滸苔多糖的結(jié)構(gòu)、制備與降解研究進(jìn)展

寧利敏，姚忠，朱本偉*，孫蕓

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院·整合醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210023）（2.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇南京 211816）

近年來，我國黃海海域經(jīng)常爆發(fā)由漂浮滸苔導(dǎo)致的綠潮，嚴(yán)重危害海洋生態(tài)環(huán)境。滸苔（Enteromorphasp.）屬于綠藻門石莼科滸苔屬，大約有40個(gè)種，而我國約有9個(gè)種，常見的有滸苔（Enteromorpha prolifera）、腸滸苔（Enteromorpha intestinalis）、緣管滸苔（Enteromorpha linza）等（圖1）[1]。滸苔具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，其中蛋白占細(xì)胞干重的22%，還含有亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸和花生四烯酸等十余種多不飽和脂肪酸，經(jīng)常被加工為海苔條等健康食品。滸苔細(xì)胞壁的主要成分是具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的滸苔多糖[2]。研究發(fā)現(xiàn)，滸苔多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、巖藻糖和葡萄糖醛酸等單糖或單糖醛酸組成，而且組成的單糖種類和含量還隨著滸苔種類、采收季節(jié)、生長條件等因素的不同而不同[3]。滸苔多糖作為滸苔的主要活性成分，具有多種生物活性，如抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)劑和降血脂等[4-7]。滸苔多糖主要是通過熱水浸提法、微波或超聲輔助提取等方法獲得，但是由于其分子量較大，滸苔多糖具有溶解性差、生物利用率低等缺陷，這極大地限制了滸苔多糖資源的高值化開發(fā)和利用。

滸苔多糖經(jīng)降解后得到的降解產(chǎn)物不僅保持了多糖所具有的多種生物活性，而且還在溶解性、生物利用度等方面有了較大的提升，使得滸苔多糖降解產(chǎn)物的制備與活性研究成為海洋生物資源開發(fā)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[8]。目前，關(guān)于滸苔多糖的研究報(bào)道正日益增多，尚未有相關(guān)論文對目前的研究進(jìn)展進(jìn)行完善地總結(jié)和討論。本文對滸苔多糖的化學(xué)組成、提取方法、分離與結(jié)構(gòu)分析等研究報(bào)道進(jìn)行了系統(tǒng)總結(jié)，并綜述和分析了滸苔多糖降解產(chǎn)物的制備方法，以及滸苔多糖降解產(chǎn)物活性方面的研究進(jìn)展。在論文的最后，分析了當(dāng)前滸苔多糖研究存在的主要問題和技術(shù)瓶頸，為推動(dòng)滸苔多糖的高值化利用和促進(jìn)綠潮生態(tài)災(zāi)害的無害化處理提供理論基礎(chǔ)和借鑒。

1 滸苔多糖的化學(xué)組成

滸苔多糖的化學(xué)組成較為復(fù)雜，而且會(huì)根據(jù)來源的滸苔種類、滸苔的生長條件、采收季節(jié)以及多糖的純化方法等的不同而有所差異[9,10]，滸苔多糖中的單糖組成如圖2所示。齊曉輝等[11,12]研究了來源于緣管滸苔、青島綠潮滸苔和廈門條滸苔的滸苔多糖的化學(xué)組成。研究發(fā)現(xiàn)緣管滸苔多糖主要由鼠李糖構(gòu)成，還含有少量的半乳糖、木糖和葡萄糖醛酸；廈門條滸苔多糖則主要由阿拉伯糖和半乳糖組成，此外還含有少量的鼠李糖和微量的巖藻糖、木糖、甘露糖和葡萄糖等成分；青島綠潮滸苔多糖則主要由鼠李糖組成，此外還含有少量的葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖和甘露糖，表明不同種類的滸苔所含的多糖組成差異較大。石學(xué)連等[10]研究了不同時(shí)間采集的條滸苔多糖的單糖組成，發(fā)現(xiàn)這些樣品中的單糖種類基本一致，但各種單糖的含量有所差異。例如，6月份和11月份采集的滸苔中，多糖中的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖的組成比例分別為6.74:65.56:5.54:2.83:19.33和2.81:67.55:2.31:2.71:24.61[10]。此外，嵇國利等[13]分析了處于爆發(fā)期的條滸苔多糖的化學(xué)組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了除鼠李糖和葡萄糖醛酸外，滸苔多糖中還含有艾杜糖醛酸，但是不含甘露糖，而之前并未有條滸苔多糖含有艾杜糖醛酸的報(bào)道，這表明處于爆發(fā)期的滸苔與正常生長條件下的條滸苔多糖成分存在明顯差異。由此可見，滸苔的生長或采收時(shí)間不同，滸苔多糖的組分也有所差異，這在其他藻類多糖的成分分析中也有發(fā)現(xiàn)[14]。

2 滸苔多糖的結(jié)構(gòu)

由于滸苔多糖中的單糖組成比較復(fù)雜，單糖間的連接方式以及基團(tuán)修飾等的復(fù)雜多樣，存在分枝結(jié)構(gòu)等原因，滸苔多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性遠(yuǎn)超過其他藻類多糖（如褐藻膠、卡拉膠和瓊膠多糖等）[3,15]。齊曉輝等[12]對不同來源的滸苔多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)青島緣管滸苔（Enteromorpha linza）的多糖由5種多糖組分（MCS、MHS、SCS、SH1S和SH2S），和[→4)-β-D-Xylp-(1→]組 成，并 含 有 少 量 的[→2)-α-L-Rhap-(1→] 、 [→3)-α-L-Rhap-(1→] 、[→3,4)-α-L-Rhap-(1→]、[→2,3)-α-L-Rhap-(1→]和[→2,4)-α-L-Rhap-(1→]，硫 酸 基 則 主 要 位 于[→4)-α-L-Rhap-(1→]的C3位。5種多糖組分的化學(xué)組成詳見表1[12]。而從青島綠潮滸苔（Enteromorpha prolifera）中可分離得到四種多糖組分QC1S、QCQ2、QCQ3和QHS[12]。如表1所示，該多糖主要含有兩種二 糖 結(jié) 構(gòu) 單 元；[→4)-β-D-ClcUAp-(1→4)-α-L -Rhap3S-(1→]和[→4)-β-D-Xylp-(1→4)-α-L-Rhap3S- (1→]。其中，QC1S組分主要由[→4)-α-L-Rhap-(1→]和[→4)-β-D-Xylp-(1→]組 成，含 有 少 量 的[→2)-α-L-Rhap4S-(1→]、[→3)-α-L-Rha4S-(1→]、[→4)-α-L-Rhap2S-(1→]和[→3,4)-α-L-Rhap-(1→]；而QHS組分主要由[→4)-α-L-Rhap-(1→]、[→4)-β-D- Xylp-(1→]和[→4)-β-D-GlcUAp-(1→]組成，含有少量的[→3)-α-L-Rhap-(1→]和[→2,4)-α-L-Rhap-(1→]，硫酸基位于[→4)-α-L-Rhap-(1→]的C3位。最后從廈門條滸苔（Enteromorpha clathrata）中分離得到了3個(gè)多糖組分（XCS、XH1S和XH2S），如表1所示，XCS主要由[→2)-β-D-Galp-(1→]、[→3)-β-D-Galp-(1→]、[→4)-β-D-Galp-(1→]和[→6)-β-D-Galp-(1→]組成，含有少量的[→4)-β-L-Arap-(1→]、[→2)-α-L-Rhap-(1→]、[→3)-α-L-Rhap-(1→]和[→2)-α-L-Rhap-(1→]，硫酸基主要位于[→4)-β-D-Galp-(1→]的C6位或者C2位、[→6)-β-D-Galp-(1→]的C4位或者C2位。XH1S主要由[→4)-β-L-Arap-(1→]組成，含有少量的[→3)-β-D-Galp- (1→]、[→4)-β-D-Galp-(1→]和[→6)-β-D-Galp-(1→]，硫酸基主要位于[→4)-β-L-Arap-(1→]的C3位；XH2S主 要 由[→4)-β-L-Arap3S-(1→]組 成，含 有 微 量[→4)-β-L-Arap-(1→]和[→3)-α-L-Rhap4S-(1→][12]。

表1 不同種類滸苔的多糖化學(xué)組成[12] Table 1 The chemical composition of different Enteromorpha polysaccharide [12]

焦麗麗等[16]從腸滸苔（Enteromorpha intestinalis）中提取得到兩個(gè)多糖組分（WEB和DAEB），通過結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)WEB中Rha以(1→4)鍵型為主，還有(1→2)，(1→2,4)、(1→4)、和(1→3)連接鍵型；Xyl和Gal之間的連接鍵型均為(1→)，同時(shí)含有(1→4)-GlcA及少量的(1→)-GlcA；該糖中每5個(gè)(1→4)-Rha中就有一個(gè)分支，分支點(diǎn)在O-2。WEB和WEBD的13C-NMR分析表明，WEB中硫酸根位于鼠李糖的O-3。DAEB甲基化研究表明DAEB由(1→)-Rha、(1→4)-Rha、(1→2,4)-Rha、(1→)-Xyl、(1→2,3)-Xyl、(1→3)-Xyl、(1→4)-Glc及(1→3)-Gal組成；每6個(gè)(1→4)-Rha中就有一個(gè)分支，分支點(diǎn)在O-2。另外，通過研究DAEB和DAEB-D的甲基化修飾發(fā)現(xiàn)，大部分硫酸根位于(1→4)-Rha的O-3，還有一少部分硫酸根位于(1→3)-Xyl的O-2位。石學(xué)連等[10]利用紅外光譜和核磁共振波譜等分析緣管滸苔多糖組成，發(fā)現(xiàn)緣管滸苔多糖主要包括(1→2,4)-和(1→4)-連接的鼠李糖殘基，(1→4)-連接的木糖殘基，其中硫酸根主要連接在鼠李糖基3位。從以上研究不難看出，不同種類滸苔多糖的結(jié)構(gòu)差異很大，這種差異性不僅體現(xiàn)在多糖的化學(xué)組成上，還體現(xiàn)在糖苷鍵的連接方式、硫酸基團(tuán)的位置以及分支點(diǎn)的位置及數(shù)量上。由此可見，滸苔多糖是含有多種結(jié)構(gòu)單元、連接方式復(fù)雜多樣且含有支鏈的雜多糖，因而研究其精細(xì)結(jié)構(gòu)具有非常大的難度和挑戰(zhàn)性。

3 滸苔多糖的提取與純化

目前關(guān)于滸苔多糖提取和純化方法的報(bào)道很多，但是按照提取和純化的工藝，可以將提取方法歸結(jié)為三大類，即溶液浸提法、物理提取法和酶輔助提取法[17]，滸苔多糖的純化方法也可歸結(jié)為三大類，即離子交換色譜法和凝膠過濾色譜法，以及這兩分離種方法的聯(lián)用[18]。

3.1 滸苔多糖的提取方法

滸苔多糖的提取方法與其他植物多糖的提取方法類似，主要包括熱水提取法、酸堿提取法等溶液提取法、酶法輔助和物理輔助提取法[19]。

3.1.1 溶液提取法

溶液提取法主要包括熱水浸提法和酸堿浸提法。許福超等[20]以料液比1:60，在90 ℃條件下提取4 h，多糖提取率可達(dá)21.96%。李霞等[21]按照料液比1:20（m/V，g/mL）加入80%的乙醇加熱回流提取3次，每次回流2 h，干燥后按照料液比1:16加入蒸餾水浸泡過夜后在100 ℃提取3 h，重復(fù)兩次，回收水提液蒸發(fā)濃縮后采用75%的乙醇進(jìn)行醇沉。齊曉輝等[12]按照料液比1:75的比例混勻后在室溫?cái)嚢? h，過濾得到多糖的冷水提取液。然后將濾渣也按照1:75的料液比在90 ℃水浴中攪拌4 h后過濾得到多糖的熱水提取液。將冷水提取液與熱水提取液合并后進(jìn)行濃縮，采用95%的乙醇進(jìn)行沉淀，多糖提取率在7.3%～22.6%之間。吳明江等[22]先用95%的乙醇在80 ℃條件下提取2 h除去小分子，然后按照1:15的料液比在90 ℃提取2 h，粗多糖的提取率約為15%。同樣地，嵇國利[13]和Cho等[23]在水提的工藝前先用乙醇浸提，然后再按照料液比1:20，65 ℃或者90 ℃熱水提取2 h，多糖提取率為34.87%。熱水浸提法提取多糖所需的時(shí)間較長，且提取的多糖含有較多水溶性雜質(zhì)，而在水提前增加醇提工藝，可去除一部分既溶于水又溶于乙醇的物質(zhì)，多糖的純度可以得到大大提高。

此外，在熱水浸提法的基礎(chǔ)上，還可以通過改變提取液的pH值來改進(jìn)滸苔多糖的提取工藝。林威等[24]采用堿法提取滸苔多糖，通過單因素多水平實(shí)驗(yàn)優(yōu)化料液比、提取溫度、提取時(shí)間和堿溶液濃度等因素，獲得了提取的最佳工藝條件，即提取溫度90 ℃、提取時(shí)間2.5 h、料液比1:4、NaOH溶液濃度0.3 mol/L，滸苔多糖的提取率可達(dá)3.1%。宋雪原等按照料液比1:50加入0.05 mol/L的HCl進(jìn)行回流提取2 h，濾渣重復(fù)提取三次，合并濾液后濃縮加入3倍體積的無水乙醇沉淀。孫士紅等[25,26]采用0.5 mol/L的NaOH對滸苔濾渣進(jìn)行提取，合并濾液后加入3倍體積的95%乙醇進(jìn)行沉淀，多糖的收率可達(dá)33.3%。張智芳等[27]將浸提液的pH和料液比分別調(diào)整為5和1:90，在80 ℃條件下提取4 h，多糖的提取率為8.73%。Ray[3]調(diào)整料液比為1:150，采用1 mol/L KOH溶液4～8 ℃提取16 h，然后30～35 ℃提取6 h，提取率可達(dá)4.32%；將上述剩余殘?jiān)戳弦罕?:150加入4 mol/L KOH后，30～35 ℃提取6 h，然后4～8 ℃提取16 h，仍可得到3.78%的滸苔多糖。嵇國利[13]先采用85%乙醇浸提，然后按照料液比1:20，再90 ℃條件下提取2 h，提取率為17.56%，將10倍2%的NaOH溶液再加入到剩余殘?jiān)校?0 ℃提取1 h，仍然可得到10.45%的滸苔多糖。與熱水浸提法相比，酸液或堿液提取法可提高對提取物的選擇性，但由于酸堿溶液對設(shè)備要求較高且會(huì)污染環(huán)境，因此不利于綠色化和工業(yè)化生產(chǎn)。

3.1.2 酶輔助提取法

酶輔助提取法在水提法的基礎(chǔ)上，結(jié)合酶技術(shù)提取多糖。酶可以降解滸苔細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素及果膠，而細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的破壞則可提高多糖的溶出速度和效率[28]。潘曉慧等[29]在滸苔的水提物中加入了中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，酶解后采用70%的乙醇進(jìn)行醇沉得到兩種滸苔多糖的粗品，提取率分別為22.90%和21.50%。呂海濤等[30]在滸苔的水提液中加入木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，3 h后過濾濃縮并加入4倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀，多糖的提取率可達(dá)27.75%。肖寶石等[31]比較了熱水提取法和酶輔助提取法的提取率，熱水浸提法的滸苔多糖提取率為10.43%，而加入木瓜蛋白酶，60 ℃酶解2 h后滸苔多糖的提取率可達(dá)13.88%。徐大倫等[32]引入纖維素酶提取滸苔多糖，40 ℃提取2.5 h，提取率可達(dá)20.22%。因而，酶輔助提取法中，酶的加入有利于破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和多糖的溶出，而且對于提取溫度的要求較低，因此，酶法是滸苔多糖提取最有優(yōu)勢和應(yīng)用前景的方法。

3.1.3 物理輔助提取法

3.1.3.1 超聲波輔助提取法

超聲波輔助提取法采用超聲波輔助溶劑提取多糖，超聲波通過破壞滸苔細(xì)胞結(jié)構(gòu)促進(jìn)多糖的溶出，縮短提取所需的時(shí)間，從而提高多糖的提取效率。郭雷等[33]通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化了超聲波輔助滸苔多糖提取的工藝條件，得到了提取的最佳工藝，在即溫度80 ℃、料液比1:63的條件下超聲28 min，提取率僅為25.84 mg/g。唐志紅等[34]在超聲功率531.17 W的條件下提取4.8 min，獲得的提取率為17.42%。該方法具有提取時(shí)間短、多糖的提取率較高的優(yōu)點(diǎn)。但同時(shí)，也由于該方法的提取時(shí)間過短，需要大量的實(shí)驗(yàn)來對提取條件進(jìn)行優(yōu)化來提高提取率。

3.1.3.2 微波輔助提取法

除了在多糖的提取中將超聲作為輔助手段外，微波由于能加速溶液對滸苔多糖的提取過程和多糖從細(xì)胞中的溶出而受到了研究者的重視。陳小梅等[35]調(diào)整料液比為1:62，使用610 W作用微波11 min提取滸苔多糖，提取率為7.58%。郭雷等[33]按照料液比1:78，在微波功率800 W，95 ℃的條件下作用32 min提取滸苔多糖，得到的提取率僅為4.04%。由此可見，微波輔助提取法可大大節(jié)約提取時(shí)間，并提高多糖的提取效率，但卻無法提高多糖得率和純度。目前，滸苔多糖的提取方法均以水提法為基礎(chǔ)，結(jié)合多種輔助提取技術(shù)衍生出了各種提取方法，但每種方法都有其特定的優(yōu)點(diǎn)和缺陷，而將多種方法結(jié)合使用，就可達(dá)到取長補(bǔ)短的效果，從而快速高效地提取滸苔多糖[36]。

3.2 滸苔多糖的純化方法

在通過熱水浸提等方法獲得滸苔多糖的粗品后，需要經(jīng)過進(jìn)一步的純化才能得到可用于結(jié)構(gòu)和活性研究的多糖樣品。首先，多糖的純化需要去除蛋白質(zhì)和其他小分子等非多糖雜質(zhì)。滸苔多糖去蛋白常用Savage法、三氯乙酸法和蛋白酶法[18]。王明瑩[37]利用鏈酶蛋白酶結(jié)合Savage試劑和透析處理，可將2種多糖中的蛋白質(zhì)和核酸除盡。林葉等[38]采用三氯乙酸脫法對粗滸苔多糖脫蛋白，脫蛋白率可達(dá)51.69%。目前，小分子雜質(zhì)的去除則可以采用乙醇重沉淀法、透析法、凝膠過濾法和離子交換樹脂法等。除此之外，純化后的滸苔多糖還需通過離子交換柱層析法和凝膠柱層析法等方法進(jìn)行進(jìn)一步地分級和精制。

離子交換色譜（Ion Exchange Chromatography，IEC）是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。滸苔多糖在一定pH值條件下所帶電荷不同，因此可以根據(jù)各多糖上電荷的差異而對多糖組分進(jìn)行純化和分離。齊曉輝等[11]使用例子交換色譜Q Sepharose Fast Flow，以 NaCl為流動(dòng)相對來源于青島緣管滸苔（Enteromorpha linza）、青島綠潮滸苔（Enteromorpha prolifera）和廈門沿海條滸苔（Enteromorpha clathrata）的滸苔多糖進(jìn)行梯度洗脫和純化，分別得到了5個(gè)、4個(gè)和3個(gè)多糖組分。潘曉慧等[29]采用DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析對江蘇滸苔多糖進(jìn)行純化，分別以0.5、0.6和1 mol/L NaCl作為流動(dòng)相，分離得到了4個(gè)多糖組分。焦麗麗等[16]采用DEAE Sepharose CL-6B作為分離介質(zhì)純化腸滸苔多糖，以0.9% NaCl作為流動(dòng)相，分離得到了2個(gè)多糖組分。許晶晶等[39]以陰離子交換柱為分離介質(zhì)純化滸苔多糖，以0.2～0.8 mol/L NaCl作為流動(dòng)相得到了1個(gè)多糖組分。

表2 純化滸苔多糖所用的分離方法匯總 Table 2 The summary of methods for purification of Enteromorpha polysaccharide

除此以外，凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatography、GPC）也常用于滸苔多糖的分離和純化。許福超等[20]以Sephadex G-75凝膠柱作為分離介質(zhì)，用1.0 mL/min水作為流動(dòng)相洗脫，得到一個(gè)滸苔多糖的組分。呂海濤等[30]利用Sephadex G-100凝膠，以水作為流動(dòng)相得到了2個(gè)多糖組分。此外，徐大倫等[40]利用凝膠柱SephacryTm S-300 HR分離得到2個(gè)滸苔多糖的組分。綜上，離子交換法是基于多糖所帶電荷不同來實(shí)現(xiàn)對滸苔多糖的不同組分進(jìn)行分離的，而凝膠滲透色譜是利用多糖的分子大小的差異來實(shí)現(xiàn)不同組分的分離。因此，對于分子量相差不大但是所帶電荷不同的多糖組分可以優(yōu)先選用離子交換色譜進(jìn)行分離，而對于所帶電荷情況類似但分子量有較大差異的組分則可優(yōu)先選用凝膠滲透色譜進(jìn)行區(qū)分。在滸苔多糖的分離中往往先用離子交換柱層析得到幾個(gè)不同組分，再用凝膠柱層析獲得更加均一的不同分子量大小多糖組分。Lin等[41]先以0.7 mol/L NaCl溶液為洗脫液，采用 0.85 mL/min流速，利用DEAE-Cellulose 52進(jìn)行離子交換層析，再用以水為洗脫液，按照0.85 mL/min流速，采用Bio-Gel P-2凝膠過濾層析，進(jìn)一步純化多糖組分。Tang等[42]先利用DEAE-Sepharose CL-6B離子交換層析，以0.2～1.5 mol/L NaCl溶液為洗脫液，流速0.8 mL/min，再用Sephadex G-200凝膠可得到純化的多糖組分。

4 滸苔多糖的降解方法

目前關(guān)于降解滸苔多糖的報(bào)道較少，但是按照降解所用的方法進(jìn)行分類，可以將滸苔多糖降解的方法總結(jié)為三大類，即物理降解法、化學(xué)降解法和酶法降解。

4.1 化學(xué)法降解滸苔多糖

化學(xué)法降解滸苔多糖的報(bào)道較少，僅有高玉杰等[44]利用三氟乙酸（TFA）對滸苔多糖進(jìn)行降解，用于制備低分子量的滸苔多糖。另外，段科等[45]采用自由基降解滸苔多糖，并獲得滸苔多糖最佳降解工藝條件為H2O2聯(lián)合維生素C濃度15 mmol/L、溫度50 ℃、反應(yīng)時(shí)間2 h和料液比1:50（g/mL），滸苔寡糖的得率為58.33%。呂海濤等[5]利用TFA和硝酸對滸苔多糖進(jìn)行降解，并對降解的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。

4.2 物理法降解滸苔多糖

物理法降解滸苔多糖的報(bào)道同樣比較少，可能是由于物理法降解多糖的條件較為劇烈，會(huì)對寡糖的結(jié)構(gòu)造成破壞。Li等[46]利用微波輔助的方法降解滸苔多糖，但是由于微波作用的非特異性，降解得到的產(chǎn)物分子量分布差異較大，從3.1 ku到446.5 ku均有分布。段科等[47]采用微波輔助鹽酸/過氧化氫降解滸苔多糖，發(fā)現(xiàn)在1 mol/L的鹽酸溶液中加入30%過氧化氫（加入量5%），在900 W微波，50 ℃條件下反應(yīng)10 min，制備的寡糖得率可達(dá)77.88%。

4.3 酶法降解滸苔多糖

與化學(xué)法和物理法降解法相比，酶解法降解滸苔多糖反應(yīng)條件溫和，而且產(chǎn)物特異性好，因而受到了研究者的關(guān)注報(bào)道較多。目前，用于降解滸苔多糖的酶多為纖維素酶、果膠酶和糖化酶等商業(yè)化酶制劑（如表3所示）。張高麗等[48]采用Alteromonassp. A321產(chǎn)生的滸苔多糖降解酶降解滸苔多糖，發(fā)現(xiàn)在14 mg/mL底物溶液中加入1.5%的酶，并控制反應(yīng)條件使pH=6.5、溫度33 ℃，反應(yīng)6 h后，對多糖的降解率可達(dá)61.21%，酶解產(chǎn)物包括酸性寡糖片段和中性寡糖片段。Zhou等[49]加入48.5 U/mL果膠酶和糖化酶，45.2 ℃下反應(yīng)3 h降解滸苔多糖。徐杰等[50]添加9.60 U/mL果膠酶，在56 ℃和pH 4.45條件下，反應(yīng)3 h降解滸苔多糖。此外，還有利用糖化酶和α-淀粉酶對滸苔多糖進(jìn)行降解的報(bào)道[51,52]。

表3 酶法降解滸苔多糖方法匯總 Table 3 The summary of methods for enzymatic degradation of Enteromorpha polysaccharide

李銀平等[53,54]篩選出一株高產(chǎn)滸苔多糖降解酶的菌株Alteromonassp. A321。對該菌株產(chǎn)生的滸苔多糖降解酶組分進(jìn)行硫酸銨沉淀、DEAE-CL-6B離子交換層析等純化步驟后，獲得了兩個(gè)電泳純的滸苔多糖降解酶，分別命名為酶L1和L2，由于沒有獲得這兩個(gè)酶的基因序列，因此無法判斷L1和L2屬于是新型的多糖裂解酶或者糖苷水解酶。此外，除了這一個(gè)關(guān)于滸苔降解酶的報(bào)道，目前尚無專一性降解滸苔多糖的酶的報(bào)道，所以到底有沒有專門降解滸苔多糖的酶，也是一個(gè)值得進(jìn)一步確定的問題。

5 滸苔多糖降解產(chǎn)物的活性

目前，關(guān)于滸苔多糖降解產(chǎn)物活性的研究和報(bào)道正在急劇增長，但是目前的文獻(xiàn)報(bào)道較為零散，而且由于滸苔多糖降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，相關(guān)活性的機(jī)制及滸苔降解產(chǎn)物的構(gòu)效關(guān)系未得到闡明。Lv等[5]采用酸法制備了滸苔多糖降解產(chǎn)物及其硒化衍生物，并對其抗菌活性進(jìn)行了評價(jià)，結(jié)果表明硒化的滸苔多糖降解產(chǎn)物對大腸桿菌（Eschetichia coli）和植物病原真菌的抑制活性較強(qiáng)，而對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制活性則稍弱。Liu等[7]在快速老化小鼠（SAMP8 mice）模型上對滸苔多糖降解產(chǎn)物的抗衰老和抗氧化作用進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)滸苔多糖降解產(chǎn)物可以顯著降低炎癥因子如IFN-γ、TNF-α和IL-6的水平，提高了重組人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的水平，起到了保護(hù)海馬神經(jīng)元的作用。Liu等[6]評價(jià)了滸苔多糖降解產(chǎn)物對于環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠模型的免疫調(diào)節(jié)作用，研究結(jié)果表明滸苔多糖降解產(chǎn)物可以促進(jìn)NO的分泌，上調(diào)IL-1β、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)水平，激活iNOS、COX2和NLRP3炎癥小體，從而起到免疫激活的作用。Xu等[50]對三種滸苔多糖降解產(chǎn)物組分的抗氧化活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明滸苔多糖降解產(chǎn)物可以有效地清楚OH·、超氧陰離子及DPPH自由基，從而起到了抗氧化的作用。Li等[46]以維生素C作為陽性對照，考察了低分子量的滸苔多糖降解產(chǎn)物的抗氧化活性，研究結(jié)果表明滸苔多糖降解產(chǎn)物對于超氧陰離子和羥基自由基顯示出了很強(qiáng)的抑制和清除能力，IC50達(dá)到了0.39 mg/mL，而且結(jié)果還顯示滸苔多糖降解產(chǎn)物的抗氧化能力與分子量具有密切關(guān)系。Zhang等[4]考察了H2O2氧化法制備的滸苔多糖降解產(chǎn)物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)濃度為2.28 mg/mL的寡糖對于羥基自由基的清除率達(dá)到了92.2%，高于同等濃度的滸苔多糖，這是由于在多糖降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中存在較多的羥基，顯示出了很好的自由基清除能力。Cui等[57]利用滸苔多糖降解產(chǎn)物制備了鐵離子和多糖降解產(chǎn)物的絡(luò)合物，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)該絡(luò)合物對于缺鐵性貧血的小鼠顯示出了很好的治療效果，可進(jìn)一步開發(fā)為補(bǔ)充鐵元素的營養(yǎng)助劑。此外，Wang等[58]考察了滸苔多糖降解產(chǎn)物的抗凝血活性，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)多糖降解產(chǎn)物的抗凝血活性與其結(jié)構(gòu)中的硫酸集團(tuán)的數(shù)量和分布具有密切關(guān)系。Jin等[59]從滸苔多糖中制備得到了葡萄糖醛酸-木糖-鼠李糖組分EP-3-H，并考察了該組分對于人肺癌細(xì)胞增殖的抑制活性，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)EP-3-H能夠與成纖維生長因子FGF1和FGF2作用而發(fā)揮其抗腫瘤活性。目前對于滸苔多糖降解產(chǎn)物活性的研究較為粗淺，這也是由于滸苔多糖的結(jié)構(gòu)過于復(fù)雜，而且尚未有適當(dāng)?shù)姆椒ǐ@取精細(xì)結(jié)構(gòu)確定的多糖降解產(chǎn)物來研究其構(gòu)效關(guān)系。

6 結(jié)論與展望

滸苔多糖作為滸苔的主要活性成分，可用于開發(fā)新型食品、藥品和保健品等，具有廣闊的開發(fā)前景。目前，滸苔多糖的規(guī)?；崛」に囈讶諠u成熟，但由于純度太低，無法滿足高值化利用的要求，因而高純度滸苔多糖的制備是目前研究的熱點(diǎn)之一。另一方面，滸苔多糖的分子量通常在400 ku以上，溶解性和生物利用度等受其分子量的影響，其生物活性和應(yīng)用受到了極大的限制，因此如何開發(fā)能夠高效降解滸苔多糖的工具酶，實(shí)現(xiàn)滸苔多糖降解產(chǎn)物的高效定向地制備也是未來滸苔多糖生物資源開發(fā)和利用的熱點(diǎn)。此外，由于滸苔多糖的單糖組成以及糖苷鍵連接方式復(fù)雜多樣，再加之分枝結(jié)構(gòu)的存在，使得滸苔多糖和滸苔多糖降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析異常困難，因此如何精確分析滸苔多糖和寡糖的精細(xì)結(jié)構(gòu)對于研究滸苔多糖及其降解產(chǎn)物的構(gòu)效關(guān)系、促進(jìn)滸苔多糖的高值化開發(fā)和利用具有重要的推動(dòng)作用。