梁王茶水提物急性毒性評價

趙春燕，龔加順，王秋萍

（云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，云南昆明 650201）

關鍵字：梁王茶；水提物；急性毒性；安全評價

梁王茶屬（Nothopanax Miq.）又名山檳榔、樹五加等，系五加科（Araliaceae）無毛刺灌木或喬木，無皮刺，其葉形單葉或掌狀復葉，葉柄細長，無托葉[1,2]。 我國主要有2種即異葉梁王茶[Nothopanax davidii(Franch.) Harms ex Diels]和掌葉梁王茶[N.delavayi (Franch.) Harms ex Diels][3,4]。

梁王茶具有較高的藥用價值[5]，常被人們當作時蔬食用，如在陽宗境內(nèi)有著“茶不泡水當?shù)啦恕盵1]。梁王茶嫩莖葉不僅可作為蔬菜食用[6]，還可制成梁王茶干葉泡水喝[7]，其樹皮被用來提取栲膠，樹葉常被用來驅(qū)殺害蟲[7]。梁王茶作為藥用材料時，有清熱、祛風除濕藥活絡、治療喉嚨腫痛等作用[8,9]。另據(jù)報道，梁王茶多糖也有較好的雙向免疫調(diào)節(jié)、抗氧化應激和抗炎癥的生理活性作用[10]。

梁王茶的化學成分組成和提取是目前研究較多的一個方面。楊青等[3]使用色譜法首次從掌葉梁王茶莖皮中分離出了三對節(jié)酸和原兒茶酸等化合物，這些化合物被報道具有較好的生理活性作用。庾石山等[11-15]從異葉梁王茶甲醇提取物中分離出八種五環(huán)三貼皂苷單體，從樹皮醇提物中分離得到異葉梁王茶苷Ⅶ和Ⅷ、梁王茶苷Ⅱ及五種新的Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ和Ⅺ梁王茶苷化合物。繆明志等[10]研究了不同部位掌葉梁王茶多糖的含量分布，發(fā)現(xiàn)可溶性多糖含量分布在根部最高，可達1.68%。洪化鵬等[16]在研究異葉梁王茶鮮葉蒸餾精油的過程中，發(fā)現(xiàn)其精油主要包含月桂烯等化合物。趙春燕等[17]檢測了掌葉梁王茶葉中黃酮、多酚等組分的含量，并對其抗氧化能力進行了檢測，發(fā)現(xiàn)茶粉的抗氧化能力強于水提物。

上述研究表明梁王茶含有較多種類的萜類化合物及其他活性成分，有著較高藥用價值，但是對于梁王茶的毒理學研究尚無報道，為進一步開發(fā)及挖掘梁王茶的價值，有必要對其毒理學進行研究。因此，本研究對梁王茶的急性毒性采用LD50評價方法進行初探，以對梁王茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

掌葉梁王茶由蘭坪潤民農(nóng)產(chǎn)品有限責任公司提供，將掌葉梁王茶葉制成干葉備用。

ALT、AST、URE、CREA試劑盒，邁克生物股份有限公司。3100全自動生化分析儀，日本株式會社日立制作所。

1.2 方法

1.2.1 梁王茶水提物的制備

梁王茶與水的比例為1 g:10 mL，沸水浸提30 min，過濾得到濾液。按上述條件重復浸提一次，合并兩次濾液，在60 ℃減壓濃縮，濃縮液真空冷凍干燥得到梁王茶水提物備用。真空冷凍干燥得到的梁王茶水提物主要由水溶性總糖236.05 g/kg、水溶性蛋白質(zhì)99.47 g/kg、水溶性氨基酸30.83 g/kg、總多酚27.08 g/kg、水溶性多糖17.99 g/kg、總黃酮2.03 g/kg等化學組分組成[17]。

1.2.2 實驗動物

SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，體重20±2 g，購于昆明醫(yī)科大學（SCXK(滇)2015-0002）。基礎飼料喂養(yǎng)，自由飲水和攝食，12 h晝夜交替、環(huán)境溫度20±2 ℃，相對濕度40%～70%。

1.2.3 正式實驗

參照《食品國家安全標準急性經(jīng)口毒性試驗》[18]霍恩氏法進行預實驗。根據(jù)預實驗結果，小鼠未出現(xiàn)死亡，存活率達100%，無法得出0%和100%的估計致死量（Dn，Dm）。因此采用限量法進行經(jīng)口急性毒性實驗。84只小鼠（雌雄各半）設置為6個劑量組（15000、

10500、7350、5145、3601.5、2521 mg/kg·bw，n=12）和一個空白對照組（Control，n=12），組間劑量比為1:0.7，灌胃體積為30 mL/kg。給藥時空白對照組給予同體積的蒸餾水。給藥前小鼠自由飲水，禁食4～6 h，給藥3 h后恢復投食，于給藥后1、2、4、6 h密切觀察小鼠體征，此后每天1次，連續(xù)觀察14 h并記錄小鼠活動狀況、體征、中毒及死亡情況。于14 h觀察期后犧牲老鼠，解剖并觀察各器官的情況，并對心、肝、脾、肺、腎臟進行稱重，計算臟器系數(shù)。采用全自動生化分析儀進行谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酐（URE）、尿素（CREA）生化指標的測定。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，使用Grubbs檢驗數(shù)據(jù)排除過失誤差；采用SPSS 19.0軟件對合格數(shù)據(jù)進行顯著性分析，采用GraphPad Prsim 8.0作圖。

2 結果與討論

2.1 梁王茶水提物對雌雄小鼠死亡率的影響

不同劑量梁王茶水提物對雌性和雄性小鼠死亡率的影響如表1所示，其中每組12只小鼠，雌雄各六只。給予雌雄小鼠分別灌胃2521、3601.5、5415、7350、10500、15000 mg/kg·bw梁王茶水提物，小鼠死亡率均為0%，說明梁王茶水提物不會引起小鼠死亡。

表1 不同劑量梁王茶水提物對雌雄小鼠死亡率的影響 Table 1 Effect of LWC water extract on the death rate of female and male mice

2.2 梁王茶水提物對雌雄小鼠中毒表現(xiàn)的影響

給予小鼠不同劑量梁王茶水提物后，在14 d觀察時間內(nèi)，雌雄小鼠均未出現(xiàn)異常行為，分泌物、體溫、呼吸情況、皮膚毛被等正常，未見任何中毒癥狀（見表2）。由此可見梁王茶水提物不會引起受試動物的中毒反應，其LD50值大于15000 mg/kg·bw，根據(jù)WHO1977年頒布的毒性分級標準[19]，梁王茶水提物屬實際無毒級物質(zhì)。

表2 梁王茶水提物對雌雄小鼠中毒表現(xiàn)的影響 Table 2 Effect of LWC water extract on poisoning manifestations of female and male mice

2.3 梁王茶水提物對小鼠體重的影響

灌胃不同劑量梁王茶水提物對雌雄小鼠體重的影響見表3。由表可知，給予雌雄小鼠不同劑量（2521～15000 mg/kg·bw）的梁王茶水提物，其體重與對照組無顯著性差異（p＞0.05），說明梁王茶水提物對雌雄小鼠體重無影響。

表3 不同劑量梁王茶水提物對雌雄小鼠體重的影響 Table 3 Effects of LWC water extract on the body weight of female and male mice

2.4 梁王茶水提物對小鼠主要臟器系數(shù)的影響

梁王茶水提物對雌雄小鼠主要臟器系數(shù)的影響見圖1。如圖1所示，給予雌性小鼠不同劑量梁王茶水提物后，各劑量組心臟系數(shù)與對照組相比無顯著性差異（p＞0.05），說明梁王茶水提物對雌性小鼠心臟無影響。肝臟則是身體內(nèi)代謝主器官，在機體中有去氧化、儲存肝糖原、分泌性蛋白質(zhì)的合成以及解毒等作用[20,21]。肝臟也可轉(zhuǎn)化來自體內(nèi)和體外的許多非營養(yǎng)性物質(zhì)如各種藥物以及體內(nèi)某些代謝產(chǎn)物，并通過新陳代謝的方式徹底分解或以原形將這些物質(zhì)排出體外[22,23]。與對照組相比，灌胃2521～10500 mg/kg·bw梁王茶水提物對雌性小鼠肝臟系數(shù)均無顯著影響（p＞0.05），最高劑量組（15000 mg/kg·bw）肝臟系數(shù)顯著低于對照組（p＜0.05）。給予2521～15000 mg/kg·bw梁王茶水提物對雌性小鼠脾臟系數(shù)均無顯著影響（p＞0.05），最高劑量組（15000 mg/kg·bw）雌鼠的脾臟系數(shù)降低，但無顯著性差異（p＞0.05），有研究表明鼠脾臟系數(shù)降低可能是由于免疫抑制作用引起的[24]。灌胃2521～15000 mg/kg·bw梁王茶水提物后，雌鼠的肺臟系數(shù)增加，但與對照組相比均無顯著差異（p＞0.05），表明梁王茶水提物對雌性小鼠肺臟無影響。腎臟主要有排泄體內(nèi)代謝產(chǎn)物和過濾除去體內(nèi)的有害物質(zhì)的作用，腎臟功能的紊亂會放大有毒物質(zhì)對機體的毒害程度[25]。給予雌性小鼠2521、3601.5 mg/kg梁王茶水提物，其腎臟系數(shù)與正常小鼠相比無顯著性差異（p＞0.05），但灌胃更高劑量（5415、7350、10500、15000 mg/kg）時，雌性小鼠的腎臟系數(shù)顯著高于對照組（p＜0.05），表明梁王茶水提物對雌性小鼠的腎臟產(chǎn)生損傷。

臟器系數(shù)一方面可以反映動物內(nèi)臟器官的功能狀態(tài)，也可應用于毒性試驗和安全評價中，為相應的模型比較提供參考[26,27]。

如圖1所示，給予雄性小鼠不同劑量梁王茶水提物后，2521 mg/kg·bw的心臟系數(shù)與對照組相比無顯著差異（p＞0.05），其他劑量組（3601.5～15000 mg/kg·bw）心臟系數(shù)顯著低于對照組（p＜0.05），表明梁王茶水提物對雄性小鼠心臟呈現(xiàn)一定毒性作用。灌胃2521～5145 mg/kg·bw梁王茶水提物對雄性小鼠的肝臟系數(shù)無顯著影響（p＞0.05），其中劑量為7350 mg/kg·bw時，呈現(xiàn)顯著性差異（p＜0.05），劑量為10500 mg/kg·bw時，梁王茶水提物對雄性小鼠的肝臟系數(shù)無顯著影響（p＞0.05），這可能是小鼠個體差異造成的誤差。劑量為15000 mg/kg·bw時，雄鼠肝臟系數(shù)顯著高于對照組（p＜0.05）。給予2521～15000 mg/kg·bw王茶水提物，各劑量組雄鼠脾臟系數(shù)均顯著高于對照組（p＜0.05），說明梁王茶水提物對雄鼠脾臟呈現(xiàn)一定毒性作用。灌胃2521～15000 mg/kg·bw梁王茶水提物，各劑量組雄鼠的肺和腎臟系數(shù)與對照組相比均無顯著差異（p＞0.05），說明梁王茶水提物對雄性小鼠的肺和腎臟沒有毒性作用。

2.5 梁王茶水提物對小鼠血液生化指標的影響

ALT是臨床上用于診斷病毒性肝炎、中毒性肝炎的重要指標，大量存在于肝細胞的細胞質(zhì)中時會誘導以上疾病發(fā)生，而AST則主要存在于肝臟和心臟兩個機體主要的器官內(nèi)[28,29]。正常時血清中AST的含量較低，但是肝臟和腎臟內(nèi)相應細胞受損時，其含量在血清中的濃度升高[30]。肌酐在衡量腎功能好壞時具有重要的意義，是肌肉在機體內(nèi)代謝的產(chǎn)物[31]。

如圖2所示，給予不同劑量梁王茶水提物對雌雄小鼠血液生化指標的影響如圖2所示。灌胃2521～ 10500 mg/kg·bw梁王茶水提物對雌鼠血清中的ALT（谷丙轉(zhuǎn)氨酶）、AST（谷草轉(zhuǎn)氨酶）、CREA（肌酐）水平均無顯著影響（p＞0.05）。給予2521～5145 mg/kg·bw梁王茶水提物，雌鼠血清UREA（尿素）含量與對照組無顯著差異（p>0.05）；灌胃劑量為7350 mg/kg·bw與10500 mg/kg·bw時，雌鼠血清尿素含量顯著高于對照組（p＜0.05），這與腎臟系數(shù)結果一致，說明灌胃極高劑量梁王茶水提物對雌鼠腎臟表現(xiàn)出輕微毒性，可能是超出了雌鼠腎臟的負擔能力。

給予雄鼠不同劑量梁王茶水提物，其血清ALT水平與對照組無顯著差異（p＞0.05）。與對照組相比，梁王茶水提物組雄鼠血清AST水平呈降低趨勢，且劑量為5145 mg/kg·bw和15000 mg/kg·bw時，AST水平顯著低于對照組（p＜0.05），這與雄鼠心臟、肝臟系數(shù)結果一致，與對照組比較發(fā)生了顯著性變化（p＜0.05）。雄鼠血清尿素水平與梁王茶水提物劑量呈正相關趨勢，且劑量為5145、7350、10500 mg/kg·bw時，雄鼠血清UREA水平顯著高于對照組（p＜0.05）。雄鼠血清CREA水平隨劑量增加而降低，且劑量為5145、10500、15000 mg/kg·bw時，雄鼠血清CREA水平顯著低于對照組（p＜0.05）。

本研究發(fā)現(xiàn)，灌胃高劑量梁王茶水提物（≥5145 mg/kg·bw）會引起雄鼠血清AST和肌酐顯著降低（p＜0.05），然而這兩項指標的降低在臨床上無明顯意義。尿素可由腎小球濾過而排出體外，也是臨床上用于評估腎功能的重要指標之一，從圖2可看出，給予雌鼠高劑量（≥7350 mg/kg·bw）和雄鼠高劑量（≥5145 mg/kg·bw）梁王茶水提物，血清尿素水平顯著上升（p＜0.05），表明極高劑量梁王茶水提物對雌雄小鼠腎臟均有一定毒性。

3 結論

急性毒性研究表明，梁王茶水提物屬于實際無毒物質(zhì)，其LD50＞15000 mg/kg·bw。梁王茶水提物對雌鼠和雄鼠體重增量無顯著影響（p＞0.05）。與對照組相比，給予雌鼠2521～15000 mg/kg·bw梁王茶水提物，對其心臟、脾臟和肺臟系數(shù)、血清ALT、AST和肌酐水平均無顯著影響（p＞0.05）；灌胃高劑量梁王茶水提物，雌鼠的肝臟系數(shù)（劑量≥15000 mg/kg·bw）顯著降低（p＜0.05），腎臟系數(shù)（劑量≥5145 mg/kg·bw）和尿素水平（劑量≥7350 mg/kg·bw）顯著升高（p＜0.05）。與對照組相比，給予雄鼠2521～15000 mg/kg·bw梁王茶水提物，對其肺臟和腎臟系數(shù)、血清ALT水平均無顯著影響（p＞0.05）；灌胃高劑量梁王茶水提物，雄鼠的心臟系數(shù)（劑量≥3601.5 mg/kg·bw）、血清AST（劑量≥5145 mg/kg·bw）和肌酐（劑量≥5145 mg/kg·bw）水平顯著降低（p＜0.05），和脾臟系數(shù)（劑量≥2521 mg/kg·bw）及尿素水平（劑量≥5145 mg/kg）顯著升高（p＜0.05）。極高劑量梁王茶水提物對雌性（劑量≥5145 mg/kg·bw）小鼠腎臟有一定毒性。極高劑量梁王茶水提物對雄性（劑量：7350 mg/kg·bw、15000 mg/kg·bw）對小鼠肝臟有一定毒性。