細(xì)胞內(nèi)鏡評估結(jié)直腸病變的研究進(jìn)展

馬鳴揚(yáng) 王潔瑋 李 鵬

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100050)

在過去二十年間，消化內(nèi)鏡技術(shù)已經(jīng)從普通白光內(nèi)鏡向放大內(nèi)鏡方向深入發(fā)展。細(xì)胞內(nèi)鏡(endocytoscopy，EC)作為近年來新興的放大內(nèi)鏡技術(shù)，可以提供超高倍觀察圖像。配合染色及窄帶成像技術(shù)，內(nèi)鏡醫(yī)師通過肉眼即可對結(jié)直腸病變進(jìn)行組織、細(xì)胞以及微血管的形態(tài)學(xué)判斷，從而實現(xiàn)在體實時活檢的目的[1-2]。EC系統(tǒng)評估結(jié)直腸病變的研究目前主要來源于日本及歐美國家，其中對于結(jié)直腸浸潤性腫瘤、息肉、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的評估展現(xiàn)了EC診斷準(zhǔn)確性高、病理結(jié)果等待時間短等優(yōu)勢[3-5]。本文旨在對EC評估結(jié)直腸病變的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 EC硬件發(fā)展

自2003年至今，EC已更新至第四代。隨著不斷增長的內(nèi)鏡觀察需求及技術(shù)上的進(jìn)步，EC由最初的定焦探針式發(fā)展為如今可變焦的集成內(nèi)鏡式，放大倍數(shù)也從450倍增長至520倍[6-7]。第一代EC為兩種模型機(jī)(PrototypeⅠ和Ⅱ)，誕生于2003年，二者均為探針型，從普通腸鏡的活檢孔道中插入進(jìn)行觀察，放大倍數(shù)及視野分別為450倍、1 125倍，300 μm×300 μm、120 μm×120 μm[6]。Prototype Ⅱ雖放大倍數(shù)高于Ⅰ，但觀察病變深度淺，視野小。第二代EC(XCF-260EC1)為集成內(nèi)鏡式雙鏡頭EC，定焦放大450倍，視野400 μm×400 μm，觀察深度50 μm。第三代EC(CF-Y0020-1)為集成單鏡頭EC，放大倍數(shù)從80倍連續(xù)變焦至380倍，觀察視野700 μm×600 μm。最新第四代EC為集成內(nèi)鏡，放大倍數(shù)達(dá)520倍，觀察深度為35 μm[8]。

2 EC檢查前準(zhǔn)備

染色對于EC檢查至關(guān)重要，良好的染色可凸顯細(xì)胞核、組織及腺腔的形態(tài)，從而增強(qiáng)觀察效果，應(yīng)用最廣泛的染色方法為0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))結(jié)晶紫+1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))亞甲藍(lán)雙染法(CM雙染法)[3]。Ichimasa等[9]研究發(fā)現(xiàn)CM雙染法優(yōu)于單獨使用亞甲藍(lán)進(jìn)行染色，整個染色過程持續(xù)約1 min，用水沖去浮色，避免過度染色，可使細(xì)胞及細(xì)胞核形態(tài)充分展現(xiàn)。此外，窄帶成像(narrow-band imaging，NBI)被稱為虛擬染色技術(shù)，利用不同光束波長不同的原理，對反射光進(jìn)行過濾，從而觀察黏膜血管[10]。有研究[2]表明，將 NBI與EC結(jié)合，節(jié)省了染色時間，是在放大內(nèi)鏡窄帶成像基礎(chǔ)上的進(jìn)一步發(fā)展，在超高倍放大圖像下判斷黏膜表面微小血管，為EC診斷提供了新思路。無論選取何種方法，使用EC觀察結(jié)直腸病變時都需要將鏡頭與黏膜接觸，從而得到清晰圖像[6]。

3 EC診斷結(jié)直腸息肉及腫瘤

Sasajima等[6]對結(jié)直腸病變的EC圖像特點進(jìn)行了初步歸納。正常黏膜：腺體排列規(guī)則，形態(tài)一致，細(xì)胞核沿基底膜規(guī)則排列。增生性息肉(hyperplastic polyp，HP)：鋸齒狀腺體清晰。低級別腺瘤：管狀腺體大小均勻，細(xì)胞密度低，梭形細(xì)胞核沿基底膜規(guī)則排列，極性稍紊亂。高級別腺瘤：腺體不規(guī)則地分支，出現(xiàn)細(xì)胞異型性，細(xì)胞核增大畸形、極性消失。浸潤性癌：腺腔結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞核明顯增大畸形。Rotondano等[11]首次對EC圖像進(jìn)行分級：EC0a：規(guī)則圓腺腔；EC0b：規(guī)則鋸齒狀腺腔；EC1a：狹縫樣腺腔伴紡錘狀細(xì)胞核；EC1b：規(guī)則腺體，核大深染；EC2：腺體形狀不一，核大畸形；EC3：腺體結(jié)構(gòu)消失，核大畸形。Kudo等[12]總結(jié)EC圖像特點后提出了較成熟的EC分級：EC1a：小而圓的腺腔伴正常紡錘形細(xì)胞核；EC1b：鋸齒狀腺腔伴顆粒狀細(xì)胞核聚集；EC2：狹縫樣腺腔伴略腫脹的紡錘形或圓形核；EC3a：不規(guī)則腺腔伴中度腫脹的深染細(xì)胞核；EC3b：腺體結(jié)構(gòu)消失伴高度腫脹的異常細(xì)胞核聚集。其中，EC1a和EC1b代表非腫瘤性病變，EC2代表腺瘤或黏膜內(nèi)癌，EC3a代表黏膜內(nèi)癌或輕度浸潤的黏膜下癌，EC3b代表廣泛浸潤的黏膜下癌或者更高級別的癌。在后續(xù)研究中，Kudo等[13]又對EC分級進(jìn)行了補(bǔ)充(圖1)，將EC3a分為低級別和高級別，對應(yīng)的圖像特征分別為：略增大的深染橢圓核，核分層略增多、輪廓分明；大量異常增大核，核分層明顯增多，輪廓圓鈍。Mori等[14]開展隨機(jī)對照實驗(randomized controlled trial，RCT)表明EC分級對腫瘤性病變診斷準(zhǔn)確率達(dá)到94.1%(95%CI：87.6%～97.8%)，不亞于病理活檢。

圖1 Kudo EC分級[13]

Kudo等[2]將EC與NBI結(jié)合，根據(jù)結(jié)直腸黏膜表面微血管形態(tài)建立了EC-V分級：EC-V1：微血管形態(tài)正常且模糊，提示正常黏膜；EC-V2：微血管網(wǎng)密集且清晰，提示腫瘤性病變；EC-V3：微血管網(wǎng)雜亂且稀疏，提示浸潤性癌。該分級對T1期結(jié)直腸癌、增生性息肉的診斷準(zhǔn)確率分別達(dá)到88.6%和99.0%。EC-V分級與Pit pattern分型相比，診斷準(zhǔn)確率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明其在診斷結(jié)直腸黏膜表面病變時有較好表現(xiàn)。

息肉為結(jié)直腸常見病變，根據(jù)病理學(xué)可分為腺瘤性息肉和非腺瘤性息肉，其中，腺瘤性息肉為結(jié)腸癌癌前病變[15]，一旦發(fā)現(xiàn)應(yīng)及時治療。息肉惡變風(fēng)險也與大小密切相關(guān)，當(dāng)病變大于2 cm時癌變概率也會增加。一項對直徑大于或等于5 mm的結(jié)直腸病變的隨機(jī)研究[14]表明，細(xì)胞內(nèi)窺鏡的診斷準(zhǔn)確率并不低于活檢。目前內(nèi)鏡醫(yī)師對于結(jié)直腸息肉均采取一刀切的處理方式，使沒有癌變傾向的息肉和低級別腺瘤也被切除。為了探究EC評估良性息肉的準(zhǔn)確性，Utsumi等[16]使用EC分級對微小息肉(≤5 mm)中腺瘤性息肉(EC2)和非腺瘤性息肉(EC1b)進(jìn)行評估，結(jié)果表明，EC可以對二者進(jìn)行在體實時評估，降低了病理學(xué)評估成本，減少了患者的痛苦及出血風(fēng)險。Kataoka等[17]利用EC+NBI技術(shù)鑒別增生性息肉與腺瘤性息肉，發(fā)現(xiàn)EC下增生性息肉微血管較腺瘤更模糊，對此解釋為增生性息肉微血管在更深層位置。Kudo等[18]使用第四代EC，對低級別腺瘤進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)正常腺體征(normal pit，NP)為其特有表現(xiàn)，可以借此與高級別腺瘤進(jìn)行鑒別，從而避免活檢對組織的創(chuàng)傷以及因反復(fù)取材導(dǎo)致的結(jié)締組織增生，影響追加內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)(endoscopic submucosal dissection，ESD)的進(jìn)行。

廣基鋸齒狀腺瘤/息肉(sessile serrated adenoma/polyp，SSA/P)在過去被認(rèn)為是具有惡變傾向的增生性息肉，因鏡下形態(tài)與增生性息肉相似而難以區(qū)分，其與傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤(traditional serrated adenoma，TSA)均為癌前病變，一旦發(fā)現(xiàn)應(yīng)及時處理[19]。Kutsukawa等[4]使用EC對687例鋸齒狀腺瘤的腺腔和細(xì)胞核形態(tài)特點進(jìn)行歸納，與病理學(xué)結(jié)果對比，研究顯示，EC下增生性息肉為星形腺腔伴小圓細(xì)胞核，SSA/P為卵圓形腺腔伴小圓細(xì)胞核，而TSA為鋸齒狀或絨毛狀腺腔伴紡錘狀胞核，但此研究并未明確定義腺腔開口大小。Ogawa等[20]發(fā)現(xiàn)腺腔擴(kuò)張是SSA/P的特征之一，SSA/P和增生性息肉管腔橫截面積的均值分別為4 152 μm2和2 117 μm2，受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析表明，管腔面積截止值為3 068 μm2，區(qū)分SSA/P和增生性息肉的靈敏度為80.0%，特異度為77.3%，準(zhǔn)確度為78.0%，ROC曲線下面積為0.865。使用EC區(qū)分SSA/P與增生性息肉準(zhǔn)確度較高，但花費時間也較長，平均評估時間為5 min。

對于惡變風(fēng)險較低的幼年性息肉，Takeda等[21]將EC下觀察結(jié)果與病理結(jié)果進(jìn)行對照，總結(jié)出幼年性息肉四聯(lián)癥：微紅表面、表面糜爛、隱窩開口擴(kuò)張、隱窩密度降低。該發(fā)現(xiàn)有助于進(jìn)一步研究幼年性息肉的發(fā)育傾向，為內(nèi)鏡下治療提供參考。

黏膜下深層浸潤結(jié)直腸癌(massive submucosal invasion cancer，SM-m)指腫瘤浸潤超過1 000 μm的病變，伴淋巴轉(zhuǎn)移的風(fēng)險增加[22]，內(nèi)鏡下切除不能達(dá)到根治，應(yīng)考慮追加外科手術(shù)擴(kuò)大病變切除范圍。因此，準(zhǔn)確判斷病變深度對于治療方式及預(yù)后有重要意義。Kudo等[3]使用Pit pattern分型和EC分級對89例SM-m患者進(jìn)行評估，診斷準(zhǔn)確率為96.3%，高于單獨使用Pit pattern分型的93.8%(P=0.004)。促結(jié)締組織增生反應(yīng)(desmoplastic reaction，DR)被認(rèn)為是癌細(xì)胞從黏膜肌層向黏膜下深層侵襲的標(biāo)志，檢測有助于預(yù)測結(jié)直腸癌在黏膜下層的深浸潤[23]。Sugihara等[24]發(fā)現(xiàn)通過EC發(fā)現(xiàn)的細(xì)顆粒結(jié)構(gòu)(fine granular structure，F(xiàn)GS)可以提示DR，進(jìn)而預(yù)警SM-m，準(zhǔn)確度達(dá)87.3%。Sako等[25]結(jié)合病理對118個T1期結(jié)腸癌EC圖像進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)鏡下觀察97.1%的腺體融合病變(fused gland formations on endocytoscopy，F(xiàn)GFE)的病理結(jié)果都出現(xiàn)了SM-m，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，建議出現(xiàn)FGFE的患者行外科手術(shù)并清掃淋巴結(jié)。此外，Nakamura等[26]使用EC-V分級觀察微血管，發(fā)現(xiàn)SM-m的病變特點為血管擴(kuò)張，微血管網(wǎng)消失，血管直徑改變，串珠征。在診斷癌變浸潤深度方面，一項Meta分析[5]表明，使用EC優(yōu)于Pit pattern分型，預(yù)示著EC比放大內(nèi)鏡更具潛力。

結(jié)直腸側(cè)向發(fā)育性腫瘤分為顆粒型和非顆粒型，其中，非顆粒型中的假凹陷型黏膜下浸潤傾向最高，應(yīng)予以高度重視[27]。Kudo等[12]使用EC分級對非顆粒型側(cè)向發(fā)育型腫瘤浸潤深度進(jìn)行評估，診斷準(zhǔn)確率為90%。但當(dāng)判斷隆起型病變浸潤深度時，效果不如Pit pattern分型，這可能是因為隆起性病變表層與深層距離較遠(yuǎn)，EC觀察深度有限造成。

4 EC診斷炎癥性腸病

內(nèi)鏡及組織病理學(xué)緩解是評價炎癥性腸病治療效果的重要指標(biāo)，EC的出現(xiàn)使得在體實時觀察病變而無需活檢成為可能，Bessho等[28]提出潰瘍性結(jié)腸炎的EC評分系統(tǒng)(endocytoscopy system score，ECSS)，從隱窩形狀、相鄰隱窩距離、血管可見度三方面對病變進(jìn)行評估，研究表明，雖然該評分不能評估傳統(tǒng)病理學(xué)中炎癥細(xì)胞浸潤等項目，但因其與組織病理學(xué)評分有良好的相關(guān)性，可以作為病理的簡化替代標(biāo)準(zhǔn)。在另一項對40名IBD(其中，潰瘍性結(jié)腸炎患者21例，克羅恩病患者19例)患者的初步研究[29]中，發(fā)現(xiàn)EC和腸道疾病活動的組織病理學(xué)Riley評分之間的一致性為100%，兩名研究者之間觀察水準(zhǔn)近乎一致(Kappa = 0.76～0.88)。Nakazato等[30]選取內(nèi)鏡下愈合即Mayo內(nèi)鏡評分=0的64例患者，檢測ECSS評估病理組織學(xué)緩解(Geboes病理組織學(xué)評分≤2)的診斷準(zhǔn)確性，證明了ECSS可以用于評估潰瘍性結(jié)腸炎患者的組織學(xué)愈合情況。另外，使用計算機(jī)輔助診斷(computer-aided diagnosis，CAD)系統(tǒng)可以全自動識別與潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)相關(guān)的EC圖像，大大提高了檢查的效率[31]。

最近有研究[32]表明，Mayo內(nèi)鏡下評分=1的潰瘍性結(jié)腸炎也有較高復(fù)發(fā)率。Maeda等[33]使用EC觀察了黏膜內(nèi)血管及隱窩，對Mayo內(nèi)鏡下評分=1的患者進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)黏膜內(nèi)毛細(xì)血管及隱窩活躍的潰瘍性結(jié)腸炎患者有30.5%復(fù)發(fā)。

炎癥性腸病隨病程的延長可能出現(xiàn)癌變，因此發(fā)明新的檢測方法，準(zhǔn)確地在早期發(fā)現(xiàn)腫瘤性病變至關(guān)重要，雖然目前還沒有相關(guān)文獻(xiàn)報道EC診斷炎癥性腸病伴癌變，但有研究[34]表明，異常隱窩灶是結(jié)直腸癌早期的先兆，或許能為在炎癥性腸病中發(fā)現(xiàn)黏膜癌變提供參考。

5 EC的局限性

雖然EC在提供結(jié)直腸病變的實時病理診斷方面有重要作用，但仍有亟待解決的問題限制其發(fā)展。第一，因為放大倍數(shù)提高，內(nèi)鏡醫(yī)師需要小心將鏡頭貼近黏膜表面并對焦，從而獲得清晰圖像，加上觀察前使用染色劑染色，致使EC檢查時間延長[8，35]。第二，EC目前的黏膜觀察深度為50 μm，只能通過觀察表面結(jié)構(gòu)對浸潤性病變做出判斷[2]。最后，目前對于EC的研究大多為單中心回顧性，樣本量較少。在實際工作中，還需要更多證據(jù)等級較高的EC分級方法指導(dǎo)診斷及治療。

6 小結(jié)

EC作為新一代超高倍放大內(nèi)鏡，可以從隱窩、細(xì)胞核及微血管形態(tài)等方面對結(jié)直腸病變進(jìn)行鑒別診斷，要實現(xiàn)EC內(nèi)鏡的進(jìn)一步發(fā)展，還需要縮短其檢查時間，并開展更多試驗總結(jié)結(jié)直腸病變圖像特點。隨著研究的深入，EC在未來有望實現(xiàn)對病變進(jìn)行近似于病理診斷的在體實時評估，成為內(nèi)鏡診斷技術(shù)的又一利器。