樺褐孔菌多糖磷酸化修飾工藝研究

于方園，胡淼，門雨薇，喬晨

（沈陽工學院生命工程學院，遼寧 撫順 113122）

樺褐孔菌又名樺樹茸，是一種珍貴的藥食兩用真菌[1-4]。樺褐孔菌寄生于白樺、銀樺等活立木的樹皮上，屬于多孔菌科、褐臥孔菌屬真菌[5-7]。其中的多糖具有多種生物活性，包括抗氧化、抗疲勞、降血糖、抑制腫瘤生長、增強免疫力等。樺褐孔菌被視作天然的保健品，在歐美國家以及俄羅斯、日本等國家得到廣泛的應用[8-13]。多糖作為生物活性大分子物質，如今越來越受到研究者們的關注[14-16]。磷酸化修飾是指利用游離的磷酸根基團取代多糖支鏈結構中的羥基，通過磷酸根帶有的3個負電荷增加多糖的電負性，從而增強多糖活性。目前，關于經磷酸化修飾后的多糖生物活性在體內的作用機理以及應用開發(fā)方面的研究取得了一定的成果，如相關研究通過將殼聚糖磷酸化修飾，制備了用于骨膜組織工程的殼聚糖基支架材料，其在骨再生中有很好的應用[17]。隨著結構分析方法的不斷發(fā)展與完善，多糖的磷酸化修飾也有了更廣闊的應用前景。試驗以樺褐孔菌為原料，利用乙醇浸提法得到樺褐孔菌多糖，通過單因素試驗確定反應溫度、反應時間、pH值、三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉的適宜取值范圍，再運用響應面法對樺褐孔菌多糖磷酸化修飾工藝進行優(yōu)化，以期為樺褐孔菌多糖食品資源的開發(fā)利用，以及研究開發(fā)新的功能性多糖食品原料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樺褐孔菌菌粉：北京同仁堂健康藥業(yè)有限公司；葡萄糖：天津廣成化學試劑有限公司；苯酚：國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、95%乙醇、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉：天津陽光允能試劑公司；三偏磷酸鈉、三聚磷酸鈉：國藥集團上海試劑有限公司。以上化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

電子天平（BSA124S）：上海民橋精密科學儀器有限公司；高速萬能粉碎機（FW100）：天津市泰斯特儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HWS-26）：上海一恒科技有限公司；臺式高速離心機（TCL-16G）：上海安亭科學儀器廠；旋轉蒸發(fā)儀（N100IDSB210）：上海泉杰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樺褐孔菌多糖的提取

將粉碎的樺褐孔菌菌粉按料液比1∶5（g/mL）加入85%乙醇溶液，回流提取4 h，真空抽濾，濾渣再回流2次。合并3次濾液真空減壓濃縮，冷卻后加入3倍體積的85%乙醇溶液充分攪拌，靜置20 h，3 500 r/min離心5 min，分離得到沉淀物，置于平皿中充分干燥，得到樺褐孔菌多糖。

1.3.2 樺褐孔菌多糖磷酸化修飾工藝

稱取一定比例的磷酸化試劑（三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉）共7 g溶于100 mL蒸餾水中，配制成磷酸化試劑，加入1 g樺褐孔菌多糖、5 g硫酸鈉，溶解后調節(jié)溶液pH值至8.7，在一定溫度、時間下進行磷酸化反應。反應結束后，向其中加入95%乙醇溶液，使溶液體積變?yōu)樵瓉淼?倍，靜置沉淀24 h，經透析、干燥得到磷酸化樺褐孔菌粗多糖。

1.3.3 磷酸根含量的測定

采用鉬藍比色法測定磷酸根含量，將不同濃度的磷酸根標準溶液，加入由20%抗壞血酸、3 mol/L硫酸和3%鉬酸銨配制成的定磷試劑中，在45℃條件下反應30 min，冷卻后于660 nm處測吸光值，繪制標準曲線。得到標準曲線回歸方程為y=0.81x+0.0407、R2=0.995 1，式中：y為吸光度；x為磷酸根含量。

樣品中磷酸根含量測定方法：取0.5 g樣品置于燒杯中，依次加入1 mL濃硫酸和1 mL濃硝酸，加熱至產生白煙。溶液冷卻后，加30%的H2O21 mL，再次加熱。重復以上操作，至不產生白煙。再加入6 mol/L鹽酸1 mL，加熱分解溶液中殘留的酸。取5 mL磷酸化后的樺褐孔菌多糖溶液，定容后通過繪制標準曲線方法測定樣品中磷酸根含量。

1.3.4 單因素試驗方法

取0.5 g樺褐孔菌多糖樣品，以三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉的質量比（0∶7、1∶6、2∶5、3∶4、4∶3、5∶2、6∶1、7∶0）、反應溫度（30、50、70、80、90 ℃）、反應時間（1、2、3、4、5、6 h）、pH 值（6、7、8、9、10）為考察因素，按照 1.3.3 的方法計算樺褐孔菌多糖溶液中磷酸根含量。

1.3.5 樺褐孔菌多糖磷酸化修飾工藝的響應面優(yōu)化

以單因素試驗結果為基礎，利用響應面Box-Benhnken設計原理，以樺褐孔菌多糖溶液中磷酸根含量為響應值，三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉的質量比、反應時間、反應溫度、pH值作為變量，設計響應面試驗，確定樺褐孔菌多糖磷酸化修飾的最佳工藝參數(shù)，響應面試驗設計因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用Design-Expert V8.0.6軟件進行響應面設計和方差分析，Origin 2018軟件和SPSS 23軟件分別進行繪圖及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉質量比對磷酸根含量的影響

在反應溫度80℃、pH8.0、反應時間5 h的條件下，選擇不同的三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉的質量比，對樺褐孔菌多糖進行磷酸化修飾，結果如圖1所示。

圖1 三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉的質量比對磷酸根含量的影響Fig.1 Effects of mass ratio of sodium tripolyphosphate and sodium trimetaphosphate on phosphate content

由圖1可知，當三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉的質量比在0∶7～4∶3時，溶液中磷酸根含量變化幅度不大，說明在此范圍內三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉有相互抑制的作用，且破壞了樺褐孔菌多糖的化學結構。當試劑配比為4∶3～6∶1時，溶液中磷酸根含量隨著三聚磷酸鈉占比的增大逐漸升高，說明適當提高三聚磷酸鈉占比可以起到促進磷酸化反應的作用[18]，當試劑配比達到6∶1時，磷酸根含量達到最大值。因此選擇三聚磷酸鈉與三偏磷酸鈉質量比為 5∶2、6∶1、7∶0 進行后續(xù)試驗。

2.1.2 反應溫度對磷酸根含量的影響

在反應時間5 h、pH8.0、三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉質量比為5∶2的條件下，不同反應溫度對磷酸根含量的影響結果如圖2所示。

由圖2可知，樺褐孔菌多糖溶液中磷酸根含量隨反應溫度的升高先增大后減小。當溫度在30℃～80℃時，磷酸根含量隨溫度升高逐漸增大，由5.76%增加到9.63%，這可能是因為隨著溫度的升高，樺褐孔菌多糖中的高分子鍵活性得到增強[19]，磷酸根的利用率也會隨之增加。當反應溫度在80℃～90℃時，磷酸根含量呈下降趨勢。因為反應溫度過高，破壞了多糖內部的糖苷鍵，導致多糖磷酸化程度下降。因此選擇反應溫度為70、80、90℃進行后續(xù)試驗。

2.1.3 反應時間對磷酸根含量的影響

在反應溫度80℃、pH8.0、三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉質量比5∶2的條件下，不同反應時間對磷酸根含量的影響結果如圖3所示。

圖3 反應時間對磷酸根含量的影響Fig.3 Effects of reaction time on phosphate content

由圖3可知，當反應時間為1 h～4 h時，磷酸根含量隨反應時間延長而增加。這可能是由于適當延長反應時間，磷酸化試劑與樺褐孔菌多糖分子的接觸更充分，使得樺褐孔菌多糖溶液中磷酸根含量增加。當反應時間在4 h～6 h時，磷酸根含量呈現(xiàn)下降的趨勢，這可能是因為樺褐孔菌多糖在高溫下發(fā)生焦化作用[20]，從而使其多糖中磷酸根含量下降。當反應時間為4 h時，樺褐孔菌多糖溶液中的磷酸根含量最高，達到9.14%。因此選擇反應時間為3、4、5 h進行后續(xù)試驗。

2.1.4 pH值對磷酸根含量的影響

在反應溫度60℃、反應時間3 h、三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉質量比5∶2的條件下，不同pH值對磷酸根含量的影響結果如圖4所示。

圖4 pH值對應的磷酸根含量Fig.4 Effects of pH value on phosphate content

由圖4可知，當pH值為6～9時，樺褐孔菌多糖溶液中的磷酸根含量隨pH值的升高而增加。這是因為三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉在酸性條件下分解成焦磷酸鈉和正磷酸鈉，pH值的升高，為磷酸化試劑與樺褐孔菌多糖反應提供了適當?shù)膲A性環(huán)境，故樺褐孔菌多糖溶液中磷酸根含量增加。當pH值為9～10時，樺褐孔菌多糖溶液中磷酸根的含量隨pH值升高而逐漸下降，這是因為pH值過高會對整個反應的酯化過程產生不可逆的副作用。當pH值為9時，樺褐孔菌多糖溶液中磷酸根含量達到最高，為9.58%。因此選擇pH值為8、9、10進行后續(xù)試驗。

2.2 響應面分析法優(yōu)化樺褐孔菌多糖磷酸化修飾的工藝條件

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析

響應面試驗設計與結果見表2，回歸模型方差分析結果見表3。

表2 響應面分析設計及結果Table 2 Design and results of response surface analysis

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

根據(jù)Design-Expert V8.0.6軟件分析，得到樺褐孔菌多糖溶液中磷酸根含量（Y）與自變量之間的回歸方程：Y=10.10-0.064A-0.82B-0.89C+0.22D-0.035AB+0.11AC-0.43AD-0.43BC-0.055BD+0.21C-0.82A2-1.80B2-1.12C2-1.4D2。

由表3可知，本試驗回歸模型P＜0.01，表明該模型影響極顯著。而失擬項P＞0.05，模型差異不顯著，說明理論值與實際值有良好的關聯(lián)性，該方法優(yōu)化樺褐孔菌多糖磷酸化修飾工藝是準確可靠的。由F值可知，各因素對樺褐孔菌多糖溶液中磷酸根含量影響的大小順序為pH值＞反應溫度＞反應時間＞三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉的質量比。

2.2.2 響應面分析與優(yōu)化

利用Design-Expert V8.0.6進行優(yōu)化，按照方程模型可得到樺褐孔菌多糖磷酸化修飾的最優(yōu)工藝參數(shù)：三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉的質量比為5.93∶0.07，反應溫度為73.16℃，反應時間為4.06 h，pH值為8.64，在此條件下，樺褐孔菌多糖溶液中磷酸根含量為10.34%。考慮到反應的實際條件，則將參數(shù)調整為三聚磷酸鈉與三偏磷酸鈉質量比為6∶1，反應溫度75℃，反應時間4 h，pH值為8.6。在此條件下進行驗證試驗，對樺褐孔菌多糖進行磷酸化修飾，測得樺褐孔菌多糖溶液中的磷酸根含量為9.58%，與該回歸方程模型的預測值接近。

各因素交互作用的響應面圖見圖5和圖6。響應曲面坡度越陡峭，說明交互作用影響越大，反之影響越小[21]。

圖5 三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉的質量比與反應時間交互作用Fig.5 The interaction between mass ratio of sodium tripolyphosphate and sodium trimetaphosphate and reaction time

圖6 反應溫度與pH值交互作用Fig.6 The interaction between reaction temperature and pH value

由圖5可知，三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉的質量比與反應時間交互作用的響應曲面坡度較為陡峭，等高線圖接近橢圓形，說明該交互作用對樺褐孔菌多糖溶液中磷酸根含量影響顯著，與方差分析結果一致。由圖6可知，反應溫度和pH值交互作用的響應曲面坡度較為陡峭，等高線圖接近橢圓形，說明該交互作用對樺褐孔菌多糖溶液中磷酸根含量影響顯著，與方差分析結果一致。

3 結論

在單因素試驗基礎上，通過響應面法對樺褐孔菌多糖磷酸化修飾工藝進行優(yōu)化，確定最佳工藝條件：三聚磷酸鈉和三偏磷酸鈉的質量比為6:1，反應溫度為75℃，反應時間為4 h，pH值為8.6。選用此工藝參數(shù)進行驗證試驗，測得磷酸根含量為9.58%，與理論值接近，充分驗證了模型的準確性。本文可為樺褐孔菌多糖磷酸化修飾工藝研究，以及后續(xù)的樺褐孔菌多糖磷酸化衍生物的開發(fā)提供一定的參考依據(jù)。