外泌體miRNA在急性心肌梗死中的研究進(jìn)展

鮑博藝 李衛(wèi)萍，2*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院心血管中心，北京 100050；2.代謝紊亂相關(guān)心血管疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是指急性心肌缺血性壞死，大多是在冠狀動(dòng)脈病變的基礎(chǔ)上，冠狀動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊破裂、糜爛，繼發(fā)血栓形成導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈不完全或完全性閉塞，引起相應(yīng)部位心肌嚴(yán)重而持久的急性缺血性壞死。盡管目前大多數(shù)AMI患者接受了積極的冠狀動(dòng)脈血運(yùn)重建術(shù)以及規(guī)范的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(以下簡(jiǎn)稱冠心病)二級(jí)預(yù)防治療，但AMI病死率仍然呈上升趨勢(shì)[1-3]?！吨袊?guó)心血管健康與疾病報(bào)告2020》[1]顯示我國(guó)2018年城鎮(zhèn)與農(nóng)村居民AMI病死率已分別從2002年的39.56/10萬、27.57/10萬上升至120.18/10萬、128.24/10萬，因而探索新的診療策略一直是心血管疾病領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。外泌體是細(xì)胞外囊泡的成員之一，可以作為載體運(yùn)輸生物分子，在細(xì)胞間傳遞信號(hào)，影響病理生理過程[2]。近年研究[3-5]顯示在心肌梗死過程中，外泌體可以發(fā)揮心臟保護(hù)或心臟損害作用，而miRNA被認(rèn)為是外泌體能夠產(chǎn)生上述作用的主要信號(hào)，其被裝載在外泌體中，進(jìn)入靶細(xì)胞后可以影響受體細(xì)胞的生物學(xué)功能[6]。目前，外泌體miRNA被認(rèn)為在心血管疾病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用[2]，本文結(jié)合近年來的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)對(duì)外泌體miRNA在AMI中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 外泌體miRNA的概述

1.1 外泌體和miRNA

外泌體是起源于內(nèi)吞體，直徑在40～160 nm的具有脂質(zhì)雙分子層的細(xì)胞外囊泡，在血液、尿液、腦脊液等體液中均可存在。它可以包裹蛋白質(zhì)、RNA(包括miRNA、mRNA、circRNA和lncRNA等)、DNA、氨基酸、代謝產(chǎn)物等物質(zhì)，通過介導(dǎo)不同組織間的旁分泌和內(nèi)分泌，在細(xì)胞間信號(hào)傳遞、免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮作用[2，7-8]。外泌體的釋放和有效載荷受各種生理因素和細(xì)胞條件影響，包括氧化應(yīng)激、缺氧和細(xì)胞內(nèi)鈣水平等。在發(fā)生心肌損傷后，干細(xì)胞來源的外泌體也可以提供生長(zhǎng)因子、miRNA和細(xì)胞保護(hù)因子等物質(zhì)，通過抗凋亡、抗纖維化和促進(jìn)新生血管生成等作用幫助受損心肌修復(fù)再生[9]。

miRNA是約有22個(gè)核苷酸的短鏈、內(nèi)源性、非編碼RNA，與mRNA的3′端的非翻譯區(qū)(untranslated region, UTR)結(jié)合后，通過促進(jìn)mRNA降解或抑制翻譯降低靶基因蛋白表達(dá)并調(diào)控受體細(xì)胞的表型及功能。在心血管疾病中，miRNA可以作為一種新型的診斷生物標(biāo)志物，并參與細(xì)胞增生分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子合成和轉(zhuǎn)移旁分泌等各種病理生理機(jī)制[10-11]。

1.2 外泌體miRNA與其他miRNA

外泌體中有不同類型的RNA，其中miRNA在外泌體中比在分泌外泌體的細(xì)胞中更加富集。相較于血漿miRNA，外泌體miRNA受到脂質(zhì)雙分子層保護(hù)，在細(xì)胞外環(huán)境中可以避免RNA水解酶的降解作用，具有更好的穩(wěn)定性[8]。血漿miRNA在4 ℃保存兩周后其RNA含量明顯下降，而外泌體miRNA可在4 ℃保存至少兩周不降解，在-20 ℃可保存5年。外泌體的膜結(jié)構(gòu)顯著增強(qiáng)miRNA分子的穩(wěn)定性，提升其作為疾病生物標(biāo)志物的潛力。在大鼠心肌梗死模型中，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)來源的外泌體和MSC具有相似的miRNA表達(dá)譜，其中數(shù)種miRNA的表達(dá)存在顯著差異，促進(jìn)心梗后心肌修復(fù)的作用優(yōu)于MSC[12]。相較于其他來源的miRNA，外泌體miRNA擁有更高的研究?jī)r(jià)值。

2 外泌體miRNA在AMI病理生理過程中的作用

2.1 外泌體miRNA與心肌細(xì)胞凋亡

近年研究[13-15]表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BM-MSC)、心臟成纖維細(xì)胞集落形成單位(cardiac colony-forming unit fibroblast, cCFU-F)，M2型巨噬細(xì)胞起源等多種來源的外泌體miRNA參與調(diào)控心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心臟保護(hù)作用。Peng等[13]構(gòu)建了小鼠和體外細(xì)胞的心肌梗死模型，發(fā)現(xiàn)MSC來源的外泌體miRNA-25-3p通過抑制促凋亡基因FASL和PTEN的蛋白表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心臟功能。此外下調(diào)EZH2和H3K27me3水平，導(dǎo)致eNOS和SOCS3基因的表達(dá)降低，從而抑制炎性反應(yīng)。MSC來源的外泌體過表達(dá)miRNA-210通過其下游靶點(diǎn)AIFM3、pAKT和p-p53調(diào)控心肌細(xì)胞的增生和凋亡，增加心肌細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下的存活，減少心肌梗死面積及改善心功能[14]。此外，miRNA-21a-5p可以抑制心肌細(xì)胞中促凋亡基因PDCD4、PTEN、Peli1和FasL的表達(dá)，發(fā)揮抗凋亡作用[15]。Zhu等[16]研究發(fā)現(xiàn)在缺氧誘導(dǎo)條件下BM-MSC產(chǎn)生的外泌體中，miRNA-125b-5p富集，可以減少促凋亡基因p53和BAK1的表達(dá)。GATA4是一種心臟發(fā)育早期的特異性轉(zhuǎn)錄因子，在過表達(dá)GATA4的cCFU-F來源的外泌體中，miRNA-221水平上調(diào)，通過PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路減弱低氧誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞(H9c2)的凋亡[17]。Ning等[18]證實(shí)MSC來源的外泌體miRNA-153-3p通過激活A(yù)NGPT1和VEGF/VEGFR2/PI3K/Akt/eNOS通路抑制心肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下發(fā)生的凋亡。此外，在AMI小鼠模型中靜脈注射分離的M2型巨噬細(xì)胞起源的外泌體，可以通過miRNA-1271-5p下調(diào)SOX6，減少Bax和c-caspase-3蛋白表達(dá)，增加Bcl-2水平，抑制細(xì)胞凋亡[19]。Wang等[20]從健康對(duì)照者和恢復(fù)期AMI患者(發(fā)病后3～7 d)中分離血漿外泌體。miRNA測(cè)序和PCR分析表明miR-342-3p水平在AMI外泌體中顯著下調(diào)。miR-342-3p分別通過靶向調(diào)控SOX6和TFEB基因抑制H9c2心肌細(xì)胞凋亡和自噬，減輕H2O2誘導(dǎo)的心肌損傷。

2.2 外泌體miRNA與新生血管形成

新生血管形成是重建缺血性心肌側(cè)支循環(huán)的重要過程。Geng等[21]從AMI患者和冠狀動(dòng)脈造影未見有意義狹窄的受試者血清中分離出外泌體與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)共培養(yǎng)，結(jié)果顯示AMI組外泌體中miRNA-143含量減少，同時(shí)miRNA-143通過胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor, IGF-1R)通路增加一氧化氮生成，從而促進(jìn)血管生成。從AMI小鼠分離外泌體后發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)的miRNA-1956可以在脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cell, ADMSC)中下調(diào)Notch-1，激活VEGF信號(hào)，進(jìn)而影響血管新生[22]。端細(xì)胞(cardiac telocyte，CT)是最近在心臟間質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的一種新型心臟間質(zhì)細(xì)胞群，Liao等[23]對(duì)于CT來源的外泌體研究發(fā)現(xiàn)，其miRNA-21-5p通過沉默CDIP1基因，下調(diào)其激活的caspase-3，進(jìn)而抑制微循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)心肌梗死后血管再生。Zhu等[24]對(duì)比了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cell, ucMSC)、含巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)的ucMSC和下調(diào)MIF的ucMSC 組來源的外泌體在缺血、缺氧條件下對(duì)HUVEC和H9C2的作用，發(fā)現(xiàn)含MIF的ucMSC來源的外泌體顯著促進(jìn)HUVECs的增生、遷移和血管生成，抑制H9C2心肌細(xì)胞凋亡。其中miRNA-133a-3p發(fā)揮主要作用，還具有抑制細(xì)胞凋亡和心肌纖維化，改善心功能等多種作用。

2.3 外泌體miRNA與心肌纖維化

心肌梗死后心肌纖維化程度會(huì)影響心室重構(gòu)及心臟功能的恢復(fù)。Kang等[25]在人外周血來源外泌體中裝載miRNA-21模擬物或抑制劑，加入體外H9C2和HL-1細(xì)胞培養(yǎng)中，可以調(diào)控參與心肌纖維化過程的Smad7、PTEN和MMP2蛋白及mRNA表達(dá)水平。體內(nèi)小鼠AMI模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)miRNA-21可促進(jìn)心肌纖維化。Pan等[26]將miRNA-146a模擬物和陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染到脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cell, ADSC)后分離出外泌體，在AMI大鼠模型中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miRNA-146a后可以下調(diào)EGR1，抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路，減輕心肌纖維化、細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell，EPC)來源的外泌體中miRNA-218-5p和miRNA-363-3p數(shù)量豐富，分別可以通過上調(diào)p53、下調(diào)JMY這兩條途徑，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生和間質(zhì)-內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制心肌纖維化。在小鼠AMI模型中給予miRNA-218-5p或miRNA-363-3p類似物可以減少心肌梗死面積，促進(jìn)心梗后心肌修復(fù)[27]。AMI后應(yīng)用沙庫(kù)巴曲纈沙坦或纈沙坦治療可增加外泌體的產(chǎn)生，而且沙庫(kù)巴曲纈沙坦可降低外泌體miRNA-181a數(shù)量，減輕心肌纖維化和改善心功能[28]。

2.4 外泌體miRNA與炎性反應(yīng)

炎性反應(yīng)是AMI的發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)小鼠發(fā)生心肌梗死后巨噬細(xì)胞內(nèi)miRNA-155前體數(shù)量增加，分泌含有miRNA-155的外泌體，可下調(diào)SOS蛋白1，減少SOCS1表達(dá)，抑制心臟成纖維細(xì)胞增生，促進(jìn)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致心肌梗死后心肌損傷。利用miRNA-155基因敲除小鼠建立AMI模型，與野生型小鼠相比，心肌梗死后心功能受損程度輕，心臟破裂發(fā)生率更低[3]。Wei等[29]研究結(jié)果顯示，MSC外泌體miRNA-181a既抑制c-Fos和促炎因子[腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6]表達(dá)，又增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和抗炎因子IL-10水平。此外，MSC外泌體miRNA-182和CDC外泌體miRNA-181b分別通過抑制TLR4和PKCδ兩種途徑，促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1型轉(zhuǎn)變成M2型，進(jìn)而減少心肌梗死后心肌缺血再灌注損傷[30]。Liu等[31]發(fā)現(xiàn)脂多糖刺激的BM-MSC中外泌體miRNA-181a-5p表達(dá)增加，通過外泌體將miRNA轉(zhuǎn)移至H9c2細(xì)胞，可增加H9c2細(xì)胞中miRNA-181a-5p表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)ATF2，抑制心肌炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)。

3 外泌體miRNA在AMI中的臨床應(yīng)用

3.1 早期預(yù)測(cè)和診斷

Chen等[32]對(duì)AMI患者和健康受試者的外周血外泌體進(jìn)行miRNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組相比，AMI 組術(shù)前有544個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)，518個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)，其中miRNA-6718和miRNA-4329表達(dá)顯著降低。AMI患者在PCI術(shù)后3 d miRNA-6718的表達(dá)明顯高于術(shù)前，表明miRNA-6718和miRNA-4329有望成為AMI的生物標(biāo)志物，其敏感度是否優(yōu)于cTnT和CK-MB，仍需進(jìn)一步研究。Ling等[33]發(fā)現(xiàn)ACS患者的血清外泌體miRNA-126和miR-21表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組。受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線表明兩者均可作為AMI的新型候選診斷生物標(biāo)志物，較肌鈣蛋白具有更好的特異性。Su等[34]對(duì)AMI和穩(wěn)定性冠心病患者外泌體進(jìn)行miRNA微陣列分析，進(jìn)而采用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明miRNA-1915-3p、miRNA-4507和miRNA-3656可作為AMI的預(yù)測(cè)標(biāo)志物，曲線下面積(area under curve，AUC)分別為0.772、0.684和0.771，且具有較高的特異度和敏感度。Guo等[35]對(duì)穩(wěn)定性冠心病患者，AMI患者，健康受試者共118例的血漿外泌體進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)有18種miRNA可作為早期AMI診斷生物標(biāo)志物。此外，AMI后外泌體納米顆粒濃度沒有變化，而納米顆粒直徑明顯減小，但其能否作為一種快速穩(wěn)定的AMI篩查方法有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.2 冠狀動(dòng)脈狹窄嚴(yán)重程度和預(yù)后

Zhao等[36]發(fā)現(xiàn)外泌體miRNA-183表達(dá)水平在健康對(duì)照組，穩(wěn)定型心絞痛組和AMI組逐漸升高，因此認(rèn)為外泌體miRNA-183水平與心肌損傷程度呈正相關(guān)，同時(shí)也可作為診斷心肌缺血性損傷的生物標(biāo)志物。GO和KEGG分析表明，miR-183主要通過調(diào)控5個(gè)核心基因(PPP2CB、PPP2CA、PRKCA、PPP2CA、PPP2R5C和PPP2R2A)，參與心肌細(xì)胞的細(xì)胞通訊、蛋白激酶活性調(diào)節(jié)和腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)。Gensini評(píng)分是根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影顯示的部位和狹窄程度來量化冠狀動(dòng)脈狹窄的嚴(yán)重程度的指標(biāo)。研究[33]顯示外泌體miR-126在不穩(wěn)定型心絞痛和AMI患者中的表達(dá)水平與Gensini評(píng)分呈正相關(guān)，可以作為一種無創(chuàng)診斷方法來評(píng)估冠狀動(dòng)脈狹窄的程度。一項(xiàng)在接受急診PCI術(shù)的STEMI患者中進(jìn)行平均20.8個(gè)月的隨訪研究[37]發(fā)現(xiàn)，miRNA-122-5p/133b比值升高的患者發(fā)生死亡或再梗的風(fēng)險(xiǎn)增加9倍，發(fā)生復(fù)合心血管不良事件的風(fēng)險(xiǎn)增加4倍，具有評(píng)估長(zhǎng)期心血管預(yù)后的重要價(jià)值。

3.3 治療

近十多年來外泌體和miRNA的研究發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了針對(duì)心血管疾病的基因靶向治療。基因治療所要傳遞的生物分子在體內(nèi)極不穩(wěn)定，在到達(dá)靶細(xì)胞之前易被核酸酶破壞或降解，難以到達(dá)靶病變部位發(fā)揮作用，因此需要選擇高效、安全的基因傳遞載體。與目前常用的病毒類載體相比，外泌體作為藥物傳遞載體具有較強(qiáng)的膜穩(wěn)定性、靶向性和高效性。如前所述，Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-342-3p在AMI恢復(fù)期患者的血漿外泌體中表達(dá)下調(diào)，對(duì)受損心肌恢復(fù)及心功能改善將產(chǎn)生不良影響。外泌體miRNA-342-3p可以通過靶向SOX6介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)通過TFEB介導(dǎo)的自噬減輕心肌損傷，因此可以將miRNA-342-3p作為心肌梗死患者潛在的治療靶點(diǎn)。Wei等[29]通過心肌內(nèi)注射MSC來源外泌體，利用外泌體的靶向功能將miRNA-181a傳遞到小鼠心臟組織，增強(qiáng)miRNA-181a增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和抗炎因子水平，從而減輕心肌梗死后的再灌注損傷。Chachques等[38]將巨噬細(xì)胞和富含外泌體的MSCs接種在彈性支架表面，通過增加miRNA-124表達(dá)和降低miRNA-125表達(dá)，增加巨噬細(xì)胞M2表型及細(xì)胞外基質(zhì)組成成分I型膠原和卵黃連蛋白，提高心肌修復(fù)和再生能力。Zhu等[16]通過生物正交化學(xué)方法將在缺氧誘導(dǎo)條件下BM-MSC產(chǎn)生的外泌體與缺血心肌靶向肽進(jìn)行結(jié)合后，靜脈注射到心肌梗死小鼠體內(nèi)，可以特異性靶向作用于受損心肌的缺血部位，并借助缺氧時(shí)外泌體來源的miRNA-125b-5p減輕心肌梗死面積，提高左室射血分?jǐn)?shù)。

盡管近年研究[30-32]提示外泌體miRNA有望于成為AMI的治療新策略，但仍集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。由于外泌體miRNA的給藥方式、代謝途徑、最佳劑量及安全性等方面尚不確定，因此限制了其用于人體的臨床研究。目前一項(xiàng)關(guān)于AMI患者冠狀動(dòng)脈內(nèi)輸注純化外泌體安全性評(píng)價(jià)的研究[39](NCT04327635)已經(jīng)在美國(guó)進(jìn)入了Ⅰ期臨床試驗(yàn)，期待該研究結(jié)果能為外泌體在AMI中的臨床應(yīng)用提供初步證據(jù)。

近年的研究[36-38]表明外泌體miRNA 與AMI的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，外泌體中差異表達(dá)的 miRNA 和蛋白質(zhì)分子可作為早期預(yù)測(cè)或診斷AMI的生物標(biāo)志物。同時(shí)基于外泌體的低毒性、生物相容性、低免疫抑制性、膜穩(wěn)定性等特點(diǎn)，可以裝載特定miRNA通過不同的信號(hào)通路促進(jìn)新生血管形成及梗死心肌的修復(fù)，從而改善心臟功能及臨床預(yù)后，具有潛在的臨床治療應(yīng)用前景，但給藥方式和劑量以及人體內(nèi)應(yīng)用的安全性仍需要深入的基礎(chǔ)和臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。目前關(guān)于外泌體miRNA在AMI中的研究尚處于起步階段，相信隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將有更多關(guān)于外泌體miRNA在AMI中的探索研究，從而為心肌損傷修復(fù)提供更有效的治療靶點(diǎn)。