsissp.中，細(xì)胞質(zhì)ELO型KCS能將16:3延長(zhǎng)到18:3，然后進(jìn)入EPA的生物合成階段[29]。在高等植物中，除了在Eranthis hyemalis等少量植物中存在ELO型KCS外，大部分植物中只含有FAE型KCS[30]。但在海洋微藻、真核生物中ELO型KCS的存在較為廣泛[31-37]（表2）。

表2 已鑒別出的不同破囊壺菌屬微生物的延長(zhǎng)酶匯總表 Table 2 Summary of elongases from different Thraustochytrids

2.1.2 脂肪酸去飽和酶

脂肪酸去飽和酶是VLCPUFA上雙鍵形成的關(guān)鍵酶，它能利用氧分子作為輔助因子，催化脫除脂酰鏈上兩個(gè)氫原子從而引入碳-碳雙鍵[42]。去飽和酶的氨基酸序列上通常含有3個(gè)組氨酸保守區(qū)，常以H-X[3,4]H、H-X[2,3]H-H和H/Q-X[2,3]H-H的形式存在。脂肪酸去飽和酶能依據(jù)其在?；溕系淖饔梦恢?，分為前端去飽和酶（front-end desaturase）和甲基末端去飽和酶（methyl-end desaturase）。甲基末端去飽和酶主要作用于已存在的雙鍵和甲基端之間，如ω3和ω6去飽和酶能分別催化從甲基端開(kāi)始第三個(gè)碳和第六個(gè)碳上的雙鍵合成。前端去飽和酶主要作用于已存在的雙鍵和多不飽和脂肪酸的羧基端之間的碳原子上，如Δ4、Δ5和Δ6去飽和酶[43-47]。脂肪酸去飽和酶亦能根據(jù)底物?；d體的不同，分為?；d體蛋白（acyl carrier protein，ACP）去飽和酶、?；o酶A（coenzyme A，CoA）去飽和酶與?；?lèi)去飽和酶。?；鵄CP去飽和酶是以脂酰基ACP作為底物；?；鵆oA去飽和酶主要催化?；鵆oA的去飽和反應(yīng)；而?；?lèi)去飽和酶將雙鍵引入由各種復(fù)雜脂質(zhì)分子（如糖脂磷脂和鞘脂等）組成的?；溨衃48]。雖然最近研究揭示了兩種膜結(jié)合的?；鵆oA去飽和酶的晶體結(jié)構(gòu)，為深入了解酰基輔酶A去飽和酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的催化機(jī)制提供了新思路[47,49]，但是，微生物中大多數(shù)去飽和酶的底物特異性仍需要進(jìn)行一系列的研究去驗(yàn)證明確[50]。

目前，來(lái)自于不同破囊壺菌屬微生物的去飽和酶（Δ4，Δ5，Δ6，Δ9，Δ12和ω-3）和延長(zhǎng)酶等都先后被分離出來(lái)并進(jìn)行了功能鑒定，因此，VLCPUFAs的有氧合成途徑已經(jīng)研究得較為清晰（表3）。其中最典型的EPA和DHA的有氧合成途徑可分為Δ6和Δ4兩個(gè)途徑[13,27,34,38,45,51-55]。Δ6途徑的研究最為詳細(xì)，該途徑以α-亞麻酸（α-linolenic acid，ALA）和亞油酸（linoleic acid，LA）為底物，當(dāng)以LA為底物時(shí)在Δ6-飽和酶的去飽和作用下生成γ-亞麻酸（γ-linolenic acid，GLA），隨后在Δ6-延長(zhǎng)酶的延長(zhǎng)作用下合成二高γ-亞麻酸（dohomo-γ-linolenic acid，DGLA），最后經(jīng)Δ5-飽和酶的作用生成ARA。而以ALA為底物時(shí)，在Δ6-飽和酶的去飽和作用下生成十八碳四烯酸（stearidonic acid，SDA），再經(jīng)Δ6-延長(zhǎng)酶的延長(zhǎng)作用合成二十碳四烯酸（eicosatetraenoic acid，ETA），最后在Δ5-飽和酶的作用下生成二十碳五烯酸（EPA）。另一種是Δ4途徑，主要是以EPA作為底物，在Δ5-延長(zhǎng)酶的作用下合成DPA，隨后在Δ4去飽和酶的作用下合成DHA，如破囊壺菌、裂殖壺菌便能以該途徑合成DHA（圖3）。

表3 已鑒別出的不同破囊壺菌屬微生物的去飽和酶匯總表 Table 3 Summary of desaturases from different Thraustochytrids

2.2 VLCPUFAs的無(wú)氧合成途徑及其關(guān)鍵酶

無(wú)氧合成途徑是VLCPUFAs的另一種合成途徑，它不存在于任何高等植物和動(dòng)物中，只存在于微生物中。之所以被稱(chēng)為無(wú)氧合成途徑，是因?yàn)樵撏緩讲恍枰ワ柡兔负脱鯕鈪⑴c反應(yīng)，而是在?；溠由爝^(guò)程中導(dǎo)入雙鍵。該途徑由一個(gè)聚酮合成酶（polyketide synthase，PKS）結(jié)構(gòu)相似的多不飽和脂肪酸合成酶（polyunsaturated fatty acid synthase，PUFA合成酶）催化，以丙酮酸為前體經(jīng)過(guò)多個(gè)迭代循環(huán)反應(yīng)從頭合成VLCPUFAs[60]。破囊壺菌屬微生物的PUFA合成酶與Shewanellasp.、Moriteollasp.和裂殖壺菌屬（Schizochytriumsp.）等微生物的類(lèi)似，由多個(gè)亞單位組成，每個(gè)亞基可能含有一個(gè)以上的催化結(jié)構(gòu)域，如酮酰基載體蛋白合成酶（ketoacyl carrier protein synthetase，KS）、酮?；d體蛋白還原酶（ketoacyl carrier protein reductase，KR）、去飽和酶（desaturase，DH）、烯酰基載體蛋白還原酶（enoyl carrier protein reductase，ER）、丙酰輔酶A：載體蛋白轉(zhuǎn)?；福╬ropionyl-CoA：carrier protein transacylase，MAT）和?；d體蛋白（ACP）。這些結(jié)構(gòu)域協(xié)同工作，通過(guò)四個(gè)重復(fù)的循環(huán)反應(yīng)來(lái)合成VLCPUFAs。然而，與通過(guò)脂肪酸合成酶合成長(zhǎng)鏈脂肪酸過(guò)程不同，在PUFA合成酶催化的無(wú)氧途徑中，PUFA合成酶可以周期性的跳過(guò)脂酰鏈的烯酰還原步驟，保留上面的順式雙鍵，依次合成VLCPUFA上的順式雙鍵（圖4）。

2.2.1 PUFA合酶

PUFA合成酶的發(fā)現(xiàn)可以追溯到1996年，當(dāng)時(shí)Yazawa[61]從魚(yú)腸中分離得到約40 kbShewanella pneumatophoriSCRC-2738的基因組DNA大片段，在大腸桿菌中表達(dá)，能催化EPA的合成。1997年，Takeyama[62]將8個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frames，ORFs）組成的DNA片段亞克隆到一個(gè)廣泛宿主范圍的質(zhì)粒載體中，并在Synechococcussp.中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)重組菌也能合成EPA。隨后的序列分析表明，該DNA序列編碼的蛋白質(zhì)與聚酮合成酶（polyketide，PKS）和脂肪酸合成酶有較高相似性，這使得Metz等人[63]認(rèn)為該基因簇序列參與EPA的生物合成可能遵循類(lèi)似于PKS的催化機(jī)制，稱(chēng)該類(lèi)能催化VLCPUFAs合成的大型合成酶為PUFA合成酶?；诖?，科學(xué)家們進(jìn)一步嘗試將破囊壺菌和裂殖壺菌的PKS相似基因進(jìn)行體內(nèi)和體外的功能驗(yàn)證，研究表明這種與PKS相類(lèi)似的基因能催化VLCPUFAs合成。隨后，科學(xué)家在包括細(xì)菌、真菌、藻類(lèi)和破囊壺菌微生物在內(nèi)的大量海洋微生物中均發(fā)現(xiàn)PUFA合成酶[64-72]。由PUFA合成酶催化的合成過(guò)程可以有效地生產(chǎn)多種VLCPUFAs，包括ARA、EPA、DPA和DHA等，由于其催化合成過(guò)程較簡(jiǎn)單，因此被認(rèn)為是比有氧合成途徑更有效的VLCPUFA生產(chǎn)系統(tǒng)[73-75]，是天然生產(chǎn)DHA等VLCPUFA的重要途徑。

雖然，PUFA合成酶廣泛存在于海洋微生物中，但這些合成酶的結(jié)構(gòu)卻是多種多樣的。如除陸地分枝桿菌外的原核生物的PUFA合成酶大多包含超過(guò)四個(gè)亞單位PfaA[76]、PfaB[77]、PfaC[78]和PfaD[79]，且每一個(gè)亞單位中催化結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和種類(lèi)亦有所不同。而真核生物的PUFA合成酶結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，如破囊壺菌屬微生物的PUFA合成酶只含有3個(gè)亞單位稱(chēng)為Subunit A、Subunit B和Subunit C，其中每個(gè)亞單位的結(jié)構(gòu)域種類(lèi)相似，除了ACP數(shù)量略有差異以外其他結(jié)構(gòu)域排列順序和種類(lèi)都一樣（圖5），因此，這些微生物的產(chǎn)物VLCPUFA是相同的，分別是DPA和DHA。

2.2.2 PUFA合酶的重要催化結(jié)構(gòu)

盡管VLCPUFAs是由PUFA合酶的多個(gè)催化結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用合成，但VLCPUFAs上多個(gè)不飽和雙鍵的合成和酰基鏈上的順序排布與PUFA合酶的兩個(gè)特殊區(qū)域-KS結(jié)構(gòu)域和DH結(jié)構(gòu)域息息相關(guān)。

KS結(jié)構(gòu)域是PUFA合成酶的關(guān)鍵催化區(qū)域，能催化?；?S-KS與延伸單元丙乙酸-S-ACP之間的縮合，形成酮?；?ACP，起到向?；溙砑?個(gè)碳原子的作用。與脂肪酸合成酶不同，PUFA合成酶上含有1～3個(gè)KS區(qū)域，這些區(qū)域具有底物偏好性，決定這最終產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)[80]，部分KS區(qū)域還能與缺失活性位點(diǎn)但結(jié)構(gòu)與KS相似的鏈長(zhǎng)因子（chain length factor，CLF）區(qū)域形成二聚體結(jié)構(gòu)，催化不飽和?；湹难由?。如破囊壺菌PUFA合成酶中的兩個(gè)KS區(qū)域皆能互補(bǔ)大腸桿菌酮?；?ACP合成酶突變體（fabB）的表型，使突變體恢復(fù)不飽和脂肪酸的合成。而在大腸桿菌中表達(dá)兩個(gè)KS區(qū)域發(fā)現(xiàn)，在Subunit A上的KS區(qū)域能提高長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成，而Subunit B上的KS區(qū)域能提高大腸桿菌脂肪酸的不飽和度，該結(jié)果指出PUFA合成酶的KS區(qū)域底物具有特異性。隨后，日本課題組將Photobacterium profundum（產(chǎn)EPA菌）PUFA合成酶的KS區(qū)域與Moritella marina（產(chǎn)DHA菌）的KS結(jié)構(gòu)域進(jìn)行互換，發(fā)現(xiàn)替換了Moritella marinaKS結(jié)構(gòu)域的Photobacterium profundumPUFA合成酶也能合成DHA，進(jìn)一步說(shuō)明KS對(duì)PUFA合成酶的最終產(chǎn)物的碳鏈長(zhǎng)度起決定性作用。

DH結(jié)構(gòu)域是合成VLCPUFAs上順式雙鍵的關(guān)鍵區(qū)域。根據(jù)序列分析，DH區(qū)域分為兩類(lèi)，一種是PKS型DH結(jié)構(gòu)域，另一種是FabA型DH結(jié)構(gòu)域[81,82]。大腸桿菌互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，前者類(lèi)似于PKS的DH區(qū)域，催化羥酰基進(jìn)行脫水反應(yīng)，從而在ɑ和β-碳之間引入反式雙鍵；后者類(lèi)似于大腸桿菌羥?；?ACP脫水酶（FabA），催化底物脫水形成反式雙鍵后，還可以將構(gòu)型從反式轉(zhuǎn)換為順式，形成VLCPUFA的雙鍵結(jié)構(gòu)[83]。體外實(shí)驗(yàn)更指出，PKS型DH結(jié)構(gòu)域?qū)Χ替滜；溇哂羞x擇性，從而決定最終脂肪酸的類(lèi)型。如，產(chǎn)ω-6脂肪酸的Aureispira marinaPKS型DH結(jié)構(gòu)域與FabA型DH結(jié)構(gòu)域競(jìng)爭(zhēng)C6-Enoyl-ACP結(jié)合，而Moritella marinaPKS型 DH 結(jié)構(gòu)域優(yōu)先與C3-Enoyl-ACP反應(yīng)，從而合成ω-3脂肪酸。兩類(lèi)DH結(jié)構(gòu)域輪流作用于碳鏈的延伸和雙鍵的導(dǎo)入合成，之后ER將Enoyl-ACP上的反式雙鍵還原為飽和ACP，完成一次碳鏈的延長(zhǎng)，如此循環(huán)往復(fù)多個(gè)反應(yīng)使得多個(gè)順式雙鍵能形成在延伸的酰基鏈上。

除了這些關(guān)鍵域外，PUFA合成酶中還要其他一些區(qū)域，包括MAT域和AT域。MAT結(jié)構(gòu)域催化丙二酰CoA向丙二酰ACP轉(zhuǎn)移，并作為縮合反應(yīng)的擴(kuò)展單元[84]。通過(guò)切割最終的?；鵄CP的硫酯鍵，釋放游離脂肪酸。AT結(jié)構(gòu)域可以參與脂肪酸產(chǎn)生的最后步驟[85]。

3 破囊壺菌屬微生物中TAG的生物合成途徑

VLCPUFAs在破囊壺菌屬微生物中的生物合成不僅涉及脂肪酸的催化合成，而且還涉及這些脂肪酸如何整合組裝到存儲(chǔ)性脂質(zhì)三?；视停╰riacylglycerol，TAG）中。由PUFA合成酶合成的超長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸是以游離脂肪酸的形式從酶中釋放出來(lái)[60]，然后通過(guò)?；鵆oA合成酶將新合成的脂肪酸活化為相應(yīng)的硫酯，才能進(jìn)行細(xì)胞代謝和脂質(zhì)儲(chǔ)存裝配[86]。

現(xiàn)有的研究表明，大量結(jié)合了VLCPUFAs的甘油脂積累在破囊壺菌屬微生物（如Thraustochytriumsp.）體內(nèi)。這類(lèi)甘油脂主要有：磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）和磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）等極性脂類(lèi)以及二酰甘油（diacylglycerol，DAG）和三酰甘油等非極性脂類(lèi)。極性脂是構(gòu)成各種細(xì)胞器膜及細(xì)胞質(zhì)膜的主要成分，而非極性脂類(lèi)是以VLCPUFAs為最終儲(chǔ)存形式儲(chǔ)存在生物體內(nèi)。

3.1 破囊壺菌屬微生物的甘油脂生物合成途徑

3.1.1 ?；鵆oA依賴(lài)途徑（Kennedy途徑）

目前，動(dòng)植物合成甘油酯的途徑可根據(jù)其是否利用?；鵆oA分為?；鵆oA依賴(lài)途徑和非依賴(lài)?；鵆oA途徑。利用?；鵆oA作為反應(yīng)底物的途徑，又稱(chēng)為依賴(lài)?；鵆oA途徑（即Kennedy途徑）。Kennedy途徑主要存在于酵母和植物中，是以3-磷酸甘油（glycerol-3-phosphate，G3P）為底物，在甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶（glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT）和溶血磷酸酯酰轉(zhuǎn)移酶（hemolyticacyltransferase，LPAT）的催化下，以?；鵆oA為?；w，將G3P?；闪字幔╬hosphatidic acid，PA）在磷脂酸磷酸酯酶（phosphatidic acid phosphatase，PAP）的催化作用下，將PA去磷酸化得到DAG，然后通過(guò)二?；视王；D(zhuǎn)移酶（diacylglycerol acyltransferase，DGAT）在sn-3位與另一個(gè)?；鵆oA?；玫絋AG[87-89]。

3.1.2 非依賴(lài)?；鵆oA途徑

除了Kennedy途徑外，還有一個(gè)不依賴(lài)?；鵆oA的獨(dú)立途徑，通常以DAG作為底物，PC作為?；w，在磷脂：二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶（phospholipid：diacylglycerol acyltransferase，PDAT）的作用下將磷脂（主要是PC）sn-2位上的?；溵D(zhuǎn)移到DAG的sn-3位置，從而合成TAG[90,91]。

3.1.3 破囊壺菌屬微生物的甘油脂生物合成機(jī)理研究進(jìn)展

到目前為止，在破囊壺菌中幾乎所有參與磷脂和TAG生物合成的基因都通過(guò)基因組測(cè)序被鑒定出來(lái)[92,93]。但大部分參與合成的基因仍未被功能驗(yàn)證，只有Aurantiochytrium limacinumF26-b中參與PC合成的PC?；D(zhuǎn)移酶（LPCAT）的功能得到了驗(yàn)證。最近的一些同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明[87,88]，真核生物TAG中VLCPUFAs積累主要是由PC的合成水平?jīng)Q定的。加拿大薩省大學(xué)Xiao Qiu課題組[92]首次通過(guò)C14同位素示蹤實(shí)驗(yàn)對(duì)VLCPUFAs在破囊壺菌Thraustochytriumsp. 26185的甘油酯合成機(jī)理進(jìn)行探索。研究發(fā)現(xiàn)，該菌產(chǎn)生的VLCPUFAs首先積累到PC上，隨后以DAG作為媒介合成作為儲(chǔ)存性脂質(zhì)的TAG。脂質(zhì)的組分和結(jié)構(gòu)分析表明，PC上的脂肪酸組成與PC衍生而成的DAG（即PC-DAG）和TAG上的組成和結(jié)構(gòu)非常相似，VLCPUFAs大多結(jié)合在甘油骨架sn-2的位置上。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)指出PC和DAG上的多不飽和脂肪酸含量隨著時(shí)間推移逐步減少，而TAG上的多不飽和脂肪酸含量卻逐漸上升。隨后，武漢油料所萬(wàn)霞等[93]，對(duì)裂殖壺菌不同生長(zhǎng)階段各類(lèi)脂質(zhì)含量、成分和結(jié)構(gòu)進(jìn)行組學(xué)分析，其結(jié)果亦印證了這個(gè)觀點(diǎn)。由此可以推斷，在破囊壺菌屬微生物中VLCPUFAs可能是由PC通過(guò)DAG作為媒介轉(zhuǎn)移到TAG上，或直接由PC作為前體直接合成TAG，積累在體內(nèi)。PC上的多不飽和脂肪酸水平直接決定了儲(chǔ)存性脂質(zhì)TAG上的不飽和脂肪酸含量。但是，至今為止，仍沒(méi)有具體的實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚪忉屍颇覊鼐鷮傥⑸锷系腣LCPUFAs是如何組裝到TAG上的，需要對(duì)一系列參與該途徑的基因進(jìn)行克隆、表達(dá)和功能驗(yàn)證才能闡明這些VLCPUFAs脂質(zhì)的合成機(jī)理。（圖6）

4 破囊壺菌屬微生物開(kāi)發(fā)與利用的探討

破囊壺菌屬微生物作為VLCPUFAs的主要生產(chǎn)者，油脂含量相對(duì)較高，可以作為EPA、DHA等功能油脂的潛在來(lái)源。但由于這些海洋微生物長(zhǎng)期生活于海洋環(huán)境，對(duì)培養(yǎng)條件要求較高。因此，通過(guò)培養(yǎng)破囊壺菌屬微生物提取VLCPUFAs方法來(lái)進(jìn)行大批量功能油脂的生產(chǎn)，不僅比用魚(yú)油提取的成本更高而且產(chǎn)量也難以滿(mǎn)足市場(chǎng)需求。如何利用破囊壺菌屬微生物富含VLCPUFAs的特性來(lái)大量獲取EPA、DHA等功能油脂為人類(lèi)健康服務(wù)，是值得我們深入研究探索的一個(gè)課題。隨著現(xiàn)代生物科技的高速發(fā)展，通過(guò)基因工程、酶工程、代謝工程和發(fā)酵技術(shù)等現(xiàn)代科技手段實(shí)現(xiàn)利用破囊壺菌屬微生物高效獲取VLCPUFAs指日可待。

4.1 通過(guò)轉(zhuǎn)基因工程菌生產(chǎn)DHA

目前來(lái)說(shuō)，利用破囊壺菌進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)還需要克服一系列的挑戰(zhàn)。首先，破囊壺菌屬微生物需要成本較高的培養(yǎng)基。此外，海洋微生物的繁殖會(huì)受到其他物種和病原體的污染，從而影響生長(zhǎng)。其三，環(huán)境溫度對(duì)破囊壺菌屬微生物中DHA的生產(chǎn)也有很大的影響，如裂殖壺菌在較低溫度下DHA產(chǎn)量明顯高于正常生長(zhǎng)溫度，因?yàn)榱阎硥鼐猩婕疤谴x和中長(zhǎng)鏈脂肪酸代謝的關(guān)鍵基因受到低溫抑制，而合成DHA的關(guān)鍵酶卻沒(méi)有受到溫度調(diào)控，低溫更適合DHA在裂殖壺菌中積累，因此，培養(yǎng)破囊壺菌屬微生物需要特定控溫設(shè)施[94]。利用天然海洋微生物生產(chǎn)DHA的效率和商業(yè)價(jià)值都不高。如今，利用工程菌結(jié)合代謝工程生產(chǎn)DHA具有常規(guī)微生物培養(yǎng)不可比擬的優(yōu)勢(shì)：包括能高密度發(fā)酵生產(chǎn)、培養(yǎng)基成本低和不需要特定的控溫設(shè)施。因此，通過(guò)代謝工程將破囊壺菌中參與VLCPUFAs合成的關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)入能高密度、低能耗發(fā)酵的工程菌中將會(huì)是生產(chǎn)VLCPUFA新的來(lái)源[95]。

除此以外，向工程菌轉(zhuǎn)入PUFA合成酶，構(gòu)建無(wú)氧合成途徑，也能使工程菌合成功能油脂。Orikasa等[74]將Moritella marinaMP-1中DHA生物合成基因簇（pDHA3）包括基因：pfaA、pfaB、pfaC、pfaD和pfaE在大腸桿菌中共表達(dá)，在15 ℃下培養(yǎng)能生產(chǎn)占總脂肪酸產(chǎn)量5%的DHA[97]。四年后，另一項(xiàng)研究指出[95]，將Shewanella balticaMAC1的PUFA合成酶在大腸桿菌中異源表達(dá)能夠在體內(nèi)產(chǎn)生EPA和DHA。盡管可以通過(guò)將編碼PUFA合成酶的基因在大腸桿菌中表達(dá)，合成EPA和DHA，但大腸桿菌作為未被確定為食品級(jí)（Food grade，F(xiàn)G）微生物，不能直接用于食品工業(yè)中。乳酸菌屬于FG微生物并且能表達(dá)PUFA合成酶基因，因此，通過(guò)PUFA合成酶在乳酸菌表達(dá)而合成EPA和DHA的方法，將有可能成為獲得VLCPUFAs新的規(guī)模化生產(chǎn)途徑。為此，Amiri-Jami[96]將來(lái)自Shewanella balticaMAC1的基因簇引入乳酸菌Lactococcus lactissubsp.cremoris MG1363中，該重組菌能產(chǎn)生1.35±0.5 mg/g的DHA和0.12±0.04 mg/g的EPA[98]。該實(shí)驗(yàn)為后期開(kāi)發(fā)產(chǎn)EPA/DHA的乳酸菌作為乳品發(fā)酵劑、青貯飼料添加劑和動(dòng)物飼料添加劑提供了前期研究基礎(chǔ)。

4.2 轉(zhuǎn)基因油料作物生產(chǎn)VLCPUFAs

油料作物，如油菜、大豆具有包括油酸、亞油酸等的多不飽和脂肪酸。近年來(lái)，將微生物基因應(yīng)用到植物中，經(jīng)代謝工程合成VLCPUFAs在作物的改良生產(chǎn)方面具有一定的突破。Wu等[99]嘗試通過(guò)在油菜中異源表達(dá)9個(gè)來(lái)源于破囊壺菌Thraustochytriumsp. 26185等微生物的基因（包括：Δ4、Δ5、Δ6和ω3去飽和酶、延長(zhǎng)酶和?；D(zhuǎn)移酶）構(gòu)建DHA生物合成途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，轉(zhuǎn)基因油菜籽油中含有2%的DHA，證明在植物中表達(dá)有氧合成途徑的關(guān)鍵基因具有實(shí)現(xiàn)DHA等功能油脂在油料作物中的大規(guī)模生產(chǎn)的可能性[99]。隨后，科學(xué)家對(duì)轉(zhuǎn)基因植物中的關(guān)鍵基因進(jìn)行優(yōu)化、嘗試在Brassica napus和Camelina sativa等油料作物中合成EPA、DHA，獲得了一系列能生產(chǎn)功能油脂的轉(zhuǎn)基因油料作物，并不斷提高其產(chǎn)量[99-103]。雖然現(xiàn)在利用有氧合成途徑在轉(zhuǎn)基因油菜籽作物中合成的DHA水平能達(dá)到總脂的12%，但由于去飽和酶和延長(zhǎng)酶對(duì)脂?；孜锏奶禺愋?，造成轉(zhuǎn)基因油料作物還會(huì)產(chǎn)生一些中間體脂肪酸，如硬脂酸、GLA和ETA等[101,102]，需要后期通過(guò)純化等方法去除，造成生產(chǎn)成本增加。除外，可能由于兩種類(lèi)型酶的蛋白不相容性或者表達(dá)水平不一致，導(dǎo)致最終產(chǎn)物產(chǎn)量降低，不能最大限度地生產(chǎn)目的功能油脂。

表6 基因改造破囊壺菌屬微生物基因改造匯總表 Table 6 Summary table of genetic modification of Thraustochytrids microorganisms

近年來(lái)，科學(xué)家嘗試在植物中構(gòu)建無(wú)氧合成途徑，以期獲得較為純凈的功能油脂產(chǎn)物。Walsh等[103]將裂殖壺菌SchizochytriumATCC PTA 9695中編碼PUFA合酶的三個(gè)開(kāi)放閱讀框基因通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜Brassica napus（Canola）中，構(gòu)建無(wú)氧合成途徑，在轉(zhuǎn)基因油菜中成功生產(chǎn)占總脂0.7%的EPA和3.7%的DHA。雖然PUFA合酶能成功在油料作物中合成EPA和DHA，但是其產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足以用于功能油脂的大規(guī)模生產(chǎn)，DHA產(chǎn)量低可能是由于轉(zhuǎn)基因植物中異源PUFA合酶的活性低。因此，后續(xù)可能需要通過(guò)提高油料種子中PUFA合酶的活性來(lái)進(jìn)一步優(yōu)化DHA的催化途徑（表4）。

表4 利用破囊壺菌基因在工程菌中合成VLCPUFAs Table 4 Production of VLCPUFAs in microbes through introducing genes from Thraustochytrids

4.3 利用基因工程技術(shù)改造破囊壺菌屬微生物提高VLCPUFAs的產(chǎn)量

遺傳修飾策略常用于發(fā)酵領(lǐng)域，旨在通過(guò)代謝工程方法提高天然菌株中目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。該策略已廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因微生物和植物中，通過(guò)生物合成途徑相關(guān)基因的過(guò)表達(dá)或誘變，以及敲除參與競(jìng)爭(zhēng)途徑的基因來(lái)增強(qiáng)某些特定產(chǎn)物。

近年來(lái)，科學(xué)家也陸續(xù)嘗試通過(guò)遺傳修飾策略改造破囊壺菌屬微生物，提高其VLCPUFAs的產(chǎn)量。如，Wang等[104]將微藻Crypthecodinium cohnii的蘋(píng)果酸酶在裂殖壺菌Schizochytriumsp. S31中進(jìn)行超表達(dá)，提高NADPH的供應(yīng)，同時(shí)超表達(dá)土壤真菌Mortierella alpina延長(zhǎng)酶（Δ3-DES）來(lái)抑制脂肪酸合成酶中乙酰CoA羧化酶的活性，進(jìn)而提升DHA的產(chǎn)量。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因裂殖壺菌中DHA的產(chǎn)量相對(duì)于野生菌株提升了1.39倍，達(dá)到了3.54 g/L，大大提高了DHA的生產(chǎn)效率。Ling等[105]嘗試把裂殖壺菌Schizochytriumsp.SR21中PUFA合成酶Subunit C上的ER敲除，發(fā)現(xiàn)裂殖壺菌突變體的總不飽和脂肪酸，尤其是EPA和DHA的產(chǎn)量提高了50%以上，明顯高于野生菌，證明改造PUFA合成酶的催化結(jié)構(gòu)域能改變VLCPUFAs的產(chǎn)量。Wang等[106]在破囊壺菌Aurantiochytriumsp.中超表達(dá)PUFA 合成酶型磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶（phosphopantetheinyl transferase，PPTase），成功提高53.9%的DHA產(chǎn)量。此外，還有很多成功超表達(dá)VLCPUFA相關(guān)合成途徑提高關(guān)鍵脂肪酸的產(chǎn)量的案例[107,108]（表5）。

表5 轉(zhuǎn)基因植物合成VLCPUFAs Table 5 VLCPUFAs produced in plants

5 總結(jié)與展望

5.1 隨著對(duì)VLCPUFAs（特別是ARA、EPA和DHA）等在維護(hù)生物膜結(jié)構(gòu)和功能、提高機(jī)體免疫力、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、調(diào)節(jié)脂類(lèi)代謝、減少心血管疾病發(fā)病率等作用的逐漸深入了解，全球市場(chǎng)對(duì)這些脂肪酸的需求量也日益增加，因此，開(kāi)發(fā)富含ARA、EPA和DHA的油脂來(lái)源迫在眉睫。海洋魚(yú)類(lèi)如鮭魚(yú)、鱒魚(yú)、鯖魚(yú)等是VLCPUFAs的傳統(tǒng)來(lái)源，然而，由于全球氣候變暖、海洋環(huán)境污染和過(guò)度捕撈等因素的影響，海洋魚(yú)類(lèi)資源日漸減少，通過(guò)捕撈海洋魚(yú)類(lèi)獲得VLCPUFAs的傳統(tǒng)生產(chǎn)方式不僅大量消耗海洋魚(yú)類(lèi)資源，影響海洋生態(tài)，而且也難以滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。因此，篩選富含ARA、EPA和DHA的海洋微生物資源并發(fā)掘其合成這些脂質(zhì)的關(guān)鍵基因，并利用現(xiàn)代生物科技，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因微生物和油料作物，通過(guò)定向表達(dá)特定基因，實(shí)現(xiàn)EPA和DHA等制品的高效合成，具有一定的應(yīng)用前景。

5.2 破囊壺菌是一種廣泛分布于全球海域的海洋原生生物，其具有生長(zhǎng)周期較短、培養(yǎng)簡(jiǎn)單且能合成EPA、DPA和DHA的特點(diǎn)。自1989年澳大利亞科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)破囊壺菌能積累DHA以來(lái)，科學(xué)家們對(duì)破囊壺菌中VLCPUFAs的生物合成途徑開(kāi)展了研究，對(duì)該壺菌EPA、DPA和DHA的生物合成及其甘油酯的組裝途徑已有一定了解，部分參與VLCPUFAs合成和組裝途徑的關(guān)鍵基因已被分析、克隆和功能鑒定，為后續(xù)利用現(xiàn)代生物科技，定向表達(dá)該類(lèi)基因，實(shí)現(xiàn)EPA和DHA等制品的高效合成奠定了基礎(chǔ)。

5.3 盡管破囊壺菌以及其他海洋微生物具有生產(chǎn)VLCPUFAs的能力，但它們的生長(zhǎng)速度和產(chǎn)量相對(duì)較低，且需要昂貴的培養(yǎng)條件，難以應(yīng)用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。因此，近年來(lái)，通過(guò)在工程微生物或油料作物中重構(gòu)異源VLCPUFA有氧/無(wú)氧生物合成途徑或?qū)μ烊晃⑸镞M(jìn)行基因改造，已取得一定進(jìn)展。然而，在應(yīng)用天然或異源宿主來(lái)生產(chǎn)VLCPUFAs時(shí)，其產(chǎn)量可能會(huì)受到一些代謝瓶頸的限制。第一，酰基-PC庫(kù)與?；?CoA庫(kù)之間的酰基轉(zhuǎn)換效率是影響EPA、DHA最終產(chǎn)量的關(guān)鍵。在有氧合成途徑中，飽和酶和延長(zhǎng)酶的底物并不兼容，延長(zhǎng)酶需要利用?；?CoA作為底物而去飽和酶則是利用?；?PC，因此，在VLCPUFAs合成過(guò)程中PC和CoA庫(kù)之間的?；D(zhuǎn)換非常頻繁。但很多工程菌和油料作物中的多不飽和?；D(zhuǎn)移酶工作效率遠(yuǎn)低于海洋微生物，導(dǎo)致多不飽和?；鶡o(wú)法高效地在兩種底物之間轉(zhuǎn)換，從而影響最終產(chǎn)物的合成效率。一些研究也指出，VLCPUFAs的有氧合成途徑和儲(chǔ)存脂質(zhì)合成途徑與VLCPUFA-CoA存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，也會(huì)導(dǎo)致最終產(chǎn)物的合成水平。同時(shí)，一些利用PUFA合成酶在植物中構(gòu)建無(wú)氧合成途徑的研究指出，由于PUFA合成酶與脂肪酸合成酶競(jìng)爭(zhēng)丙酮酸、NADPH等底物，導(dǎo)致PUFA合成酶底物不足，影響DHA的產(chǎn)量。有些研究也指出由于PUFA合成酶是一個(gè)巨型合成酶，編碼其表達(dá)的基因超過(guò)20萬(wàn)個(gè)堿基，導(dǎo)致其編碼基因在異源微生物和植物中表達(dá)水平低，從而影響其對(duì)DHA的合成效率。

5.4 因此，針對(duì)當(dāng)下VLCPUFAs代謝工程合成過(guò)程中的瓶頸問(wèn)題，一些潛在的策略可能適用于VLCPUFA的合成工程：（1）增加合成前體的生成；（2）抑制VLCPUFA合成的競(jìng)爭(zhēng)途徑；（3）通過(guò)更換啟動(dòng)子或增加目的基因的拷貝數(shù)增加相關(guān)合成酶的表達(dá)水平；（4）減少編碼PUFA合成酶基因的長(zhǎng)度，只保留關(guān)鍵功能區(qū)域，增加合成酶的表達(dá)水平；（5）選擇適合VLCPUFAs合成和組裝的關(guān)鍵基因進(jìn)行表達(dá)。通過(guò)不斷挖掘、優(yōu)化VLCPUFAs的替代來(lái)源，符合國(guó)家對(duì)“大健康”產(chǎn)業(yè)的發(fā)展方向，對(duì)擺脫該產(chǎn)業(yè)對(duì)海洋魚(yú)類(lèi)的高度依賴(lài)，推動(dòng)產(chǎn)業(yè)向生態(tài)、環(huán)保、優(yōu)質(zhì)方向發(fā)展，促進(jìn)海洋生物資源的保護(hù)和利用，具有重要意義（圖7）。