“美酒”白掌莖尖培養(yǎng)及組培快繁技術(shù)

吳賢彬，黃明翅，夏 晴，宿慶連，曾偉達(dá)，周曉云

（廣州花卉研究中心，廣東 廣州 510360）

“美酒”白掌（Spathiphyllum kochii ‘mojo’）是白掌的一個(gè)栽培品種，其花葉具有較高的觀賞價(jià)值，且株型嬌小、耐陰，又具有凈化室內(nèi)空氣的功效［1］，適合家庭及辦公場所擺放，深受廣大消費(fèi)者的喜愛，其市場前景廣闊。

莖尖培養(yǎng)并進(jìn)行組培快繁是獲得優(yōu)質(zhì)種苗的重要途徑，該技術(shù)已應(yīng)用于部分作物［2-3］、果蔬［4-5］、花卉［6-8］種苗的繁殖生產(chǎn)中。目前。關(guān)于白掌組培快繁的研究報(bào)道較多，常用葉片、葉柄、頂芽、莖段、花梗、花序等組織或器官作外植體，表面消毒難度均較高，污染率介于10%～87%之間［9］，外植體損耗大，且經(jīng)過多代培養(yǎng)后，易產(chǎn)生內(nèi)生細(xì)菌而影響其后續(xù)增殖及成苗質(zhì)量。白掌莖尖被葉柄緊密包裹，受環(huán)境污染的影響較小，但剝?nèi)±щy。目前，關(guān)于白掌莖尖離體培養(yǎng)和快繁的研究鮮有報(bào)道。因此，研究“美酒”白掌莖尖離體培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)提高其外植體利用率、生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種苗具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選取廣州花卉研究中心生長健壯、無病蟲害的2年生“美酒”白掌。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 莖尖消毒 將整株切下，留莖段（帶4～5片葉柄）約5 cm，沖洗、晾干。用0.6%含氯消毒溶液（以君鴻牌消毒粉配制，其有效氯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%～21%）振蕩清潔40 min，期間換1次消毒液；再用去離子水沖洗干凈，在無菌條件下剝?nèi)?片葉柄，加入0.1% HgCl2溶液再分別浸泡消毒4、8和12 min；用滅菌去離子水沖洗6次，吸干水分，剝?nèi)≈睆?～2 mm莖尖，測量其基部直徑，并培養(yǎng)于1/2MS+0.6 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培養(yǎng)基上，每處理10個(gè)莖尖，3次重復(fù)。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)其污染莖尖數(shù)，并計(jì)算污染率；40 d后測量莖尖基部直徑，計(jì)算莖尖生長量。計(jì)算公式如下：

污染率（%）=污染莖尖數(shù)/莖尖總數(shù)×100%

莖尖生長量（mm）=培養(yǎng)后莖尖基部直徑（mm）-培養(yǎng)前莖尖基部直徑（mm）

1.2.2 莖尖培養(yǎng) 將滅菌莖尖培養(yǎng)在不同基本培養(yǎng)基（MS、1/2MS、1/4MS）、含不同濃度細(xì)胞分裂素（6-BA、KT）、含不同濃度生長素（NAA、IBA、IAA）培養(yǎng)基中，每處理接種6個(gè)莖尖，3次重復(fù)。培養(yǎng)40 d后測量莖尖基部的直徑，并計(jì)算莖尖生長量。測量后轉(zhuǎn)接至1/2MS+0.6 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直至分化出叢生芽。

1.2.3 叢生芽增殖培養(yǎng) 將叢生芽以單芽、雙芽、三芽和四芽的團(tuán)塊接種培養(yǎng)在不同基本培養(yǎng)基（MS、3/4MS、1/2MS），并添加0.6 mg/L 6-BA和0.02 mg/L NAA的培養(yǎng)基中，每瓶培養(yǎng)基4個(gè)芽團(tuán)，每處理5瓶，3次重復(fù)。培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)其叢生芽數(shù)，并計(jì)算叢生芽增殖率。

將叢生芽以單芽形式培養(yǎng)在分別含6-BA（0.6、1.0、1.5 mg/L）與生長素（0.02、0.05 mg/L NAA，0.1 mg/L IBA）的9種3/4MS培養(yǎng)基上，每瓶4個(gè)單芽，每處理5瓶，3次重復(fù)。培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)其叢生芽數(shù)，并計(jì)算叢生芽增殖率。計(jì)算公式如下：

叢生芽增殖率（%）=培養(yǎng)后叢生芽總數(shù)/接入芽總數(shù)×100%

1.2.4 生根培養(yǎng) 當(dāng)植株達(dá)到3 cm高，并且具有3片葉時(shí)，將切除根的植株培養(yǎng)在分別添加0.5 mg/L生長素（NAA、IBA、TRP）的1/2MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。每瓶10株，每處理5瓶，3次重復(fù)。培養(yǎng)15、30 d后各統(tǒng)計(jì)1次生根植株數(shù)，計(jì)算生根率。計(jì)算公式如下：

生根率（%）=生根植株數(shù)/接入植株數(shù)×100%

1.2.5 移栽 生根培養(yǎng)30 d后，將生根苗的瓶蓋擰松，放置在溫室內(nèi)煉苗7 d；取出苗并洗凈，移栽于填滿泥炭基質(zhì)（0～20 mm）的72孔穴盤中，在溫室溫度為（26±2） ℃、空氣相對(duì)濕度約為80%的條件下栽培；分別于培養(yǎng)7、35 d時(shí)測量株高及統(tǒng)計(jì)葉片數(shù)，計(jì)算其株高生長量及葉片的增加數(shù)。

切取株高大于4 cm，且具有3片葉以上、2條根的叢生芽帶根單株，在同樣條件下栽種、管理與測量，計(jì)算株高生長量及葉片增加數(shù)。計(jì)算公式如下：

株高生長量（mm）=培養(yǎng)35 d的株高（mm）-培養(yǎng)7 d的株高（mm）；

葉片增加數(shù)=培養(yǎng)35 d的葉片數(shù)-培養(yǎng)7 d的葉片數(shù)

1.3 培養(yǎng)條件

莖尖在光強(qiáng)6 μmol/（m2·s）條件下培養(yǎng)7 d后，轉(zhuǎn)入光強(qiáng)為25～30 μmol/（m2·s）的條件下培養(yǎng)。光照時(shí)間為10 h/d，溫度為（24±2） ℃，空氣相對(duì)濕度為60%。

叢生芽增殖、生根均在光強(qiáng)為25～30 μmol/（m2·s）的條件下培養(yǎng)。其他條件同莖尖培養(yǎng)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（SE）表示，采用Excel 2016、SPSS 19軟 件 進(jìn) 行 統(tǒng) 計(jì) 分 析，應(yīng) 用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖尖消毒

由表1可知，莖尖經(jīng)0.6%含氯消毒溶液浸泡40 min后，再用0.1% HgCl2分別消毒4、8和12 min，表面菌類基本被殺滅，同時(shí)莖尖均存活，僅4 min處理的出現(xiàn)1個(gè)污染，說明該消毒方法有效；但隨著消毒時(shí)間的增加，莖尖生長逐漸減緩，表明0.1% HgCl2消毒時(shí)間長對(duì)莖尖生長有一定的抑制作用，但差異不顯著。因此，選擇0.1% HgCl2消毒4 min，這樣既能有效殺滅莖尖表面的菌類，同時(shí)也對(duì)莖尖生長的影響較小。

表1 0.1% HgCl2不同消毒時(shí)間對(duì)莖尖生長的影響

2.2 莖尖培養(yǎng)的影響因素

2.2.1 基本培養(yǎng)基對(duì)莖尖生長的影響 由表2可知，培養(yǎng)于MS和1/2MS上的莖尖生長量顯著大于培養(yǎng)于1/4MS上的，且培養(yǎng)于1/2MS上的莖尖生長量最大，為3.66 mm。這表明不同濃度基本培養(yǎng)基對(duì)莖尖生長量有顯著影響，適合于莖尖生長的基本培養(yǎng)基是1/2MS，高濃度或低濃度都不利于莖尖的生長。

表2 基本培養(yǎng)基對(duì)莖尖生長的影響

2.2.2 細(xì)胞分裂素對(duì)莖尖生長的影響 由表3可知，適量的6-BA和KT均適合“美酒”白掌莖尖生長，但對(duì)莖尖生長量的影響差異不顯著。在1/2MS+0.6 mg/L KT+0.1 mg/L IBA培養(yǎng)基上，其莖尖生長量最大，為3.22 mm，與0.2 mg/L 6-BA和KT處理相比，更能促進(jìn)莖尖生長。

表3 細(xì)胞分裂素對(duì)莖尖生長的影響

2.2.3 生長素對(duì)莖尖生長的影響 由表4可知，培養(yǎng)在1/2MS+0.6 mg/L KT+0.1 mg/L IBA上的莖尖獲得了最大生長量，達(dá)到2.81 mm，顯著大于培養(yǎng)在1/2MS+0.6 mg/L KT+0.1 mg/L NAA 上的。這表明IAA、IBA在促進(jìn)莖尖生長方面優(yōu)于NAA，且低濃度IBA也優(yōu)于高濃度IBA。將所有莖尖培養(yǎng)在1/2MS+0.6 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培養(yǎng)基上2個(gè)周期（80 d），大部分莖尖可以分化出叢生芽。

表4 生長素對(duì)莖尖生長的影響

2.3 叢生芽增殖的影響因素

2.3.1 基本培養(yǎng)基與接種不同芽團(tuán)對(duì)叢生芽增殖的影響 由表5可知：在3/4MS上培養(yǎng)的叢生芽增殖率最高，平均為3.41，且以雙芽接種的最高（4.04）；在不同基本培養(yǎng)基上接種單芽和雙芽的平均增殖率分別為3.41和3.38，顯著高于接種四芽的；單芽接種于MS上的高于另外3種芽團(tuán)類型，且與3/4MS上的差異不顯著。由此表明，不同濃度基本培養(yǎng)基與接種不同芽團(tuán)對(duì)“美酒”白掌叢生芽增殖具有顯著的影響，且其叢生芽增殖以單芽接種培養(yǎng)于MS上或雙芽接種培養(yǎng)于3/4MS上較為合適。

表5 基本培養(yǎng)基與接種不同芽團(tuán)對(duì)叢生芽增殖率的影響

2.3.2 生長調(diào)節(jié)劑對(duì)叢生芽增殖率的影響 由表6可知，培養(yǎng)于1.5 mg/L 6-BA上的叢生芽增殖率最高，平均為3.31，顯著高于培養(yǎng)在另外2個(gè)濃度水平的處理。培養(yǎng)于IBA上的叢生芽增殖率為3.07，略高于培養(yǎng)在NAA上的，但不同濃度及類型生長素對(duì)叢生芽增殖影響差異不顯著。結(jié)果表明：不同濃度6-BA與生長素配比對(duì)“美酒”白掌叢生芽增殖具有顯著影響。培養(yǎng)在3/4MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培養(yǎng)基上的叢生芽，其增殖率最高，為3.49，優(yōu)于或顯著優(yōu)于其他配比下的培養(yǎng)基。

表6 6-BA與生長素配比對(duì)叢生芽增殖率的影響

2.4 生長素對(duì)生根的影響

由表7可知，不同生長素及生根時(shí)間對(duì)叢生芽生根的影響不同。在3種生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)15 d后的叢生芽生根率均超過50%，30 d后的生根率可達(dá)90%以上。生根培養(yǎng)15 d后，TRP誘導(dǎo)叢生芽的生根率最高，為66.43%，顯著高于NAA的培養(yǎng)基，但生根培養(yǎng)30 d，差異不顯著，說明TRP更有利于叢生芽生根。

表7 生長素對(duì)生根率的影響 %

2.5 生長素對(duì)移栽后組培苗生長的影響

由表8可知，用IBA生根的苗移栽35 d后其株高生長量最大，為1.38 cm；與應(yīng)用NAA（1.04 cm）、TRP（0.84 cm）生根，以及帶根叢生芽單株（0.90 cm）直接移栽的差異顯著。經(jīng)生根培養(yǎng)的組培苗移栽35 d后均長出2片新葉，顯著高于直接移栽的。結(jié)果表明：應(yīng)用IBA、NAA生根，對(duì)組培種苗移栽初期（35 d）株高和長新葉均有一定的促進(jìn)作用。

表8 生長素對(duì)移栽后組培苗生長的影響

3 結(jié)論與討論

建立白掌快繁體系所用外植體有花序［10-12］、頂芽［13-15］、側(cè)芽［16-18］、莖段［19-20］、葉片和葉柄［21］，其污染率低的有10%，高的可達(dá)87%，損耗了大量的外植體。增加消毒時(shí)間可降低污染率，但會(huì)影響其存活率、生活力［9］。本試驗(yàn)采用1～2 mm的莖尖建立“美酒”白掌的無菌系，莖尖消毒成功率達(dá)到97%以上，充分利用、節(jié)省了外植體。在建立無菌系的過程中，用頂芽、側(cè)芽誘導(dǎo)叢生芽相對(duì)于用葉片、葉柄誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生不定芽更容易，且變異率更低［16］。葉片和花梗難以誘導(dǎo)出芽，而側(cè)芽和莖段是最合適的外植體［22］。劉曉青等［23］認(rèn)為芽誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽的增殖方式具有遺傳穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)。在本試驗(yàn)中，莖尖培養(yǎng)120 d后即誘導(dǎo)出叢生芽，經(jīng)多代增殖培養(yǎng)，未發(fā)現(xiàn)可見變異，可見芽增殖方式的遺傳穩(wěn)定性較高。

在白掌快繁體系中，頂芽（莖尖）、腋芽常見的初代培養(yǎng)配方是MS+1.5～2.0 mg/L 6-BA+0.1～0.2 mg/L NAA［13-19］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)1～2 mm的莖尖，KT優(yōu)于6-BA，且低濃度就能讓莖尖較好地生長；觀察發(fā)現(xiàn)長大的莖尖能很好地誘導(dǎo)出叢生芽而不產(chǎn)生愈傷，這有利于降低后期芽增殖產(chǎn)生變異的可能。

白掌生根使用IBA、NAA或兩者搭配，生根率在95%以上，兩者混合生根優(yōu)于IBA，且IBA的生根效果又優(yōu)于NAA［16］。本試驗(yàn)得出了類似結(jié)論，并發(fā)現(xiàn)TRP的生根效率優(yōu)于IBA、NAA，但移栽后，小苗在株高生長量及葉片數(shù)增加上均不如IBA和NAA，其原因有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

白掌在增殖過程中根芽同步生長，可省去生根過程，縮短組培周期，節(jié)省生產(chǎn)成本［24-25］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，“美酒”白掌在增殖過程中能根芽同步，帶根叢生芽單株在溫室栽培條件下移栽存活率可達(dá)100%。對(duì)組培生根苗和帶根叢生芽單株進(jìn)行移栽比較發(fā)現(xiàn)，移栽35 d內(nèi)，生根苗的生長速度顯著快于帶根叢生芽單株小苗。可見，白掌在組培過程中省去生根過程，能節(jié)省成本，但會(huì)顯著影響組培苗移栽后初期的生長，其可能原因是叢生芽單株移栽初期，小苗未能適應(yīng)環(huán)境的改變。若在增殖末期增加1～2周的時(shí)間，以煉苗環(huán)境條件來培養(yǎng)增殖芽，則帶根叢生芽單株可能達(dá)到生根苗移栽的相似效果，從而實(shí)現(xiàn)縮短其組培生產(chǎn)周期、節(jié)約生產(chǎn)成本且不影響苗生長的目標(biāo)。