根皮苷對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響

蘇 磊，胡夢(mèng)圓，李玲玲，張昕雨，魯 藝

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029)

衰老作為一種正常的生理現(xiàn)象普遍存在于自然界中，是指?jìng)€(gè)體的年齡增長(zhǎng)過程中細(xì)胞增殖功能逐漸減退，甚至不再更新，組織功能退化，從而導(dǎo)致器官的各種功能也出現(xiàn)退化，最終壽命終結(jié)的現(xiàn)象。與衰老相關(guān)的糖尿病、神經(jīng)退行性病變、腫瘤、代謝性疾病以及各種心血管疾病等都是人類健康的重大威脅。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2018年發(fā)布的《World Health Statistics 2018》，我國(guó)人口2016年的平均預(yù)期壽命為76.4歲，而世界排名第一的日本平均預(yù)期壽命達(dá)到了84.2歲[1]。這說明我國(guó)的人均預(yù)期壽命還有很大的提升空間，因此抗衰老藥物的研究與開發(fā)具有很重要的意義。根皮苷是一種二氫査耳黃酮,具有廣泛的抗氧化、降血糖、消炎、抗腫瘤作用，對(duì)糖尿病小鼠主動(dòng)脈有很好的保護(hù)作用[2]。根皮苷還可以增強(qiáng)果蠅的抗氧化能力，減少果蠅體內(nèi)的自由基水平，調(diào)節(jié)體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)的平衡[3-4]。但根皮苷對(duì)壽命的影響研究甚少。秀麗隱桿線蟲(簡(jiǎn)稱線蟲)是一種常被用作研究壽命的模式生物，故本實(shí)驗(yàn)以線蟲為研究對(duì)象，探討了根皮苷對(duì)其壽命的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1材料與儀器 根皮苷(純度≥98%，分子量472.45)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司; 野生型線蟲和尿嘧啶缺陷型大腸桿菌(Eco.liOP50)由北京中醫(yī)藥大學(xué)劉永剛老師課題組惠贈(zèng)；瓊脂粉及蛋白胨購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-100B-Z微電腦生化培養(yǎng)箱，上海博訊有限實(shí)業(yè)有限公司；Leica EZ4W體式顯微鏡，德國(guó)徠卡。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1線蟲給藥方式及常規(guī)培養(yǎng) 將根皮苷與E.coil OP50混合配制成相應(yīng)濃度的藥液，取50 μL滴加在NGM培養(yǎng)基上，晾干24 h后，將線蟲轉(zhuǎn)移到含藥培養(yǎng)基上22 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.2.2線蟲同步化 在無菌條件下挑取100條處于產(chǎn)卵期的成蟲，放在一個(gè)鋪有E.coilOP50的培養(yǎng)基上，待產(chǎn)卵3 h后將成蟲全部轉(zhuǎn)移。將余下的產(chǎn)卵板放置于22 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)線蟲至L4期，即得到同步化的L4期幼蟲。

1.2.3急性熱應(yīng)激篩選實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為空白組、0.1 mg/mL根皮苷組、0.5 mg/mL根皮苷組、1 mg/mL根皮苷組，每組設(shè)置3個(gè)培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)基含有10條同步化至L4期的線蟲。根皮苷各組培養(yǎng)基中加入相應(yīng)濃度根皮苷處理24 h后，與空白組同時(shí)平鋪放置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中觀察，每隔2 h將培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱中取出統(tǒng)計(jì)線蟲的死亡數(shù)和存活數(shù)，直到全部線蟲死亡，計(jì)算線蟲的生存時(shí)間。線蟲死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)為顯微鏡下蟲體多次用鉑絲觸碰沒有反應(yīng)，蟲體完全喪失運(yùn)動(dòng)能力。

1.2.4線蟲壽命實(shí)驗(yàn) 根據(jù)急性熱應(yīng)激篩選實(shí)驗(yàn)，在根皮苷0.1 mg/mL濃度附近范圍進(jìn)行壽命實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為空白組、0.05 mg/mL根皮苷組、0.1 mg/mL根皮苷組、0.2 mg/mL根皮苷組，每組設(shè)置3個(gè)培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)基含有30條同步化至L4期的線蟲，根皮苷各組培養(yǎng)基中加入相應(yīng)濃度根皮苷。實(shí)驗(yàn)過程中，為防止新生幼蟲對(duì)計(jì)數(shù)的干擾，早期線蟲每24 h更換1次含有相同藥物濃度及E.coli OP50的NGM培養(yǎng)基，待沒有新生幼蟲后，每2 d更換1次培養(yǎng)基。每24 h統(tǒng)計(jì)1次線蟲的死亡數(shù)和存活數(shù)，直至所有線蟲死亡，所有個(gè)體的平均生存時(shí)間計(jì)為平均壽命，最長(zhǎng)壽命取每個(gè)培養(yǎng)基中最后存活10%個(gè)體的壽命，線蟲死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)同1.2.3實(shí)驗(yàn)。

1.2.5線蟲應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為空白組、0.05 mg/mL根皮苷組、0.1 mg/mL根皮苷組、0.2 mg/mL根皮苷組，每組設(shè)置3個(gè)培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)基含有20條同步化至L4期的線蟲，根皮苷各組培養(yǎng)基中加入相應(yīng)濃度根皮苷。在急性熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中，將各組培養(yǎng)24 h后的線蟲暴露于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱，每2 h統(tǒng)計(jì)1次線蟲的死亡數(shù)和存活數(shù)，直至線蟲全部死亡。在百草枯急性氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中，將各組培養(yǎng)24 h后的線蟲轉(zhuǎn)移到含12.97 mg/mL百草枯的培養(yǎng)基中進(jìn)行觀察，每2 h統(tǒng)計(jì)1次線蟲的死亡數(shù)和存活數(shù)，直至所有線蟲死亡。線蟲死亡標(biāo)準(zhǔn)同1.2.3實(shí)驗(yàn)。在過氧化氫急性氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中，將各組培養(yǎng)24 h后的線蟲暴露于0.4 mmol/L過氧化氫中，每12 h統(tǒng)計(jì)1次線蟲的死亡數(shù)和存活數(shù)，直至線蟲全部死亡。

1.2.6線蟲生殖能力實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為空白組、0.05 mg/mL根皮苷組、0.1 mg/mL根皮苷組、0.2 mg/mL根皮苷組，每組設(shè)置12個(gè)培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)基培養(yǎng)1條同步化至L4期的線蟲，根皮苷各組培養(yǎng)基中加入相應(yīng)濃度根皮苷。每24 h將線蟲轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基1次，直至線蟲產(chǎn)卵期結(jié)束。產(chǎn)卵板在22 ℃的恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計(jì)子代數(shù)目。每條線蟲產(chǎn)卵期所有子代數(shù)目之和即為該線蟲的產(chǎn)卵數(shù)，同時(shí)記錄每條線蟲整個(gè)產(chǎn)卵期時(shí)長(zhǎng)。

2 結(jié) 果

2.1急性熱應(yīng)激篩選實(shí)驗(yàn) 在35 ℃急性熱應(yīng)激條件下，空白組、0.1 mg/mL根皮苷組、0.5 mg/mL根皮苷組、1 mg/mL根皮苷組線蟲的生存時(shí)間分別為(6.07±0.22)h、(6.87±0.23)h、(6.13±0.19)h、(5.70±0.22)h，0.5 mg/mL根皮苷組、1 mg/mL根皮苷組線蟲的生存時(shí)間與空白組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，0.1 mg/mL根皮苷組線蟲的生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于空白組(P<0.05)。 各組線蟲生存曲線見圖1。

圖1 空白組和根皮苷各組線蟲急性熱應(yīng)激條件下生存曲線

2.2壽命實(shí)驗(yàn) 0.05 mg/mL根皮苷組、0.1 mg/mL根皮苷組秀麗隱桿線蟲的平均壽命均明顯長(zhǎng)于空白組(P均<0.05)，分別延長(zhǎng)了12.9%和16.9%，但最長(zhǎng)壽命與空白組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；0.2 mg/mL根皮苷組秀麗隱桿線蟲的平均壽命、最長(zhǎng)壽命與空白組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1及圖2。

表1 空白組和根皮苷各組線蟲壽命比較

圖2 空白組和根皮苷各組線蟲生存曲線

2.3應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 在急性熱應(yīng)激和百草枯氧化應(yīng)激條件下，0.1 mg/mL根皮苷組線蟲的生存時(shí)間均明顯長(zhǎng)于空白組(P均<0.05)，分別延長(zhǎng)了7.5%和28.4%；0.05 mg/mL根皮苷組、0.2 mg/mL根皮苷組線蟲的生存時(shí)間與空白組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。在過氧化氫應(yīng)激條件下，空白組、0.05 mg/mL根皮苷組、0.1 mg/mL根皮苷組、0.2 mg/mL根皮苷組線蟲的生存時(shí)間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，但0.1 mg/mL根皮苷組線蟲生存時(shí)間延長(zhǎng)了8.4%，0.2 mg/mL根皮苷組線蟲的生存時(shí)間縮短了6.4%。見表2及圖3。

圖3 空白組和根皮苷各組線蟲在不同應(yīng)激條件下的生存曲線

表2 空白組和根皮苷各組線蟲在不同應(yīng)激調(diào)節(jié)下的生存時(shí)間比較

2.4生殖能力實(shí)驗(yàn) 空白組、0.05 mg/mL根皮苷組、0.1 mg/mL根皮苷組、0.2 mg/mL根皮苷組線蟲幾乎都在3 d內(nèi)完成產(chǎn)卵，各組間產(chǎn)卵量和總產(chǎn)卵時(shí)間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖4。

圖4 空白組和根皮苷各組線蟲產(chǎn)卵量和總產(chǎn)卵時(shí)間

3 討 論

各種壓力應(yīng)激是衰老的一個(gè)重要影響因素，生物個(gè)體一生各種壓力積累的傷害會(huì)限制壽命，對(duì)壓力的保護(hù)作用可以延長(zhǎng)壽命[5-6]。壽命的延長(zhǎng)與抗逆性增加密切相關(guān)。線蟲是用于研究衰老和長(zhǎng)壽的遺傳學(xué)和藥理學(xué)的模式生物，不僅生命周期短，易于觀察，并且遺傳背景清晰，其是第一個(gè)擁有完整基因序列的真核多細(xì)胞生物[7]。在有關(guān)線蟲壽命的藥物研究中，能延長(zhǎng)線蟲壽命的藥物幾乎都能提高線蟲的各種抗逆性，比如紫山藥、松果菊苷、地黃花多糖、鹿茸乙醇提取物等[8-11]。在研究某個(gè)藥物是否能延長(zhǎng)線蟲壽命時(shí)，適宜藥物濃度的確定是很重要的一環(huán)，在進(jìn)行藥物有效濃度初步篩選時(shí)如果進(jìn)行一整個(gè)周期的壽命實(shí)驗(yàn)，就會(huì)使得整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期很長(zhǎng)。在一定溫度范圍內(nèi)，環(huán)境溫度的升高會(huì)增加生物個(gè)體的代謝速率，產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，ROS又能對(duì)DNA、蛋白質(zhì)、生物膜等造成損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙并增加死亡的可能性，從而導(dǎo)致壽命的縮短[12-13]。相對(duì)于直接進(jìn)行壽命實(shí)驗(yàn)篩選適宜濃度，急性熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)的周期更短，如果能找到提高線蟲抗熱應(yīng)激能力的根皮苷濃度，那么推測(cè)這個(gè)濃度也可以延長(zhǎng)線蟲的壽命。野生型線蟲對(duì)于各種不同類型的氧化應(yīng)激可能表現(xiàn)出不同的抗逆性[12],因此本實(shí)驗(yàn)采用高溫應(yīng)激這個(gè)更普遍的應(yīng)激因素，對(duì)藥物可能起延長(zhǎng)線蟲壽命作用的濃度做初步篩選,但抗逆能力和壽命不一定絕對(duì)相關(guān)，后續(xù)依然需要用壽命實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。本研究熱應(yīng)激篩選實(shí)驗(yàn)初步確定0.1 mg/mL根皮苷可以顯著延長(zhǎng)線蟲急性熱應(yīng)激條件下的生存時(shí)間，然后在0.1 mg/mL附近設(shè)置濃度梯度進(jìn)行壽命實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明0.1 mg/mL根皮苷可以顯著延長(zhǎng)線蟲的平均壽命，并且可以顯著延長(zhǎng)急性熱應(yīng)激和百草枯氧化應(yīng)激條件下線蟲的生存時(shí)間。

生殖能力與壽命有聯(lián)系緊密，以往多認(rèn)為長(zhǎng)壽與生殖之間有著逆向關(guān)系，即在資源有限的條件下，如果分配給生殖能力的資源多，相應(yīng)的用于維持壽命的資源會(huì)減少，從而使壽命縮短。但關(guān)于影響線蟲壽命的研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿總黃酮、白藜蘆醇、何首烏乙酸乙酯提取物在延長(zhǎng)野生型線蟲壽命的同時(shí)，并沒有降低線蟲的生殖能力[14-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，根皮苷對(duì)線蟲的生殖能力沒有影響，說明根皮苷不是通過影響生殖能力達(dá)到延長(zhǎng)壽命的效果。

綜上所述， 根皮苷能夠提高線蟲的抗應(yīng)激能力延長(zhǎng)其壽命，機(jī)制可能與增加各種抗逆性有關(guān)，并且這種延長(zhǎng)壽命的效果不以犧牲線蟲的生殖能力為代價(jià)，其延長(zhǎng)壽命更具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。