氮硫磷氯共摻雜熒光碳點(diǎn)探針用于食品中 胭脂紅的快速檢測(cè)

錢敏捷，孫慧娟，何海林，趙盛燕，肖麗霞，楊振泉，胡欽

（揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225001）

食品著色劑作為一種常用的食品添加劑，通常用于改善食品的口感、香味和顏色[1]。胭脂紅（CRM）作為一種人造色素，已在食品工業(yè)中被廣泛作為著色劑使用[2]。CRM屬于合成偶氮顏料，呈顆粒狀或粉末狀，顏色為紅色至深紅色。據(jù)報(bào)道，CRM具有致癌和致突變作用[3,4]，而且具有一定的遺傳毒性潛力[5]。因此，許多國(guó)家嚴(yán)格規(guī)定了食品中CRM的最大使用限量。例如，CRM在中國(guó)和歐盟允許被使用，而在美國(guó)和日本則被禁止使用[2]；CODEX規(guī)定食品中添加CRM的限量為50.0～500.0 mg/kg[6]；我國(guó)允許在果汁、山楂制品、糖果、醬菜和飲料中添加CRM的限量不得超過50.0 mg/kg或50.0 mg/L[7]；歐盟規(guī)定在香腸、果醬等食品中使用CRM的限量為100.0～200.0 mg/kg[8]。盡管不同國(guó)家對(duì)食品中CRM的使用都規(guī)定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，但是在食品加工中仍存在CRM添加過量的情況。因此，開發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的CRM檢測(cè)方法對(duì)于保障食品安全和人類健康至關(guān)重要。

目前，常用的CRM檢測(cè)方法包括分光光度法[9]，毛細(xì)管電泳[10]，高效液相色譜（HPLC）[11]和伏安法[12]等。然而，這些方法大多數(shù)都具有局限性。例如，分光光度法儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、快速，但檢測(cè)準(zhǔn)確度不高；毛細(xì)管電泳法分離效果好，所需樣品量少，但其檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性差；HPLC法雖然可以實(shí)現(xiàn)食品中胭脂紅的有效分離和檢測(cè)，但是其儀器價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜且耗時(shí)長(zhǎng)。因此，需要開發(fā)一種簡(jiǎn)單、成本低、靈敏、準(zhǔn)確的快速分析方法來檢測(cè)食品中的CRM。

碳量子點(diǎn)，簡(jiǎn)稱碳點(diǎn)（carbon nanodots，CDs）是一種尺寸小于10 nm，具有類球形結(jié)構(gòu)的新型熒光碳納米材料[13]。由于CDs具有優(yōu)良的物理化學(xué)性質(zhì)，例如良好的生物兼容性[14]、低毒性[15]、發(fā)射光譜可調(diào)諧和高的光穩(wěn)定性[16]，其自2004年被發(fā)現(xiàn)以來，就迅速吸引了人們的廣泛關(guān)注。目前，制備碳量子點(diǎn)的方法主要包括電弧放電[17]、水熱合成[18]、熱解法[19]、微波輔助加熱[20]、中和加熱[21]和超聲處理[22]等。近期研究表明，通過選擇合適的雜原子供體，向CDs中摻入適當(dāng)?shù)碾s原子，制備摻雜化的CDs探針，是提升CDs探針選擇性和靈敏度的有效手段[23]。迄今為止，已有大量工作表明，摻雜化的CDs在食品有害因子檢測(cè)方面，包括檸檬黃[24]、谷胱甘肽[14]、單寧酸[25]、農(nóng)藥[26]等，展現(xiàn)出高選擇性和高靈敏度的優(yōu)勢(shì)。

本工作以葡萄糖為碳源，乙二胺、磷酸、鹽酸和硫酸為雜原子供體，借助酸堿中和自放熱作用，制備出氮硫磷氯共摻雜碳點(diǎn)（N,S,P,Cl-CDs），并將其作為熒光探針用于食品中CRM的快速檢測(cè)。本工作對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，研究了該方法的線性范圍、靈敏度、選擇性及抗干擾性，并探究了N,S,P,Cl-CDs和CRM之間的相互作用，進(jìn)而提出CRM對(duì)N,S,P,Cl-CDs熒光猝滅的機(jī)理。最后，本檢測(cè)方法被用于實(shí)際樣品中CRM檢測(cè)的可行性分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

本工作所有食品樣品均采自江蘇省揚(yáng)州市本地市場(chǎng)；胭脂紅和硫酸奎寧為分析純，購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司；透析膜（截留分子量MWCO=500～1000 Da）購(gòu)自美國(guó)Spectrum公司；其他藥品和試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；本實(shí)驗(yàn)室使用的超純水來自Milli-Q-RO4超純水凈化系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司。

F-320熒光光譜儀，天津港東科技股份有限公司；HT 7800透射電子顯微鏡TEM，日本Hitachi公司；Cary 5000紫外-可見-近紅外吸收光譜儀UV，美國(guó)Varian公司；Cary 610/670顯微紅外光譜儀IR，美國(guó)Varian公司。

1.2 N,S,P,Cl-CDs的制備

稱取0.4 g葡萄糖置于50.0 mL玻璃燒杯中，依次加入6.0 mL乙二胺、2.0 mL濃H3PO4、2.0 mL濃HCl和2.0 mL H2SO4（質(zhì)量濃度為70%）。在酸堿中和自放熱作用下，反應(yīng)混合物在數(shù)秒內(nèi)變成泡沫狀。獲得的反應(yīng)產(chǎn)物自然冷卻至室溫后，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至透析管（MWCO=500～1000 u）中，然后將其放入盛有1 L超純水的燒杯中，透析3 d。在透析過程中，每隔24 h向燒杯中注入新的超純水，并不斷攪拌，最終得到棕色的N,S,P,Cl-CDs溶液。冷凍干燥后得到0.28 gN,S,P,Cl-CDs粉末，產(chǎn)率為70%。最后，將干燥后的N,S,P,Cl-CDs粉末置于干燥器中備用。

1.3 工作參數(shù)優(yōu)化

影響熒光猝滅效率的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)條件，包括N,S,P,Cl-CDs溶液濃度、反應(yīng)體系pH和反應(yīng)時(shí)間。在不特殊說明的情況下，N,S,P,Cl-CDs溶液采用超純水進(jìn)行配制。設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)（λex）和發(fā)射波長(zhǎng)（λem）分別為380 nm和453 nm。

1.3.1 N,S,P,Cl-CDs溶液濃度優(yōu)化

為優(yōu)化N,S,P,Cl-CDs的濃度，使用超純水制備不同濃度（0.01～1.0 mg/mL）的2.0 mLN,S,P,Cl-CDs溶液，記錄加入10.0 μmol/L CRM前后N,S,P,Cl-CDs溶液熒光強(qiáng)度的變化（F0/F）。

1.3.2 反應(yīng)體系pH優(yōu)化

為優(yōu)化pH，分別使用磷酸緩沖鹽溶液（10 mmol/L，pH 2.0～11.0）和超純水（pH 5.8）配制2.0 mL最優(yōu)濃度的N,S,P,Cl-CDs溶液，記錄添加10.0 μmol/L CRM前后N,S,P,Cl-CDs溶液熒光強(qiáng)度的變化（F0/F）。

1.3.3 反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化

為優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間，在最優(yōu)濃度和最優(yōu)pH條件下，配制2.0 mLN,S,P,Cl-CDs溶液，向其中加入10.0 μmol/L CRM，記錄不同時(shí)間間隔反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度的變化（F0/F）。

1.4 線性范圍測(cè)定

將不同濃度的CRM逐步添加到2.0 mLN,S,P,Cl-CDs溶液（0.03 mg/mL）中，使CRM在N,S,P,Cl-CDs溶液中的濃度在0.1～20.0 μmol/L范圍內(nèi)。在λex/λem=380/453 nm下記錄含有不同濃度CRM的N,S,P,Cl-CDs溶液的熒光強(qiáng)度。繪制熒光猝滅效率F0/F與N,S,P,Cl-CDs溶液中CRM濃度的線性關(guān)系圖，其中F0和F分別代表添加CRM前后N,S,P,Cl-CDs溶液的熒光強(qiáng)度。

1.5 選擇性測(cè)試

在2.0 mLN,S,P,Cl-CDs溶液（0.03 mg/mL）中分別添加實(shí)際樣品中可能存在的干擾物質(zhì)，包括15種氨基酸（蛋氨酸，絲氨酸，精氨酸，蘇氨酸，組氨酸，L-甲硫氨酸，DL-半胱氨酸，酪氨酸，甘氨酸，亮氨酸，谷氨酸，丙氨酸，色氨酸，天冬氨酸和苯丙氨酸）、3種小分子（GSH，葡萄糖和抗壞血酸）、10種陰離子（F-，Br-，I-，Cl-，NO3-，HCO3-，CO32-，SO42-，H2PO4-和HPO42-）和8種陽離子（Na+，Ag+，K+，NH4+，Mg2+，Zn2+，F(xiàn)e2+和Ca2+），添加濃度均為0.1 mmol/L，在λex/λem=380/453 nm 下記錄添加干擾物前后N,S,P,Cl-CDs溶液的熒光強(qiáng)度。

1.6 抗干擾性測(cè)試

首先，在2.0 mL 0.03 mg/mLN,S,P,Cl-CDs溶液中添加0.01 mmol/L CRM，然后分別添加實(shí)際樣品中可能存在的上述干擾物質(zhì)進(jìn)行混合，添加濃度均為0.1 mmol/L。在λex/λem=380/453 nm下，記錄添加干擾物前后N,S,P,Cl-CDs溶液的熒光強(qiáng)度。

1.7 實(shí)際樣品分析

選取的含有CRM的食品樣品，包括李干、蜜桃干、果丹皮、草莓果醬、西瓜霜、功能飲料，作為實(shí)際樣品。對(duì)于固體樣品，先將其研碎或剪碎，然后稱取0.6 g固體樣品，溶解于10.0 mL超純水中，超聲處理10 min。在10000 r/min下，離心5 min，收集上清液。對(duì)于液體樣品，取適量樣品，超聲20 min，除去樣品中的氣泡，準(zhǔn)確量取5.0 mL，用超純水稀釋至25.0 mL。將樣品提取液通過醋酸纖維素膜過濾（0.22 μm，26 mm內(nèi)徑，天津津騰有限公司）后，取20.0 μL樣品提取液，加入2.0 mL 0.03 mg/mLN,S,P,Cl-CDs溶液，在λex/λem=380/453 nm下，記錄添加提取液前后N,S,P,Cl-CDs溶液的熒光強(qiáng)度。采用國(guó)標(biāo)法[27]對(duì)上述樣品中的CRM含量進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性。

1.8 數(shù)據(jù)處理

本工作的所有數(shù)據(jù)均采用Origin軟件（v8.0）進(jìn)行處理，特別指出，N,S,P,Cl-CDs的粒徑分布是采用Nano Measurer軟件（v1.2）進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 N,S,P,Cl-CDs的理化性質(zhì)表征

利用TEM對(duì)N,S,P,Cl-CDs的形貌和尺寸分布進(jìn)行表征，如圖1a所示，制備的N,S,P,Cl-CDs顆粒分散性良好，具有類球形結(jié)構(gòu)。圖1a的插圖是通過隨機(jī)計(jì)數(shù)電鏡圖上100個(gè)顆粒的大小，得到的粒徑分布直方圖。N,S,P,Cl-CDs的粒徑分布范圍為0.25～5.0 nm，平均粒徑為2.27 nm。

采用傅里葉紅外光譜FT-IR對(duì)N,S,P,Cl-CDs的官能團(tuán)進(jìn)行了表征，如圖1b所示，3500～3350 cm-1和3150～2760 cm-1處的寬吸收峰屬于-NH和-OH伸縮振動(dòng)，1670 cm-1處的強(qiáng)吸收峰來自C=O伸縮振動(dòng)，表明N,S,P,Cl-CDs表面存在氨基和羧基，賦予了N,S,P,Cl-CDs良好的水溶性。1250 cm-1處的吸收峰歸因于C-O伸縮振動(dòng)。2300、1500、1180、995和827 cm-1處的強(qiáng)吸收峰，分別歸因于S-H伸縮振動(dòng)、N-H彎曲，C-N伸縮，P-O-C彎曲和C-Cl伸縮振動(dòng)。以上結(jié)果表明，N、P、S和Cl雜原子被成功摻雜到CDs中。

通過紫外可見吸收光譜（UV-Vis）研究了N,S,P,Cl-CDs的紫外吸收性質(zhì)。如圖2a所示，N,S,P,Cl-CDs的UV-Vis光譜在紫外區(qū)域具有兩個(gè)吸收峰，分別為290 nm和368 nm，前者是由于C=O鍵的n→π*躍遷，后者是由于N、P、S和Cl雜原子引起的表面激發(fā)態(tài)[28]。

采用熒光光譜研究了N,S,P,Cl-CDs的熒光性質(zhì)。N,S,P,Cl-CDs的激發(fā)光譜，如圖2a所示，N,S,P,Cl-CDs的激發(fā)峰位于380 nm。N,S,P,Cl-CDs的發(fā)射光譜，如圖2a所示，N,S,P,Cl-CDs在380 nm處激發(fā)時(shí)的發(fā)射峰為453 nm。圖2b為N,S,P,Cl-CDs在不同λex下的熒光光譜。當(dāng)λex從300 nm增加到490 nm時(shí)，N,S,P,Cl-CDs的λem在453 nm到553 nm范圍內(nèi)變動(dòng)，即N,S,P,Cl-CDs的λem表現(xiàn)出典型的λem依賴行為[29]。在紫外線照射下，N,S,P,Cl-CDs溶液呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光（圖2b的插圖）。如圖2c所示，以硫酸奎寧為參考物質(zhì)，測(cè)得N,S,P,Cl-CDs的量子產(chǎn)率為5.8%。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1 N,S,P,Cl-CDs濃度對(duì)檢測(cè)CRM的影響

本實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度的N,S,P,Cl-CDs對(duì)CRM檢測(cè)的影響。如圖3a所示，隨著N,S,P,Cl-CDs濃度變化，F(xiàn)0/F也隨之變化。當(dāng)N,S,P,Cl-CDs濃度為0.03 mg/mL時(shí)，F(xiàn)0/F達(dá)到最高值。因此，選擇0.03 mg/mL作為CRM檢測(cè)的最佳N,S,P,Cl-CDs濃度。

2.2.2 pH對(duì)檢測(cè)CRM的影響

本實(shí)驗(yàn)研究了不同pH值（pH=2.0～11.0）對(duì)CRM檢測(cè)的影響。如圖3b所示，F(xiàn)0/F在pH 2.0～11.0的酸堿度范圍內(nèi)無較大差別。為了簡(jiǎn)化后續(xù)的工作，選擇pH 5.8（超純水）作為檢測(cè)CRM的最佳pH。

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)CRM的影響

本實(shí)驗(yàn)在N,S,P,Cl-CDs濃度為0.03 mg/mL，pH為5.8的條件下，考察了反應(yīng)時(shí)間對(duì)CRM檢測(cè)的影響。由圖3c所示，向N,S,P,Cl-CDs溶液（0.03 mg/mL）中加入CRM后，F(xiàn)0/F在1.0 min內(nèi)迅速增加，隨著時(shí)間的繼續(xù)增加，F(xiàn)0/F并沒有發(fā)生明顯改變。因此，選擇1.0 min作為檢測(cè)CRM的最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.3 不同濃度CRM對(duì)N,S,P,Cl-CDs熒光的影響

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，探究了CRM對(duì)N,S,P,Cl-CDs熒光淬滅的可能性。圖4a顯示了在不同濃度CRM存在的條件下，N,S,P,Cl-CDs溶液熒光強(qiáng)度的變化。當(dāng)CRM濃度逐步增加（0.0～105.0 μmol/L）時(shí)，N,S,P,Cl-CDs的熒光強(qiáng)度逐漸降低，表明CRM可以有效地猝滅N,S,P,Cl-CDs的熒光強(qiáng)度。由圖4b可見，CRM的濃度在0.01～14.0 μmol/L范圍內(nèi)時(shí)，F(xiàn)0/F與CRM濃度呈線出良好的線性關(guān)系，符合Stern-Volmer方程。所提出熒光方法的檢測(cè)限為9.38 nmol/L。將本工作與先前報(bào)道的基于CDs的熒光檢測(cè)方法進(jìn)行比較（表1），結(jié)果顯示，本工作報(bào)道的基于N,S,P,Cl-CDs的檢測(cè)方法，其靈敏度優(yōu)于之前報(bào)道的基于CDs的熒光檢測(cè)法，表明本檢測(cè)方法具有高靈敏度。

表1 基于CDs的胭脂紅檢測(cè)方法的對(duì)比 Table 1 Comparison of CDs-based fluorescence methods for CRM detection

2.4 . N,S,P,Cl-CDs的選擇性和抗干擾性

本工作探究了N,S,P,Cl-CDs對(duì)實(shí)際樣品中可能存在的干擾物質(zhì)（不同種類的氨基酸，陰離子，陽離子和一些其他小分子）的選擇性。由圖5a所示，當(dāng)向2.0 mL 0.03 mg/mLN,S,P,Cl-CDs溶液中加入0.01 mmol/L的CRM及其他干擾性物質(zhì)時(shí)，只有加入CRM會(huì)明顯猝滅N,S,P,Cl-CDs的熒光，而其他可能存在的干擾物質(zhì)對(duì)N,S,P,Cl-CDs熒光強(qiáng)度的影響幾乎可以忽略，表明N,S,P,Cl-CDs對(duì)CRM檢測(cè)具有高選擇性。

同時(shí)，本工作研究了N,S,P,Cl-CDs對(duì)CRM檢測(cè)的抗干擾性。向2.0 mL 0.03 mg/mLN,S,P,Cl-CDs溶液中加入0.01 mmol/L的CRM后，再加入0.1 mmol/L其它干擾物質(zhì)，測(cè)得加入干擾物質(zhì)前后N,S,P,Cl-CDs/CRM檢測(cè)體系熒光強(qiáng)度的變化。如圖5b所示，在向N,S,P,Cl-CDs/CRM混合體系中加入上述可能存在的干擾物質(zhì)后，沒有觀察到熒光強(qiáng)度的明顯變化，表明N,S,P,Cl-CDs具有較強(qiáng)的抗干擾性。

2.5 CRM對(duì)N,S,P,Cl-CDs熒光的猝滅機(jī)理研究

為研究N,S,P,Cl-CDs和CRM之間的相互作用，本工作獲得了CRM的紫外可見吸收光譜及N,S,P,Cl-CDs的熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。如圖6a所示，CRM的紫外可見吸收光譜在200～700 nm范圍內(nèi)有吸收特性；N,S,P,Cl-CDs的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜顯示，其在380 nm處有一個(gè)激發(fā)峰，在453 nm處有一個(gè)相應(yīng)的發(fā)射峰?？梢姡珻RM的紫外可見吸收光譜與N,S,P,Cl-CDs的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜有明顯的重疊，表明CRM與N,S,P,Cl-CDs之間的熒光猝滅是由內(nèi)濾效應(yīng)引起的。

通常，熒光猝滅還可以分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅[32,33]。為進(jìn)一步探究CRM對(duì)N,S,P,Cl-CDs的熒光猝滅機(jī)制，本工作研究了CRM對(duì)N,S,P,Cl-CDs熒光壽命的影響。圖6b為N,S,P,Cl-CDs和N,S,P,Cl-CDs/CRM的熒光壽命衰減曲線。通過對(duì)熒光衰減曲線進(jìn)行一階函數(shù)擬合，發(fā)現(xiàn)N,S,P,Cl-CDs和N,S,P,Cl-CDs/CRM的壽命分別為2.48和2.20 ns，表明CRM的引入并未導(dǎo)致N,S,P,Cl-CDs平均壽命發(fā)生較大改變。因此，CRM與N,S,P,Cl-CDs之間的反應(yīng)屬于靜態(tài)相互作用。總的來說，CRM對(duì)N,S,P,Cl-CDs的熒光猝滅是內(nèi)濾效應(yīng)和靜態(tài)猝滅協(xié)同作用的結(jié)果。

2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

為了研究本檢測(cè)方法用于實(shí)際樣品檢測(cè)的可行性，本工作將該方法用于各種食品樣品中的CRM檢測(cè)。如表2所示，李干、蜜桃干、果丹皮、草莓果醬、西瓜霜和功能飲料提取物中的CRM含量分別為0.04、0.04、0.05、0.05、0.17和0.01 μmol/L。加標(biāo)回收率結(jié)果顯示，該實(shí)際樣品檢測(cè)的加標(biāo)回收率在97.7%～104.2%的范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）低于3.29%，表明該方法具有高準(zhǔn)確性。將檢測(cè)結(jié)果與HPLC法（國(guó)標(biāo)法）的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩種方法獲得的檢測(cè)結(jié)果相近，進(jìn)一步證明了該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。

表2 食品樣品中CRM的檢測(cè) Table 2 Detection of CRM in various food samples

3 結(jié)論

本工作建立了一種基于N,S,P,Cl-CDs的熒光檢測(cè)方法用于CRM的快速檢測(cè)。該方法獲得的線性范圍為0.01～14.0 μmol/L，檢測(cè)限低至9.38 nmol/L。除了高靈敏度，該方法還具有制備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、成本低、選擇性好、抗干擾性強(qiáng)以及檢測(cè)速度快的優(yōu)點(diǎn)。最后，本工作將該方法用于實(shí)際食品樣品中CRM的檢測(cè)，加標(biāo)回收率在97.8%～101.5%之間，RSDs低于3.29%，結(jié)果令人滿意，表明本工作制備的N,S,P,Cl-CDs探針在CRM檢測(cè)方面具有良好的應(yīng)用前景。