基于GEO數(shù)據(jù)庫芯片的老年骨骼肌減少癥關(guān)鍵基因篩選與生物信息學(xué)分析

張濤 安云 尹露 陳霄 閆慧新 馬書杰 嚴(yán)雋陶

(1上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437；2上海市第二康復(fù)醫(yī)院)

Screening and bioinformatics analysis of hub genes of sarcopenia based on GEO database chip

ZHANG Tao,AN Yun,YIN Lu,etal.

Yueyang Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200437,China

【Abstract】ObjectiveTo analyze the differential expression of hub genes in sarcopenia by using bioinformatics.MethodsThe microarray data of lateral femoral muscle samples in patients with sarcopenia was downloaded from the data platform of GEO and the differentially expressed genes(DEGs) were screened by using bioinformatics.The DEGs were subjected to gene ontology (GO) enrichment analysis and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) signaling pathway analysis with David online database．The protein-protein interaction (PPI) network was constructed and analyzed using the String11.0 online database. Cytoscape v3.6.1 and its plugin MCODE were used to analyze the central node protein of PPI network and hub genes in the process of sarcopenia were screened out.ResultsThrough analysis of the GSE1428 data set,1 001 DEGs were screened,of which 19 were up-regulated and 982 were down-regulated;these genes were mainly involved in the biological processes such as extrinsic apoptotic signaling pathway in absence of ligand,negative regulation of intrinsic apoptotic signaling pathway,signal transduction,peptidyl-tyrosine phosphorylation,positive regulation of epithelial cell migration,activation of protein kinase B activity.DEGs were found to be mainly concentrated in the pathways in cancer,signaling pathways regulating pluripotency of stem cells,HIF-1 signaling pathways,Rap1 signaling pathways by KEGG pathway analysis.After analyzing the PPI network,SRC,VEGFA,JUN,UBC,CASP3,CYCS,IGF1,KRAS,F2,IL-4 were identified as hub genes.ConclusionsThe selected hub genes may become an important marker for diagnosing sarcopenia or a potential therapeutic target,and provide a new theoretical basis for the pathogenesis of the sarcopenia.

【Keywords】 Sarcopenia;Bioinformatics;Differentially expressed genes;Enrichment analysis;Protein-protein interaction

骨骼肌減少癥(sarcopenia)又稱為肌少癥、骨骼肌衰減征，是一種常見于中老年人的慢性疾病，可增加流行人群跌倒、骨折及住院的風(fēng)險〔1,2〕，嚴(yán)重影響老年人正常的生活活動能力〔3〕，且住院、護(hù)理等費(fèi)用也明顯高于一般人〔4〕。該病的發(fā)病與年齡密切相關(guān)，健康人骨骼肌總質(zhì)量從40～80歲可以下降大約40%，60歲后肌肉功能每年則會下降3%〔5〕。神經(jīng)功能下降、生長激素分泌的改變、炎癥通路激活、胰島素抵抗、慢性疾病、脂肪浸潤和營養(yǎng)不良等引起的肌肉蛋白合成和蛋白水解不平衡是該病的主要病因，相關(guān)的分子通路研究則圍繞細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及線粒體衰退等生物學(xué)過程進(jìn)行〔6,7〕。事實(shí)上，骨骼肌維持、發(fā)育的分子機(jī)制涉及多種信號通路、基因和蛋白質(zhì)之間的相互作用(PPI)，維持肌肉蛋白合成和蛋白水解之間的平衡〔8〕。骨骼肌減少癥發(fā)病和維持發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)有的研究大多圍繞在個體基因研究上，但全局?jǐn)?shù)據(jù)的探索上仍有很多未知。本研究通過生物信息學(xué)分析老、幼骨骼肌之間的差異基因、相關(guān)通路及關(guān)鍵蛋白的PPI，以確定骨骼肌減少癥關(guān)鍵基因、通路和中樞蛋白，進(jìn)一步探究骨骼肌減少癥的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。

1 對象與方法

1.1GEO芯片數(shù)據(jù)來源 以“sarcopenia”作為搜索詞，在美國國立生物中心(NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)搜索已公布的人類骨骼肌減少癥的基因芯片數(shù)據(jù)集。本研究使用GSE1428數(shù)據(jù)集〔9〕，該系列基于GPL96平臺(HG-U133A)Affymetrix Human Genome U133A Array，包括10例年輕受試者(19～25歲)和12例年齡較大受試者(70～80歲)的股外側(cè)肌整體基因表達(dá)譜。

1.2數(shù)據(jù)處理及篩選差異表達(dá)基因 將GSE1428數(shù)據(jù)集中的數(shù)據(jù)分組后使用GEO自帶的GEO 2R分析工具進(jìn)行分析，利用R語言limma〔10〕工具包輸出同時滿足|log2 fold change(log2FC)|>1且P<0.05的差異表達(dá)基因(DEGs)，然后根據(jù)相應(yīng)平臺文件所對應(yīng)的R語言hgu133a.db包將探針名轉(zhuǎn)化為基因名；然后使用heatmap.2工具包繪制熱圖，將每個DEGs的差異表達(dá)情況進(jìn)行直觀展示。

1.3差異基因基因本體(GO)功能富集和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 將獲得的DEGs上傳到 David 在線數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov)進(jìn)行 GO 富集分析及 KEGG 信號通路分析。GO 功能分析從分子功能(MF)、生物學(xué)過程(BP)及細(xì)胞組分(CC)3個部分進(jìn)行富集分析〔11〕。通過 KEGG數(shù)據(jù)庫對差異基因進(jìn)行通路富集分析，了解疾病狀態(tài)下顯著改變的代謝通路。將P<0.05設(shè)定為差異顯著臨界值，分別選取GO富集分析及KEGG信號通路分析中基因富集數(shù)最多的10個功能進(jìn)行分析。

1.4差異基因編碼蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵基因表達(dá)驗(yàn)證 采用STRING在線數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)，將參與GO功能富集和KEGG通路富集的差異基因所編碼的蛋白進(jìn)行PPI分析。并利用Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，以度值前5位的差異基因作為PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因。最后使用Cytoscape軟件中MCODE插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊分析，以MCODE分?jǐn)?shù)>5分作為顯著性模塊的篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出模塊關(guān)鍵基因〔12〕。

2 結(jié) 果

2.1差異基因的篩選 通過R語言3.6.2軟件將原始芯片歸一化處理，利用limma包對骨骼肌減少癥和正常肌肉組織歸一化的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，最終得到1 001個差異基因。其中上調(diào)19個，下調(diào)982個，見圖1。使用R語言中的gplots包繪制差異基因熱圖，見圖2。

2.2差異基因GO分析和KEGG通路分析 DEGs參與的生物學(xué)進(jìn)程主要包括缺乏配體的外在凋亡信號通路、內(nèi)在凋亡信號通路的負(fù)調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、肽基酪氨酸磷酸化、蛋白激酶B活性的激活等；細(xì)胞組分分析顯示DEGs主要參與原生質(zhì)膜的組成、細(xì)胞表面、HFE-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體復(fù)合物、微管相關(guān)復(fù)合物、線粒體小核糖體亞基、細(xì)胞溶質(zhì)等的組成；參與的分子功能主要包括蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)均二聚活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、過氧化物酶體增殖物激活受體結(jié)合、肌動蛋白結(jié)合、生長因子活性、蛋白磷酸酶抑制劑活性等。

進(jìn)行KEGG通路分析后發(fā)現(xiàn)，DEGs主要集中在癌癥通路、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號通路、HIF-1信號通路、碳代謝、Rap1信號通路等，見圖3，圖4。

圖1 骨骼肌減少癥差異表達(dá)基因火山圖

綠色為下調(diào)，紅色為上調(diào)圖2 骨骼肌減少癥最大的前50 個基因熱圖

圓圈的大小表示參與基因的數(shù)量；顏色表示參與該功能的顯著性圖3 骨骼肌減少癥差異基因GO功能分析和顯著參與的KEGG信號通路

圖4 骨骼肌減少癥相關(guān)KEGG通路分析及相應(yīng)基因

2.3差異基因PPI網(wǎng)絡(luò) 將上述篩選出的DEGs上傳到String v11.0在線數(shù)據(jù)庫，轉(zhuǎn)換差異基因編碼PPI網(wǎng)絡(luò)，共包含有711個節(jié)點(diǎn)和2 956條邊。通過Cytoscape v3.6.1軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)；進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，篩選度值(Degree)>20的蛋白分子進(jìn)行互作網(wǎng)絡(luò)分析，共包含64個節(jié)點(diǎn)和385條邊，見圖5。度值前10的hub基因分別為原癌基因，非受體酪氨酸激酶(SRC)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、原癌基因，AP-1轉(zhuǎn)錄因子亞基(JUN)、泛素(UB)C、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(CASP)3、細(xì)胞色素c體細(xì)胞(CYCS)、胰島素樣生長因子(IGF)1、GTPase，原癌基因,GTPase(KRAS)、凝血因子Ⅱ，凝血酶(F2)、白細(xì)胞介素(IL)-4，其相互作用關(guān)系見圖6。使用Cytoscape中MCODE插件對子模塊進(jìn)行分析，可發(fā)現(xiàn)一些在骨骼肌減少癥局部調(diào)控中起重要作用的關(guān)鍵基因，見圖7。

圖5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

圓圈的大小表示該基因的度值；紅色為上調(diào)基因，綠色為下調(diào)基因圖6 骨骼肌減少癥hub基因差異PPI 分析

顏色越深代表度值越大圖7 骨骼肌減少癥差異基因蛋白網(wǎng)絡(luò)的子網(wǎng)絡(luò)分析(包含3個模塊)

3 討 論

骨骼肌減少癥是一種以肌肉質(zhì)量和肌肉功能喪失為特征的年齡相關(guān)性疾病，會使老年人跌倒、功能受限、殘疾和死亡等不良后果的風(fēng)險增加〔13〕。正確理解該病的發(fā)病機(jī)制有助于制定新的診斷和治療策略。本研究通過對微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，識別出老年患者和年輕人骨骼肌之間的差異基因，并通過進(jìn)行GO富集分析和KEGG途徑富集分析揭示DEGs的功能，探索老年人骨骼肌減少癥的相關(guān)基因、蛋白和通路。

通過KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)影響骨骼肌減少癥發(fā)病的相關(guān)基因富集最多的信號通路為癌癥通路，該通路是過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPARs)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、HIF-1、PI3K-Akt-mTOR、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、JAK-STAT等骨骼肌減少癥的發(fā)生相關(guān)信號通路的共同交匯通路，參與骨骼肌細(xì)胞的增殖、應(yīng)激、炎癥、分化、轉(zhuǎn)化、凋亡等多種生物過程。調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號通路也參與了其中某些過程。此外，研究結(jié)果顯示DEGs還在HIF-1信號通路上富集，該通路活性的調(diào)控機(jī)制受到活性氧和氮氧化物等多種因素的影響，在骨骼肌細(xì)胞凋亡和自噬過程中同樣發(fā)揮了重要作用。通過激活調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和糖酵解的基因，HIF-1還可以提高肌細(xì)胞對缺氧的適應(yīng)性，并增強(qiáng)VEGF及其受體的表達(dá)，以應(yīng)對氧供應(yīng)減少〔14〕。研究表明，在暴露于嚴(yán)重的低壓低氧前10 min抑制HIF-1轉(zhuǎn)錄因子，可以減輕骨骼肌損傷〔15〕。Rap1信號通路在多種細(xì)胞類型的細(xì)胞黏附和整聯(lián)蛋白功能中起重要作用，在細(xì)胞間和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的控制中發(fā)揮主導(dǎo)作用〔16〕。調(diào)控MAPK或PI3K-AKT通路活性促進(jìn)細(xì)胞的增殖〔17,18〕，調(diào)節(jié)VEGF誘導(dǎo)的血管生成〔19〕，并參與肌動蛋白細(xì)胞骨架的生成〔20〕。本研究顯示Rap1信號通路相關(guān)基因在骨骼肌減少癥樣本中出現(xiàn)下調(diào)，體現(xiàn)了其對于骨骼肌穩(wěn)態(tài)的積極作用。

通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，研究確定了骨骼肌減少癥中關(guān)鍵基因。研究顯示，SRC激酶在骨骼肌減少癥樣本中下調(diào)。作為第1個被識別并與細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)相關(guān)的酪氨酸激酶，通過參與激活MAPK、PI3K等信號通路促進(jìn)細(xì)胞增殖〔21〕。同時，SRC激酶可以通過抑制糖原合成酶(GSK)-3來發(fā)揮其抗凋亡作用，防止細(xì)胞蛋白質(zhì)的過度分解〔22〕。此外，SRC還參與細(xì)胞黏附生長的信號傳導(dǎo)，促進(jìn)肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)，維持其正常的生理功能〔23〕。KRAS的活化能夠激活一系列下游通路，尤其是RAF/MEK/ERK和PI3K/AKT通路，也可促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖和抑制細(xì)胞凋亡〔24,25〕，KRAS表達(dá)的降低可能是肌肉減少癥的誘發(fā)因素。JUN作為JAK/STAT信號通路成員，負(fù)調(diào)控骨骼肌細(xì)胞的增殖，在骨骼肌減少癥中表達(dá)上調(diào)。有報道證實(shí)了JAK/STAT信號通路在老年人骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞中的激活〔26〕。但也有研究表明，JUNB能夠抑制蛋白質(zhì)的降解，增加JunB表達(dá)可顯著提高肌纖維的橫截面積〔27〕。

盡管肌細(xì)胞的凋亡會引起骨骼肌的氧化損傷和肌纖維的萎縮壞死,但這一生物過程在降解受損炎性細(xì)胞、限制組織損傷、恢復(fù)組織完整性等方面同樣發(fā)揮積極作用。細(xì)胞正常的凋亡過程在骨骼肌的正常發(fā)育、自穩(wěn)平衡方面起非常重要的作用〔28〕，本研究也發(fā)現(xiàn)了一些促進(jìn)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因在骨骼肌減少癥肌肉樣本中表達(dá)下調(diào)。CYCS從線粒體內(nèi)釋放進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)，在ATP作用下激活凋亡蛋白酶活化因子(Apaf)-1，Apaf-1活化后依次激活Caspase-9和Caspase-3，是肌細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期誘因〔29〕，而CYCS基因在本研究中顯示表達(dá)下調(diào)。UBC可以通過酶促反應(yīng)相互連接，進(jìn)而介導(dǎo)靶蛋白降解，泛素化蛋白降解途徑可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔30〕。目前沒有文獻(xiàn)證明泛素蛋白酶體系統(tǒng)對于骨骼肌減少癥的促進(jìn)作用，但UBC可以識別、標(biāo)記并降解錯誤折疊蛋白，減輕細(xì)胞的損害，在應(yīng)對細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)時可發(fā)揮重要作用〔31〕。IL-4可以通過上調(diào)Bcl-2蛋白家族調(diào)控骨骼肌細(xì)胞的自噬和凋亡，在骨骼肌內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用〔32〕。而IL-4表達(dá)的降低可能會使Bcl-2控制細(xì)胞程序性死亡的作用減弱,降低骨骼肌線粒體更新速率及抗氧化水平〔33,34〕。本研究結(jié)果提示，維持細(xì)胞正常凋亡的相關(guān)基因、蛋白表達(dá)減少在骨骼肌減少癥的發(fā)病中有一定促進(jìn)作用。

作為SRC和KRAS的上游調(diào)控因子，VEGFα具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移及增加血管通透性的作用，可維持血管正常的形態(tài)和完整性〔35〕。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF表達(dá)降低是老年毛細(xì)血管稀疏和血管生成減弱的潛在原因，而微循環(huán)是否正常也是影響骨骼肌發(fā)育的重要因素，阻斷VEGF會破壞由超載或剪應(yīng)力引起的骨骼肌血管生成〔36〕。同時，VEGF還可能通過VEGF受體Flk-1和Flt-1作用于肌衛(wèi)星細(xì)胞，刺激肌衛(wèi)星細(xì)胞遷移并抑制肌衛(wèi)星細(xì)胞凋亡，維持骨骼肌的穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)骨骼肌再生〔37〕。因此，在骨骼肌減少癥的研究和治療中，應(yīng)重視微循環(huán)對肌肉可塑性、修復(fù)和再生的作用。結(jié)合之前通路分析，衰老相關(guān)VEGF表達(dá)減少導(dǎo)致血管生成受損的主要原因可能是老年人HIF-1、Rap1活性缺陷〔38〕。

肌肉減少癥的發(fā)展與多種合成代謝激素水平下降有關(guān)，而30歲以后睪丸素的生成速度將會以每年1%的速度減少〔39〕,而這種由衰老而出現(xiàn)生長激素下降也會使IGF-1的表達(dá)降低，最終影響骨骼肌蛋白的合成。IGF-1通過參與IGF1/PI3K/Akt/PKB/mTOR信號通路增強(qiáng)肌肉蛋白質(zhì)合成〔40〕，并負(fù)性調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子FoxO家族以減少蛋白質(zhì)的分解〔41〕。實(shí)驗(yàn)顯示肌肉特異性胰島素和IGF-1受體雙敲除小鼠會出現(xiàn)FoxO誘導(dǎo)的骨骼肌大量減少〔42〕。除此之外，本研究發(fā)現(xiàn)影響骨骼肌減少癥生成的基因還參與了肌動蛋白細(xì)胞骨架通路的調(diào)節(jié)。細(xì)胞骨架蛋白作為骨骼肌細(xì)胞重要的結(jié)構(gòu)，可以連接和錨定肌細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)成分〔43〕。肌動蛋白作為細(xì)胞骨架網(wǎng)中的一員，在骨骼肌減少癥的發(fā)生發(fā)展中有十分重要的作用。關(guān)鍵基因F2通過與細(xì)胞表面F2受體和整合素結(jié)合激活肌動蛋白細(xì)胞骨架通路〔44〕，并與其受體結(jié)合增加了肌動蛋白應(yīng)力纖維的形成，調(diào)節(jié)了肌動蛋白細(xì)胞骨架組織〔45〕。

本研究通過模塊分析還發(fā)現(xiàn)一些新的與骨骼肌減少癥有關(guān)的基因，如中心體蛋白(CEP)290、細(xì)胞分裂周期(CDC)6、G蛋白耦聯(lián)受體(GPR)17、G蛋白亞基(GNB)5、溶血磷脂酸受體(LPAR)2、甲酰基肽受體(FPR)2等，可能作為骨骼肌減少癥潛在診斷和治療的靶點(diǎn)。這些基因在骨骼肌減少癥中研究較少，僅有少量研究證實(shí)CDC6主要參與DNA的復(fù)制，對于維持細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)和細(xì)胞增殖具有重要作用〔46〕。有學(xué)者證實(shí)了CDC6對于肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用〔47〕。

綜上，影響骨骼肌減少癥發(fā)病的某些基因涉及了癌癥通路，可能與癌癥的發(fā)生有密切聯(lián)系。此外，在診斷和治療骨骼肌減少癥時，應(yīng)重視細(xì)胞的正常增殖與凋亡、生長激素水平及局部微循環(huán)對骨骼肌的修復(fù)和再生作用。本研究的局限性在于所選數(shù)據(jù)納入樣本量較少，且未進(jìn)行不同性別的差異基因分析。所篩選出的關(guān)鍵基因是否能成為骨骼肌減少癥潛在的靶點(diǎn)，還需要進(jìn)一步進(jìn)行分子機(jī)制的研究證實(shí)。