基于腦-腸-微生物軸探討益脾通腑法對帕金森病小鼠的干預(yù)機(jī)制

劉 暢，李?；?，王姝元,區(qū)益洲，繆曉路

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)東莞醫(yī)院，廣東 東莞 523005)

帕金森病是一種常見的進(jìn)行性退行性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，多發(fā)生于50歲以上的老年人[1-2]。目前認(rèn)為帕金森病主要病理特征是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性缺失導(dǎo)致基底神經(jīng)節(jié)多巴胺水平下降、路易小體形成[3]、α突觸核蛋白沉積。Svensson等[4]提出“帕金森病的發(fā)生可能開始于胃腸道，并通過迷走神經(jīng)傳播到大腦”的假說。帕金森病患者腸道菌群會發(fā)生失調(diào)，總體表現(xiàn)為致病菌明顯增多，益生菌顯著減少[5]。而腸道菌群失調(diào)可加劇1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)的帕金森病小鼠模型提前出現(xiàn)運動行為學(xué)改變[6]。筆者在臨床中發(fā)現(xiàn)基于“益脾通腑法”白術(shù)與虎杖配伍的基礎(chǔ)方可以改善消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)癥狀，有利于帕金森病運動功能的改善。基于此，本實驗從腦-腸-微生物軸角度探討了術(shù)虎合劑對帕金森病的作用機(jī)制，旨在為其能在臨床推廣應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1動物 SPF級6～8周C57BL/6雄性小鼠，體重(20±2)g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2019-0008，實驗室許可證號：SYXK(粵)2019-0202。飼養(yǎng)環(huán)境的室溫為(22±2)℃，晝夜自然明暗交替照明，自由飲水。

1.2主要儀器 小鼠爬桿實驗裝置(江蘇賽昂斯生物科技有限公司)；凍臺、脫水機(jī)及包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；組織攤片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)；病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康)。

1.3藥物及試劑 白術(shù)、虎杖中藥配方顆粒(廣東一方制藥有限公司)；無水乙醇、二甲苯、冰醋酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；MPTP(美倫生物有限公司，MB3783)；HE染液試劑盒(索萊寶，貨號：G1120)；EDTA(pH9.0)、4%多聚甲醛(Servicebio，貨號：G1101)；甲苯胺藍(lán)染液(阿拉丁，貨號：T104232)；酪氨酸羥化酶一抗(美國 Abcam，ab137869，1∶500)，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(美國 Abcam，ab6721，1∶2 000)。

1.4藥物制備 生藥白術(shù)10 g相當(dāng)于取白術(shù)配方顆粒5.35 g，與200 mL蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為27.5 mg/mL的湯劑；生藥虎杖10 g相當(dāng)于取虎杖配方顆粒2g，與200mL蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的湯劑；生藥白術(shù)20 g+虎杖10 g相當(dāng)于取白術(shù)配方顆粒10.70 g與虎杖配方顆粒2 g與200 mL蒸餾水中配制成質(zhì)量濃度為65 mg/mL的湯劑。

1.5實驗方法 將60只C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、白術(shù)組、虎杖組、術(shù)虎合劑組，每組12只。參考文獻(xiàn)[7],正常組給予生理鹽水腹腔注射，其余組采用MPTP 30 mg/kg腹腔注射建立帕金森模型，均持續(xù)7 d，在此期間每天通過曠場實驗[8]和爬桿實驗[9]檢測小鼠的運動協(xié)調(diào)能力。模型建立成功后，白術(shù)組給予27.5 mg/mL白術(shù)湯劑灌胃，虎杖組給予10 mg/mL虎杖湯劑灌胃，術(shù)虎合劑組給予65 mg/mL術(shù)虎合劑灌胃，空白組及模型組給予蒸餾水灌胃，灌胃量均為0.2 mL/10 g，1次/d，均連續(xù)灌胃2周。

1.6檢測指標(biāo)及方法

1.6.1小鼠行為能力檢測 末次灌胃后，對各組小鼠進(jìn)行曠場實驗和爬桿實驗，記錄前爪步距、掉頭時間、下桿時間。

1.6.2腦組織HE染色病理觀察 各組小鼠行為能力檢測結(jié)束后處死，取部分腦組織，以PBS緩沖液進(jìn)行清洗后，將腦組織放于4%多聚甲醛中固定，并依次進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片(5～6 μm)、HE染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.6.3腦黑質(zhì)神經(jīng)元尼氏小體Nissl染色觀察 取各組小鼠腦組織，依照鼠腦圖譜分離出中腦黑質(zhì)，用4%多聚甲醛固定，再浸入30 %蔗糖磷酸緩沖溶液中進(jìn)行脫水，直至黑質(zhì)組織下沉。用切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)冠狀切片，片厚為10 μm。用1%甲苯胺藍(lán)水溶液置溫箱(50～60 ℃)染色20～40 min，用蒸餾水沖洗。再加入95%乙醇迅速分化，繼而加入酸化伊紅浸泡20 min。然后用95%乙醇迅速分化后，用無水乙醇脫水，二甲苯進(jìn)行透明，再用中性樹膠進(jìn)行封固。運用全自動圖形分析系統(tǒng)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。每組隨機(jī)選取1張切片，每張切片隨機(jī)選擇3個視野，放大20×20的倍數(shù)進(jìn)行觀測，以3個視野的平均數(shù)代表該只小鼠腦黑質(zhì)中尼氏小體的含量。

1.6.4腸道菌群16S rRNA檢測分析 ①收集正常組、模型組和術(shù)虎合劑組小鼠盲腸內(nèi)容物并于-80 ℃冰箱保存。使用E.Z.N.A.?soil試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)提取各組小鼠糞便DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量，利用NanoDroP2000檢測DNA濃度和純度，保存在-20 ℃冰箱中備用。②16S rRNA擴(kuò)增子測序：以各個樣本的總DNA為模板,使用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物對V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。③信息分析流程：用qiime tools import 插件，將原始序列fastq文件，導(dǎo)入為可進(jìn)行QIIME2后續(xù)處理的文件格式。運用QIIME2 dada2插件質(zhì)量控制、修剪、去噪、拼接及去除嵌合體后，運用QIIME2 feature-classifier插件將ASV的代表序列比對到GREENGENES數(shù)據(jù)庫，得到物種的分類信息表。采用ANOVA、LEfSe方法進(jìn)行分組鑒定及鑒定樣本間豐度有差異的細(xì)菌。最終對數(shù)據(jù)信息進(jìn)行物種注釋、AlpHa多樣性指數(shù)統(tǒng)計分析(Shannon指數(shù)用于觀察群落多樣性，與群落中物種豐度和物種均勻度有關(guān)；Chao1指數(shù)用于觀察群落的豐度)、Beta多樣性無度量多維標(biāo)定法(NMDS)分析、細(xì)菌物種組間差異LEfSe分析(尋找特征微生物)、KEGG數(shù)據(jù)庫預(yù)測樣品微生物組成功能通路。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠行為學(xué)情況 各組小鼠曠場實驗前爪步距比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。爬桿實驗中，模型組小鼠掉頭時間、下桿時間均明顯長于正常組(P均<0.05)，白術(shù)組、虎杖組、術(shù)虎合劑組小鼠掉頭時間、下桿時間均明顯短于模型組(P均<0.05)，且術(shù)虎合劑組小鼠掉頭時間明顯短于虎杖組(P<0.05)。見表1。

表1 正常組和帕金森病各組小鼠行為學(xué)實驗結(jié)果比較

2.2各組小鼠腦組織HE染色表現(xiàn) 正常組小鼠腦組織細(xì)胞核清晰，中腦黑質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)完整；模型組小鼠神經(jīng)元數(shù)目減少，核仁模糊；與模型組相比，各藥物組小鼠神經(jīng)元數(shù)量增加，其中術(shù)虎合劑組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量最多。見圖1。

圖1 正常組和帕金森病各組小鼠腦組織HE染色病理表現(xiàn)(×400)

2.3各組小鼠Nissl染色黑質(zhì)神經(jīng)元尼氏小體形態(tài)與數(shù)量 正常組小鼠黑質(zhì)致密帶神經(jīng)元結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，細(xì)胞核淡染，核仁顯影明顯，細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)色，尼氏小體呈現(xiàn)紫藍(lán)色著色，清晰可見，分布在細(xì)胞核的周圍，尼氏小體的數(shù)量為183個；模型組小鼠黑質(zhì)致密帶神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，細(xì)胞核固縮或偏移，部分核仁可見，細(xì)胞質(zhì)中央尼氏小體溶解消失，胞質(zhì)呈蒼白均質(zhì)狀，完整神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，黑質(zhì)中尼氏小體的數(shù)量為73個，明顯少于正常組(P<0.05)；白術(shù)組和虎杖組小鼠神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)部分恢復(fù)，術(shù)虎合劑組小鼠神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常，尼氏小體數(shù)量分別為163個、87個及216個，均明顯多于模型組(P均<0.05)，其中術(shù)虎合劑組尼氏小體數(shù)量與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 正常組和帕金森病各組小鼠腦組織Nissl染色黑質(zhì)部尼氏小體形態(tài)(×400)

2.4各組小鼠腸道菌群情況

2.4.1物種注釋結(jié)果

2.4.1.1門分類水平 正常組、模型組、術(shù)虎合劑組主要以厚壁菌門(Firmicutes,66.2%，60.9%，52.2%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,23.1%，11.6%，11.8%)、疣微菌門(Verrucomicrobia,4.5%，8.7%，26.5%)、變形菌門(Proteobacteria,3.5%，13.9%，2.5%)為主，這4種細(xì)菌在各組小鼠糞便細(xì)菌中的占比大。與正常組比較，模型組擬桿菌門和厚壁菌門比例下降，疣微菌門及變形菌門比例升高；與模型組比較，術(shù)虎合劑組厚壁菌門和變形菌門比例降低，疣微菌門比例升高。見圖3。

圖3 正常組和帕金森病各組小鼠腸道菌群門分類水平下的物種疊加柱形圖

2.4.1.2科分類水平 正常組、模型組、白術(shù)虎杖組主要以屬于厚壁菌門的毛螺菌科(Lachnospiraceae,22.4%，13.1%，16.4%)、屬于梭菌屬(Clostridium,26.9%，11.5%，10.9%)、屬于擬桿菌門的S24-7菌科(Muribaculaceae,20.1%，9.7%，10.3%)、屬于疣微菌門的疣微菌科(Verrucomicrobiaceae,4.5%，8.6%，26.5%)、丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae,8.2%，4.0%，8.0%)為主。與正常組比較，模型組毛螺菌科、梭菌科、Muribaculaceae比例均明顯下降，疣微菌科比例明顯升高；與模型組比較，術(shù)虎合劑組毛螺菌科、疣微菌科比例升高，與門水平結(jié)果一致。見圖4。

圖4 正常組和帕金森病各組小鼠腸道菌群科分類水平下的物種疊加柱形圖

2.4.1.3屬分類水平 正常組、模型組、術(shù)虎合劑組主要以未標(biāo)明的梭菌屬(Clostridium,26.9%，11.5%，10.9%)、阿克曼菌屬(Akkermansiaceae,4.5%，8.7%，26.5%)、Muribaculaceae(20.1%，9.6%，10.3%)、毛螺菌屬(Lachnospiraceae,19.6%，11.5%，13.3%)、Allobaculum(7.9%，3.6%，7.3%)為主。與模型組比較，術(shù)虎合劑組阿克曼菌屬、Allobaculum比例升高。見圖5。

圖5 正常組和帕金森病各組小鼠腸道菌群屬分類水平下的物種疊加柱形圖

2.4.2AlpHa多樣性指數(shù)統(tǒng)計分析 模型組Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)均明顯低于正常組(P均<0.05)，術(shù)虎合劑組均明顯高于模型組(P均<0.05)。見表2。

表2 正常組和帕金森病各組小鼠腸道菌群AlpHa多樣性指數(shù)分析

2.4.3Beta多樣性NMDS分析 基于Unweighted Unifrac距離進(jìn)行Beta多樣性NMDS分析(見圖6)，圖中的點代表樣本，不同顏色的點歸屬于不同的樣本組，點到點之間的距離代表樣本菌群差異程度，兩點之間的距離越近，提示兩個樣本之間的微生物群落結(jié)構(gòu)具有越高的相似度。Stress=0.1814<0.2，故此分析可靠。術(shù)虎合劑組和正常組距離接近，組內(nèi)差異性小，表明微生物群落結(jié)構(gòu)相似；模型組內(nèi)樣本點距離較遠(yuǎn)，個別點與術(shù)虎合劑組、正常組距離較遠(yuǎn)，表明模型組和正常組微生物群落結(jié)構(gòu)有差異性。

圖6 正常組和帕金森病各組小鼠腸道菌群Beta多樣性NMDS分析

2.4.4細(xì)菌物種組間差異LEfSe分析 以LDA閾值等于4測量代表微生物具有顯著差異，結(jié)果模型組與正常組相比，主要在1個菌門、3個菌綱、4個菌目、5個菌科、5個菌屬有顯著差異，其中正常組中出現(xiàn)最明顯改變的菌科是毛螺菌科(LachnosPiraceae)，模型組中桿菌綱(Bacilli)、變形菌門(Proteobacteria)、乳酸桿菌目(Lactobacillales)、丙型變形菌綱(Gammaproteobacteria)的相對豐度明顯增加；與模型組相比，術(shù)虎合劑組主要在2個菌門、3個菌綱、5個菌目、4個菌科、5個菌屬上有明顯差異，其中阿克曼菌科(Akkermansl)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)改變最顯著。見圖7。

圖7 正常組和帕金森病各組小鼠腸道菌群物種組間差異LEfSe分析

2.4.5樣品微生物組成功能通路預(yù)測 使用PICRUSt2對代表性序列進(jìn)行功能預(yù)測分析，得到MetaCyc數(shù)據(jù)庫通路的百分比組成柱形圖(見圖8)。與模型組相比，術(shù)虎合劑組顯著上調(diào)的通路有5條，分別為ANAGLYCOLYSIS-PWY(糖酵解Ⅲ)、PWY-5104(L-異亮氨酸生物合成Ⅳ)、PWY-5686(UMP生物合成)、CALVIN-PWY(卡爾文循環(huán))、BRANCHED-CHAIN-AA-SYN-PWY(支鏈氨基酸生物合成的超途徑)。

圖8 正常組和帕金森病各組小鼠腸道菌群MetaCyc通路預(yù)測組成柱形圖

3 討 論

帕金森病是一種以運動減少、姿勢障礙及肢體震顫為主要臨床表現(xiàn)的腦退行性疾病，屬于中醫(yī)學(xué)“顫證”“拘證”等的范疇，病位在腦。中醫(yī)認(rèn)為“夫腦者，一身之宗，百神之會”(《修真十書》)，其部位及功能與現(xiàn)代西醫(yī)學(xué)的“腦”基本是一致的。中醫(yī)脾胃學(xué)說與腦有著密切的聯(lián)系，以脾胃學(xué)說為基礎(chǔ)對腦退行性疾病進(jìn)行防治有著重要的價值[10]。清·何夢瑤《醫(yī)碥》曰：“顫，搖也；振，戰(zhàn)動也，亦風(fēng)火搖撼之象，由水虛而然，風(fēng)木盛則脾土虛?！倍c道菌群平衡是脾主運化的主要生理功能[11]。張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》曰：“飲食入胃不能傳送下行，上則為脹滿，下則為便結(jié)?！惫使P者認(rèn)為對帕金森病來說，腦-腸-微生物軸非常恰當(dāng)?shù)亟忉屃四X與中醫(yī)脾胃的相關(guān)性，脾虛腑實證是帕金森病常見的中醫(yī)臨床證候。白術(shù)生用可健脾益氣，大劑量應(yīng)用時通補(bǔ)兼具；虎杖味微苦，性微寒，功能瀉下通便?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，重用白術(shù)能夠改善帕金森患者諸癥[12]；虎杖中含有的白藜蘆醇對帕金森病小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元具有保護(hù)作用，能夠明顯改善帕金森病小鼠的行為能力[13]。

本實驗中行為學(xué)結(jié)果顯示，白術(shù)組、虎杖組、術(shù)虎合劑組小鼠掉頭時間、下桿時間均明顯短于模型組，且術(shù)虎合劑組小鼠掉頭時間明顯短于虎杖組，提示益脾法、通腑法對帕金森病小鼠的行為能力有改善作用，而基于益脾通腑法的術(shù)虎合劑的改善作用更明顯。組織病理觀察顯示：帕金森病小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元尼氏小體嚴(yán)重?fù)p傷，術(shù)虎合劑組黑質(zhì)神經(jīng)元尼氏小體量明顯增加，提示基于益脾通腑法的術(shù)虎合劑可以改善帕金森病小鼠的腦組織病理結(jié)構(gòu)。在腸道菌群方面，帕金森病小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，擬桿菌門和厚壁菌門比例下降，疣微菌門及變形菌門比例升高，Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)顯著降低，LEfSe分析結(jié)果顯示桿菌綱、變形菌門、乳酸桿菌目、丙型變形菌綱是帕金森病小鼠腸道中的特征性菌群；術(shù)虎合劑組變形菌門比例下降，疣微菌門比例升高，Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)顯著升高，LEfSe分析顯示阿克曼菌科、疣微菌科顯著改變，提示術(shù)虎合劑可提高帕金森病小鼠腸道菌群豐富度及多樣性，可明顯調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群中變形菌門及疣微菌門的相對豐度。

綜上所述，益脾通腑法(術(shù)虎合劑)能通過調(diào)節(jié)腸道菌群，影響腦黑質(zhì)中尼氏小體的含量，進(jìn)而改善帕金森病小鼠的行為能力。筆者認(rèn)為基于腦-腸-微生物軸的益脾通腑法是帕金森病治療中一種有價值的中醫(yī)治法。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。