下調(diào)miR-572抑制人胃癌細(xì)胞株凋亡、遷移和侵襲機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

郭殿華，程 芃，陳卿奇，程 正(海南西部中心醫(yī)院,海南儋州 571756)

隨著早期診斷和治療技術(shù)的不斷發(fā)展，胃癌相關(guān)的病死率有了大幅下降，但胃癌仍然是全球最常見的癌癥之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸 (miRNAs) 在癌癥的發(fā)生發(fā)展中參與了諸多生理病理過程，包括如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、侵襲等[2]。miRNA是內(nèi)源性非編碼核糖核酸（non-coding ribonucleic acid，RNA），有大約20個堿基，通過轉(zhuǎn)錄后靶向結(jié)合信使RNA（messenger RNA，mRNA）的 3’端非編碼區(qū)（untranslated regions，UTR）發(fā)揮負(fù)向調(diào)控基因表達(dá)的功能[3]。研究表明miR-572是調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、凋亡的重要分子，與多種人類癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，有望成為癌癥治療的潛在靶點(diǎn)和早期診斷的生物標(biāo)記物[4]。第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因 (phosphatase and tensin hmmlogydeleted on ten,PTEN) 是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、代謝、細(xì)胞增殖和細(xì)胞生長等多種生物過程的重要分子，其具有磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸 (phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate，PIP3) 磷酸酶活性，因而可以負(fù)向調(diào)控蛋白激酶B (protein kinase B，Akt)通路[5]。大量研究表明PTEN突變可以誘發(fā)癌變，被認(rèn)為是抑癌基因[6]。但miR-572是否能夠通過PTEN/Akt2信號通路調(diào)控胃癌細(xì)胞的存活及惡變尚不清楚，因此本研究使用胃癌細(xì)胞株探索下調(diào)miR-572對PTEN/Akt2信號通路的影響，以及對胃癌細(xì)胞凋亡、遷移的干預(yù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源 正常胃上皮細(xì)胞系GES-1與胃癌細(xì)胞系HGC-27，AGS，SGC-7901細(xì)胞均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 儀器與試劑 杜氏改良Eagle培養(yǎng)液(DMEM)，胎牛血清，胰蛋白酶（Gibco，美國)；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000，Trizol試劑（Invitrogen，美國）；反轉(zhuǎn)錄qPCR試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；miR-572特異寡核苷酸抑制劑（miR-572 inhibitor）及其陰性對照（上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司）；CCK8檢測試劑盒（日本同仁化學(xué)），細(xì)胞凋亡試劑盒（Invitrogen，美國），TranswelI小室(Corning，美國)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組：用含有10g/dl FBS 的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)GES-1，HGC-27，AGS和SGC-7901細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)80%～90%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書分別轉(zhuǎn)染miR-572 inhibitor或陰性對照，轉(zhuǎn)染6 h后更換為DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 qPCR檢測細(xì)胞中miR-572，PTEN和AKT2的表達(dá)水平：收集GES-1，HGC-27，SGC-7901和AGS細(xì)胞，以及轉(zhuǎn)染后的AGS細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，Nanodrop測定RNA濃度后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性12 s，55℃～65℃退火10 s，共35個循環(huán)。PTEN，AKT2以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct相對定量法計算各個指標(biāo)的相對表達(dá)量。qPCR引物見表1。

表1 qPCR引物

1.3.3 CCK-8法測定細(xì)胞活力：收集miR-572抑制劑組、對照組對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化后接種于96孔板培養(yǎng)，分別于24 h，48 h 和72 h 加入CCK-8試劑。孵育30min后檢測450 nm 處A值。

1.3.4 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力：收集miR-572抑制劑組、對照組細(xì)胞，無血清培養(yǎng)，取100 μl接種于Transwell小室上層，培養(yǎng)24 h 后用結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照并計數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：在Transwell小室上層加入基質(zhì)膠，其余同遷移操作。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡細(xì)胞比例：實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行（FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit with PI，Biolegend公司，美國）。收集miR-572抑制劑組、對照組細(xì)胞，1 000 r/min離心6 min，PBS洗滌2次。每個5ml流式管中加入1×106個細(xì)胞，用預(yù)冷的cell staining buffer洗滌2次，AnnexinV結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，每管細(xì)胞中加入5μl FITC AnnexinV溶液和5μl PI染色溶液，輕輕混合后于室溫暗處孵育15 min。最后加入400μl AnnexinV結(jié)合緩沖液，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 27.0統(tǒng)計分析軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組內(nèi)和組間進(jìn)行兩兩比較時，若滿足正態(tài)分布且方差齊性采用Student’st檢驗(yàn)；若服從正態(tài)分布但方差不齊，則用Welch’st-test；若非正態(tài)分布，則用Mann-WhitneyUtest，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-572，PTEN，AKT2在不同細(xì)胞株中的表達(dá) 見表2。PCR檢測不同細(xì)胞株中miR-572，PTEN，AKT2的表達(dá)量。結(jié)果表明與正常細(xì)胞株GES-1相比，HGC-27，AGS和SGC-7901胃癌細(xì)胞株中的miR-572（t=1.411～44.087）和AKT2（t=1.328～26.911）表達(dá)量均增高，而PTEN的相對表達(dá)量均降低（t=1.504～3.197），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。以AGS細(xì)胞變化最為顯著，因此本研究選取AGS細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 miR-572，PTEN，AKT2在不同細(xì)胞株中的表達(dá)量

2.2 下調(diào)miR-572對胃癌細(xì)胞增殖的影響 CCK8檢測下調(diào)miR-572結(jié)果表明，與對照組相比加入miR-572 抑制劑后，AGS細(xì)胞株的細(xì)胞活力在24 h，48 h，72 h均下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；且細(xì)胞活力隨時間延長逐漸降低（P＜0.05）。而對照組細(xì)胞活力各個時間點(diǎn)無明顯變化。

2.3 下調(diào)miR-572對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響見圖1。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測胃癌細(xì)胞的遷徙與侵襲能力。與對照組相比，miR-572 抑制劑組的遷徙和侵襲能力均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 下調(diào)miR-572對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響（40×）

2.4 下調(diào)miR-572對胃癌細(xì)胞凋亡的影響 見圖2。流式細(xì)胞術(shù)檢測不同組凋亡細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果顯示miR-572 抑制劑組的凋亡細(xì)胞比例均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 下調(diào)miR-572對胃癌細(xì)胞凋亡的影響

2.5 下調(diào)miR-572對PTEN，AKT2表達(dá)的影響PCR檢測不同組miR-572，PTEN和AKT2的表達(dá)量，結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-572抑制劑組 的miR-572（0.51±0.12 vs 1.01±0.09）和AKT2（0.43±0.09 vs 1.01±0.11）的表達(dá)量降低，而PTEN的表達(dá)量升高（3.29±0.14 vs 1.02±0.08），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.21, 6.87, 23.76, 均P＜0.05）。

3 討論

胃癌是世界上最常見和最致命的腫瘤之一[7]。全球每年約超過950 000個新增病例。近年來，隨著腸鏡和外科技術(shù)的發(fā)展，早期胃癌的5年死亡率顯著降低[8]。然而，對于晚期胃癌，5年死亡率仍為30%～50%[9]。胃癌給患者及社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，因此急需從流行病學(xué)、病理學(xué)、分子機(jī)制等方面進(jìn)行深入探索，以尋找新的治療策略。

已經(jīng)有大量文獻(xiàn)報道了miRNA在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用[10]。miRNA是高度保守的非編碼RNA序列，長度通常為18～24個核苷酸[11]。miRNA編碼基因首由RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄為pri-miRNA，后在細(xì)胞核中由Drosha和DGCR8酶加工后剪切為pre-miRNA，最后在細(xì)胞質(zhì)中被加工成為成熟的miRNA[12]。成熟的miRNA與Ago蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNAinduced silencing complex，RISC)，能特異識別靶基因mRNA的5＇UTR，ORF 或 3’UTR區(qū)域以抑制其翻譯或誘導(dǎo)其降解[13]。以往的研究已經(jīng)報道了miR-572在多種腫瘤中的異常表達(dá)，如ZHANG 等[14]發(fā)現(xiàn)miR-572在人卵巢癌細(xì)胞系和癌組織中表達(dá)增加，其可通過靶向細(xì)胞因子信號抑制物（Suppressor of cytokine signaling，SOCS）1和蛋白p21 促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生和進(jìn)展。ZANG等[15]研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中，miR-572的升高可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，并可用來預(yù)測腫瘤細(xì)胞對多西他賽的耐藥性。已有文獻(xiàn)報道，在胃癌中miR-572高表達(dá)，且靶向負(fù)調(diào)控含 WW 域的氧化還原酶(WW Domain-containing Oxidoreductase, WWOX)，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。因此，miR-572可能是一個促癌的分子，并有望成為胃癌治療的靶點(diǎn)，但目前尚缺乏針對miR-572促癌機(jī)制的研究。本研究結(jié)果表明，相比正常胃上皮細(xì)胞，不同的胃癌細(xì)胞株中的miR-572表達(dá)均升高，而下調(diào)miR-572的水平可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。

為進(jìn)一步探究miR-572促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，本研究檢測了PTEN/AKT2信號通路的變化。PTEN 是人類癌癥中最常發(fā)生突變的抑癌基因之一，在體細(xì)胞癌中，如子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、前列腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了PTEN包括一系列失活突變形式，包括錯義和無義突變、基因組位點(diǎn)的單或雙等位基因缺失、啟動子甲基化沉默，或靶向的microRNA高表達(dá)等[17]。PTEN失活通常與PI3K/Akt通路的活躍狀態(tài)相關(guān)，PTEN具有磷酸酶活性，可以使PI3K去磷酸化而負(fù)向調(diào)控Akt通路[18]。另一方面，AKT通路是調(diào)控細(xì)胞存活和增殖的關(guān)鍵，被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中發(fā)生過度表達(dá)或激活，包括胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌[19]。AKT家族包括AKT1，AKT2和AKT3三個成員，其中AKT1和AKT2在人類器官中廣泛表達(dá)，而AKT3主要表達(dá)于腦組織中[20]。此外，AKT2在多種腫瘤，包括胃癌組織中異常表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞的代謝、增殖、存活、轉(zhuǎn)移、血管生成和耐藥性關(guān)系更為密切[21]。本研究的結(jié)果表明，不同胃癌細(xì)胞株的PTEN表達(dá)量下降而AKT2表達(dá)增高，說明抑癌分子受到抑制，而促癌分子激活；下調(diào)miR-572后，抑癌因子PTEN的表達(dá)量得到恢復(fù)，且胃癌細(xì)胞株的侵襲和遷移能力下降，凋亡細(xì)胞比例減少，也佐證了miR-572為促癌分子。以往的研究數(shù)據(jù)表明，miR-572可以與PTEN mRNA的3’UTR區(qū)結(jié)合，從而介導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄后沉默，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)PTEN的水平，這從分子水平解釋了下調(diào)miR-572能夠抑制胃癌進(jìn)展的原因。

綜上，本研究表明下調(diào)miR-572能夠抑制胃癌細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)其發(fā)生凋亡，其作用機(jī)制與PTEN/Akt2通路有關(guān)，為臨床研究提供了細(xì)胞層面的證據(jù)。但胃癌發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，參與的信號通路眾多。因此miR-572促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制需要進(jìn)一步的探索。