辣椒核心種質(zhì)研究進展

朱雪梅，郭廣君，潘寶貴，刁衛(wèi)平，劉金兵，高長洲，高海濤，王述彬*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095；3.江蘇蘇潤種業(yè)股份有限公司，江蘇 沛縣 221636）

辣椒（Capsicum spp.）起源于南美，作為蔬菜和調(diào)味品分布在世界各地，包括熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)［1］。1983年Ibpgr［2］將辣椒劃分為32個種，明確了一年生辣椒（C. annuum L.）、灌木狀辣椒（C. frutescens L.）、漿果狀辣椒（C. baccatum L.）、絨毛辣椒（C. pubescens Ruiz. & Pav.）、中國辣椒（C.chinense Jacq.）等5個栽培種。世界蔬菜中心（原名亞洲蔬菜研究與發(fā)展中心，AVRDC）是世界上最大的辣椒種質(zhì)資源庫，保藏了包括11個辣椒種共8665份材料，占全球辣椒種質(zhì)資源的11%［3］。我國國家蔬菜種質(zhì)資源庫保存有1904份辣椒種質(zhì)材料，多為20世紀(jì)80年代全國各地收集保存的地方品種，以C. annuum種為主［4］。辣椒屬種質(zhì)資源數(shù)量巨大，遺傳多樣性也極為豐富［5］，但是已被人類利用的種質(zhì)材料仍較少［6］。

為了解決植物種質(zhì)資源規(guī)模巨大，背景繁雜不清，育種家們很難進一步研究和利用這一難題，20世紀(jì)80年代，F(xiàn)rankel提出了構(gòu)建核心種質(zhì)的設(shè)想［7］。1995年，Brown進一步形成了核心種質(zhì)的完整概念：從研究對象的所有種質(zhì)材料中，按一定標(biāo)準(zhǔn)盡可能少地選取種質(zhì)資源來代表研究對象盡量多的多樣性［8］。經(jīng)過多年的研究發(fā)展，核心種質(zhì)的構(gòu)建已形成了一套系統(tǒng)的、科學(xué)的和有效的流程。已有50多種作物構(gòu)建形成了60多個不同類型的核心種質(zhì)，這些核心種質(zhì)在種質(zhì)創(chuàng)新和作物育種中發(fā)揮了重要作用［4］。相對于其他茄科植物，辣椒屬的種更多，基因組更大，遺傳信息更為復(fù)雜，進而導(dǎo)致其基礎(chǔ)研究、種質(zhì)創(chuàng)制和品種選配更為困難。通過集中人力、物力、財力對辣椒核心種質(zhì)材料進行深入研究，明確每份核心種質(zhì)的表型特征和遺傳信息，有針對性地進行抗性研究、品質(zhì)改良、種質(zhì)創(chuàng)新、品種選育等工作，有利于構(gòu)建辣椒的核心種質(zhì)資源，提高辣椒資源的利用效率。本文在綜述核心種質(zhì)構(gòu)建方法、辣椒核心種質(zhì)構(gòu)建現(xiàn)狀及存在問題的基礎(chǔ)上，提出了辣椒核心種質(zhì)研究的發(fā)展方向，以期為辣椒種質(zhì)資源的深入研究與高效利用提供理論依據(jù)。

1 核心種質(zhì)構(gòu)建流程

核心種質(zhì)的構(gòu)建包括數(shù)據(jù)收集、數(shù)據(jù)分組、采樣策略及核心種質(zhì)的有效性評價。下文將結(jié)合實際案例對各個步驟進行分析介紹。

1.1 數(shù)據(jù)收集

核心種質(zhì)數(shù)據(jù)收集的類型包括基本數(shù)據(jù)、特征數(shù)據(jù)和鑒定評價數(shù)據(jù)3類。

1.1.1 核心種質(zhì)的基本數(shù)據(jù) 基本數(shù)據(jù)主要是指地理起源、地理分布或育種體系、分類體系等，主要用于初步分組。如上文提及的5個辣椒栽培種起源于3個不同的中心，C. annuum的初級起源中心為墨西哥，次級起源中心是危地馬拉；C. chinense和C.frutescens的初級起源中心是亞馬遜河流域；秘魯和玻利維亞是C. pubescens的初級起源中心［1，9-12］。

1.1.2 核心種質(zhì)的特征數(shù)據(jù) 特征數(shù)據(jù)包括表型和分子標(biāo)記等數(shù)據(jù)，是構(gòu)建核心種質(zhì)的主要數(shù)據(jù)［13］。由于表型數(shù)據(jù)較容易獲得，早期蔬菜核心種質(zhì)的構(gòu)建大多是基于表型數(shù)據(jù)［14］。辣椒的表型數(shù)據(jù)主要包括莖色、莖節(jié)色澤、花冠色澤、花柱長短、嫩果色澤、老果色澤、株高、果重、果長、果寬等［15］。分子標(biāo)記包括以Southern雜交為基礎(chǔ)的限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、DNA指紋技術(shù)和原位雜交，以PCR為試驗基礎(chǔ)的SSR、ISSR、RAPD和SRAP，以及以堿基序列為基礎(chǔ)的SNP［16］。分子標(biāo)記較其他遺傳標(biāo)記具有諸多優(yōu)勢：檢測方法簡單、快捷；基因組變異豐富；大多數(shù)類型的標(biāo)記呈共顯性，能夠區(qū)分純合還是雜合基因型；不同時期以及不同生物組織提取的DNA都可用來作為分子標(biāo)記進行分析［4］。相較于表型性狀受環(huán)境影響較大而言，分子標(biāo)記是建立在種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)之上的，因此其結(jié)果更加可靠。

1.1.3 核心種質(zhì)的鑒定評價數(shù)據(jù) 鑒定評價數(shù)據(jù)主要是指生育期、產(chǎn)量、品質(zhì)等表型性狀數(shù)據(jù)，用于檢測核心樣品的有效性。如鄧學(xué)斌等［17］在加工番茄核心種質(zhì)構(gòu)建及其遺傳背景分析中對于加工番茄初始核心種質(zhì)的評價時運用了表型代表性評價的方法，研究表明，所構(gòu)建的302份GCC1核心種質(zhì)各性狀分布較均勻，在去除遺傳冗余的同時保留了更多的變異，保存了原始資源群體較豐富的遺傳多樣性。

1.2 數(shù)據(jù)分組

數(shù)據(jù)分組的目的是通過對原始材料進行合理的分組來提高取樣的效率和所構(gòu)建的核心種質(zhì)的代表性［14］。核心種質(zhì)構(gòu)建中數(shù)據(jù)分組是對種質(zhì)資源進行遺傳分組，根據(jù)分組結(jié)果選用最優(yōu)的取樣策略和取樣比例，篩選出最具代表性的核心種質(zhì)［18］。數(shù)據(jù)分組的方法包括隨機取樣分組和分層取樣分組。

1.2.1 隨機取樣分組 隨機取樣分組是指每個試驗材料被分配到不同處理組的機會均等。Casler［19］在研究多年生黑麥草種質(zhì)資源的變異模式時，對375份種質(zhì)材料采用完全隨機取樣分組方式進行評估，結(jié)果表明，通過隨機取樣分組獲得的材料代表性較差。

1.2.2 分層取樣分組 分層取樣分組是根據(jù)起源地、生態(tài)型、遺傳結(jié)構(gòu)特點等因素把種質(zhì)資源進行分類。雷剛等［15］依據(jù)果形指數(shù)Fs（果長/果寬）將603份辣椒種質(zhì)分為5組，構(gòu)建了包含91份種質(zhì)的辣椒核心種質(zhì)。高志紅等［20］在構(gòu)建果梅核心種質(zhì)時，把197份樣品按照白梅、紅梅和青梅進行了分組，構(gòu)建了由20份樣品組成的核心種質(zhì)，其中白梅、紅梅和青梅分別占核心種質(zhì)的10%、30%和60%。劉闖萍等［21］將山葡萄按照省份-花型-多性狀組合聚類分組后，構(gòu)建了由48個樣品組成的山葡萄核心種質(zhì)。

1.3 取樣策略

取樣策略是指為了從初始樣品中選擇得到核心種質(zhì)，根據(jù)預(yù)計的不同形勢來制定不同的取樣方案，并根據(jù)當(dāng)前發(fā)展需要選擇更適合的取樣方案［15］，包括隨機取樣和系統(tǒng)取樣2種。

1.3.1 隨機取樣 隨機取樣是以相同的概率對全部樣品進行取樣。由于樣品起源地的環(huán)境不同，遺傳多樣性分布不均勻，不同的等位基因在全部樣品中重復(fù)的次數(shù)也不相同，所以這種取樣方法構(gòu)建的核心種質(zhì)代表性差，應(yīng)用比較少［14］。胡晉等［22］以168個基因型5個纖維性狀為例，根據(jù)樹形圖，從遺傳變異相似的每組2個遺傳材料中隨機選取1個遺傳材料，再對所選取的所有遺傳材料再次聚類、取樣，直到所取遺傳材料的數(shù)量為總遺傳材料的20%～30%，最后構(gòu)建了由41個基因型組成的棉花核心種質(zhì)。

1.3.2 系統(tǒng)取樣 系統(tǒng)取樣為核心種質(zhì)構(gòu)建中的主要取樣方法，包括恒量法、對數(shù)法、平方根法、遺傳多樣性法和比例法。恒量法適用于各組類群多樣性分布比較均勻的情況，應(yīng)用較少。Chandra等［23］基于同工酶數(shù)據(jù)，比較了采用5種取樣方法構(gòu)建的馬鈴薯核心種質(zhì)的優(yōu)劣，結(jié)果表明，恒量法、對數(shù)法和平方根法均不適用于馬鈴薯核心種質(zhì)的構(gòu)建，而比例法相對來說為最優(yōu)選擇。對數(shù)法主要應(yīng)用于初始樣品數(shù)量較少，其對數(shù)值與核心種質(zhì)數(shù)量基本一致，且遺傳背景不明晰的情況。鐘永達等［24］研究認為，利用對數(shù)法所構(gòu)建的樟樹核心種質(zhì)效果最好。平方根法可以在一定程度上修飾核心種質(zhì)的遺傳多樣性的偏離。Huaman等［25］按照在安迪吉納每個地區(qū)采集的樣品數(shù)的平方根來確定取樣比例，建立了栽培種馬鈴薯的核心種質(zhì)。趙樞紐［26］基于表型構(gòu)建辣椒核心種質(zhì)時，在25%的總體留樣規(guī)模下采用平方根法進行組內(nèi)取樣，構(gòu)建了由41份種質(zhì)構(gòu)成的預(yù)選表型核心種質(zhì)。遺傳多樣性法是指按照遺傳多樣性的多少進行取樣，遺傳多樣性多則取樣多，遺傳多樣性少則取樣少。趙麗梅等［27］對6172份一年生野生大豆資源進行了系統(tǒng)的遺傳多樣性分析，比較5種取樣方法，確立了利用遺傳多樣性取樣方法構(gòu)建野生大豆核心種質(zhì)。侯志強等［28］基于表型數(shù)據(jù)構(gòu)建初級菊芋核心種質(zhì)時同樣采用了遺傳多樣性取樣策略。比例法主要應(yīng)用于遺傳多樣性與資源數(shù)量呈正相關(guān)，各類群的數(shù)量相差較大的情況［14］。邱麗娟等［29］基于農(nóng)藝性狀的數(shù)據(jù)，以比例法構(gòu)建了我國栽培大豆的初級核心種質(zhì)。

1.4 核心種質(zhì)的有效性評價

核心種質(zhì)的有效性評價是對核心種質(zhì)構(gòu)建方法和有效性的檢驗，包括遺傳多樣性的符合性檢驗和實用性檢驗。

1.4.1 遺傳多樣性的符合性檢驗 遺傳多樣性的符合性檢驗是根據(jù)不同的數(shù)據(jù)類型分別選擇原始群體和核心種質(zhì)的各項指標(biāo)判斷其代表性。Diwan等［30］認為，如果核心種質(zhì)與原始群體在平均數(shù)及變異幅度上存在顯著差異的性狀少于30%，且核心種質(zhì)各性狀變異幅度占原始群體變幅平均值的70%以上，則認為該核心種質(zhì)基本代表了原始群體的遺傳多樣性。Gu等［31］構(gòu)建了一個包括344份材料的核心種質(zhì)，代表了原材料81%的等位基因，說明該核心種質(zhì)具有較高的代表性。根據(jù)不同類型的原始數(shù)據(jù)將遺傳多樣性的符合性檢驗分為離散性指標(biāo)多樣性和連續(xù)性指標(biāo)多樣性2種。評價離散性指標(biāo)多樣性的數(shù)據(jù)包括質(zhì)量性狀、同工酶、分子標(biāo)記等，常用多態(tài)性位點數(shù)、Nei’s多樣性指數(shù)、Shannon-Weaver多樣性信息指數(shù)等評價指標(biāo)進行評價。評價連續(xù)性指標(biāo)多樣性的數(shù)據(jù)包括產(chǎn)量、品質(zhì)、生理生化等數(shù)量性狀，常用平均數(shù)、方差、變異系數(shù)等評價指標(biāo)進行評價［14］。

1.4.2 實用性檢驗 實用性檢驗是指檢驗所建立的核心種質(zhì)對已知農(nóng)藝性狀的保留情況以及在實際應(yīng)用中是否能找到目的性狀或基因。趙紅［32］對344份辣椒核心種質(zhì)的48個園藝性狀進行了調(diào)查分析和評價，并且基于全基因組SNP關(guān)聯(lián)分析定位了與果實辣味等20個園藝性狀顯著關(guān)聯(lián)的94個SNPs。賈會霞等［33］利用231份黃瓜核心種質(zhì)進行了白粉病抗性鑒定和全基因組SNP關(guān)聯(lián)分析，檢測到12個與黃瓜白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)的SNPs。

2 辣椒核心種質(zhì)的構(gòu)建

辣椒屬可劃分為32個種，包含栽培種、已被開發(fā)利用的其他種和未被利用的野生種［34］。種質(zhì)資源作為科學(xué)研究的材料基礎(chǔ)，各個國家和科研單位極為重視種質(zhì)材料的收集和保存工作［35］。分析辣椒種質(zhì)資源的遺傳多樣性，構(gòu)建辣椒核心種質(zhì)，有利于深入挖掘和利用辣椒種質(zhì)資源中的優(yōu)異性狀［31，36］。核心種質(zhì)構(gòu)建方法在不斷的更新和完善，辣椒核心種質(zhì)構(gòu)建處于不斷進步，急需深入的階段。近年來，隨著基因組測序水平的逐步提高，測序成本有所降低，分子標(biāo)記進入以堿基序列為基礎(chǔ)的第三階段，其中SNP標(biāo)記同樣應(yīng)用于辣椒核心種質(zhì)的構(gòu)建［35］。

由于表型性狀受環(huán)境影響較大，數(shù)據(jù)采集不穩(wěn)定，基于表型數(shù)據(jù)構(gòu)建辣椒核心種質(zhì)的研究較少。2004年，Zewdie等［37］基于21個表型性狀利用分層分組代表性取樣法，以美國農(nóng)業(yè)部（USDA）1202份辣椒種質(zhì)為試材，以約10%總體取樣規(guī)模建立了包含137份材料的辣椒核心種質(zhì)。雷剛等［15］利用603份辣椒種質(zhì)材料，基于21個質(zhì)量性狀和7個數(shù)量性狀進行了辣椒核心種質(zhì)的構(gòu)建研究。該研究建立的最優(yōu)取樣方案：首先按照果形指數(shù)將603份辣椒種質(zhì)分為5個組；然后在組內(nèi)采用遺傳多樣性比例確定取樣量，總體取樣規(guī)模為15%，使用歐氏距離最遠距離法進行組內(nèi)聚類抽樣，最終選取了91份核心種質(zhì)，遺傳多樣性指數(shù)（I）、變異系數(shù)（CV）、表型保留比例（PRP）和極差符合率（CR）都達到最大值，對原始樣品具有較好的代表性。劉子記等［38］針對146份海南黃燈籠椒種質(zhì)資源，基于10個表型性狀，利用馬氏距離，采用優(yōu)先取樣法和類平均法構(gòu)建了包含43份黃燈籠椒材料的核心種質(zhì)。

分子標(biāo)記作為一種穩(wěn)定、可靠和高效的檢測技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究中，在核心種質(zhì)構(gòu)建中同樣得以廣泛應(yīng)用。2013年，Nicola等［35］利用來源于89個國家11個種的1352份辣椒種質(zhì)，基于28個SSR分子標(biāo)記信息，構(gòu)建了包含332份辣椒種質(zhì)的核心種質(zhì)。2015年，Mongkolporn等［39］基于10個SSR位點，對230份辣椒種質(zhì)進行了遺傳多樣性分析，篩選出28份具有代表性的辣椒種質(zhì),構(gòu)成了核心種質(zhì)。2016年，Lee等［36］利用48個SNPs對來源于97個國家11個種的4652份辣椒種質(zhì)資源進行了遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析，結(jié)合32個表型性狀數(shù)據(jù)，構(gòu)建了包含240份辣椒種質(zhì)的核心種質(zhì)‘CC240’。

我國辣椒育種工作進展較快，但是核心種質(zhì)的構(gòu)建起步較晚。2015年，何建文等［40］針對90份典型貴州地方辣椒種質(zhì)和7份省外種質(zhì)，利用SSR分子標(biāo)記遺傳變異信息，比較分析利用不同遺傳距離和抽樣方法構(gòu)建了辣椒的核心種質(zhì)庫，最終在歐氏距離下，按10%比例進行抽樣，采用多次聚類隨機取樣法取樣、最短遺傳距離法進行聚類分析，從97份辣椒種質(zhì)中篩選得到9份核心種質(zhì)。2016年，中國農(nóng)科院蔬菜花卉研究所利用29個SSR分子標(biāo)記針對我國蔬菜種質(zhì)資源庫中的1904個辣椒種質(zhì)資源進行了分析，構(gòu)建了包括334份種質(zhì)的核心種質(zhì)并對其進行了鑒定和評價［4，32］。2017年，吳茵［41］利用21對多態(tài)性豐富的SRAP引物對512份辣椒種質(zhì)進行了分析，構(gòu)建了288個樣品的初級核心種質(zhì)；進一步利用65對SSR標(biāo)記對初級核心種質(zhì)進行壓縮，構(gòu)建了包含200個樣品的辣椒核心種質(zhì)。2019年，譚放軍等［42］利用98份辣椒種質(zhì)，根據(jù)葉綠體trnH-psb A序列歐式距離得到的聚類分析結(jié)果，結(jié)合7個重要的農(nóng)藝性狀，篩選獲得了31份核心種質(zhì)，應(yīng)用于育種生產(chǎn)。

3 存在問題及展望

上文分析了近20年來辣椒核心種質(zhì)構(gòu)建的研究進展，近10年來利用分子標(biāo)記技術(shù)進行核心種質(zhì)構(gòu)建進入到快速發(fā)展階段，通過對國內(nèi)外研究比較發(fā)現(xiàn)，我國在辣椒核心種質(zhì)構(gòu)建方面仍存在一些問題，有待進一步改進。

（1）我國構(gòu)建的辣椒核心種質(zhì)數(shù)量較少且質(zhì)量有待進一步提高。雖然在表型和分子水平方面對我國現(xiàn)有辣椒資源進行了大量研究，但是遵循科學(xué)方法進行核心種質(zhì)構(gòu)建的研究不多。目前報道的僅有中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所、海南大學(xué)和江西農(nóng)業(yè)大學(xué)基于SSR標(biāo)記利用我國部分辣椒資源構(gòu)建了核心種質(zhì)［4，27，42］。相對于法國和韓國，我國所用種質(zhì)資源主要為C. annuum種，大部分為我國20世紀(jì)80年代收集的地方品種或項目組自有的育種材料，來源地單一，缺乏其他栽培種及野生種的資源材料。同時，所用標(biāo)記仍為第二代的SSR分子標(biāo)記，相對于第三代的SNP標(biāo)記，遺傳信息鑒定的精準(zhǔn)度不足。

（2）構(gòu)建完成的核心種質(zhì)利用率不高。核心種質(zhì)的實質(zhì)是該物種的基因庫，從中挖掘與利用優(yōu)質(zhì)基因（高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲和抗逆基因）是構(gòu)建核心種質(zhì)的重要目標(biāo)之一。利用重測序深度解析核心種質(zhì)的遺傳信息，挖掘優(yōu)異基因是最為高效和精準(zhǔn)的方法。但是由于辣椒基因組過大，重測序成本偏高，很多構(gòu)建完成的核心種質(zhì)無法利用該技術(shù)進行深入研究。大部分科研單位構(gòu)建的核心種質(zhì)處于閑置狀態(tài)，無后續(xù)利用的相關(guān)文獻和報道。

針對以上問題，筆者認為可以從以下幾個方面進行提高和改進：（1）應(yīng)引進和收集其他種的辣椒材料，開發(fā)辣椒野生資源，擴大種質(zhì)資源的遺傳范圍；（2）借鑒國外辣椒核心種質(zhì)研究的經(jīng)驗和成果，加強對外合作交流，進行種質(zhì)材料的引進和技術(shù)交流；（3）國內(nèi)各單位加強合作，集中種質(zhì)資源，建立有針對性的核心種質(zhì)，滿足科研和育種對不同類型資源的需求；（4）以構(gòu)建完成的高質(zhì)量核心種質(zhì)為基礎(chǔ)，加強單位間分工合作，共同開發(fā)利用核心種質(zhì)數(shù)據(jù)，健全資源分發(fā)和數(shù)據(jù)共享體制，減少各單位的重復(fù)工作，減少人力和財力的浪費，以保障種質(zhì)資源利用渠道的暢通。