AML不同疾病階段患者T細胞耗竭及相關(guān)細胞因子表達水平實驗研究

蕭杏賢，劉 德，姜朝暉（江門市中心醫(yī)院血液內(nèi)科，廣東江門 529000）

骨髓微環(huán)境中存在著促進腫瘤生長而抑制腫瘤免疫應(yīng)答的T細胞亞群，包括調(diào)節(jié)性T細胞（T cell regulatory, Tre）和耗竭性T細胞（T cell exhaustion, Tex）。T細胞耗竭主要是T細胞逐漸喪失功能，表現(xiàn)為高表達免疫位點[程序性細胞死亡1（PD1）、黏液蛋白域3（TIM-3）、淋巴細胞激活基因3（LAG-3）等]對抗原的免疫應(yīng)答能力下降，可導致T細胞遷移、增殖、趨化和細胞殺傷能力下降[1-6]。研究表明，在腫瘤免疫應(yīng)答過程中，抗原特異性T細胞逐漸出現(xiàn)耗竭狀態(tài)，分化為Tex，削弱對腫瘤的免疫監(jiān)視、應(yīng)答及殺傷作用，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1,6]。目前關(guān)于急性髓系白血病患者（acute myeloid leukemia，AML）中Tex水平及預(yù)后研究較少，尤其是AML患者不同疾病階段下Tex的水平變化，而探討AML免疫位點的Tex表達水平有助于了解腫瘤的免疫逃逸機制和尋找精準的免疫治療靶點。本研究擬探討AML不同疾病階段患者的Tex水平及預(yù)后分析，有助于預(yù)測白血病患者的治療療效及預(yù)后，為尋求免疫治療靶點提供重要的臨床證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2017年2月～2020年6月接受治療的AML患者120例，其中男性68例，女性52例，平均年齡32.6±9.4歲；包括急性粒細胞白血病微分化型患者3例，急性粒細胞白血病未分化型患者18例，急性粒細胞白血病部分分化型患者54例，急性早幼粒細胞白血病患者2例，急性粒單核細胞白血病患者20例，急性單核細胞白血病患者23例。AML診斷符合2016年WHO髓系腫瘤和急性白血病診斷標準。根據(jù)疾病不同階段及治療效果分為初診組45例（ND組）、完全緩解組35例（CR組）、未緩解組24例（NR組）和復(fù)發(fā)組16例（HR組）。選擇同期60例體檢健康者為健康對照組（HC組），男性39例，女性21例，平均年齡31.5±8.5歲。AML組與對照組在年齡、性別等一般臨床資料上差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

納入標準：年齡≥18歲，經(jīng)血細胞計數(shù)及骨髓涂片確診為AML患者，1月前未接受相關(guān)治療的患者。

排除標準：并發(fā)嚴重感染、臟器功能不全或并發(fā)其他血液性疾病者；近6個月內(nèi)接受放化療和免疫抑制劑治療者。本項研究通過我院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 BD Accuri C6 Plus型流式細胞 儀（美 國BD公 司），PD-1+，TIM-3+,IL-2+，IFR-γ+，CD4+T,CD8+T抗體（美國BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 耗竭性T細胞流式細胞檢測：收集研究對象的外周血，骨髓穿刺抽取骨髓5～10 ml。分離外周血單個核細胞，加入含有10ml/dl胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。取106個細胞，加入1ml/dl多聚甲醛固定細胞后，離心去上清加入流式緩沖液，置于5 ml流式管中，分別加入PD-1+，TIM-3+,IL-2+，IFR-γ+，CD4+T,CD8+T抗體（購自美國BD公司）孵育30 min，漂洗后于室溫避光下孵育30 min，流式緩沖液漂洗3次，400 g離心5 min，棄上清加入流式緩沖液200μl，在BD Accuri C6 Plus型流式細胞儀進行檢測，記錄各Tex細胞的絕對計數(shù)和百分比。

1.3.2 分組標準：根據(jù)AML患者療效評判標準[5]：初診患者（ND）：初次接受治療的AML患者；完全緩解（CR）：骨髓液顯示原粒細胞≤5%，巨核細胞及紅細胞數(shù)量正常。外周血分類無白血病細胞，血細胞計數(shù)血紅蛋白(Hb)＞100 g/L,中性粒細胞＞1.5×109/L,血小板計數(shù)＞100×109/L；無白血病細胞浸潤的臨床癥狀及體征；未緩解（NR）：AML患者接受治療后骨髓象和外周血象指標及臨床癥狀未見改善；血液學復(fù)發(fā)（HR）：在患者完全獲得緩解后外周血中又出現(xiàn)白血病細胞或髓系原始細胞＞5%。

1.3.3 觀察指標：比較AML患者不同疾病階段（ND，CR，NR，HR）和HC者的外周血和骨髓中不同免疫檢查點Tex表達水平（PD1+TIM-3+T，PD1+T和TIM-3+T）及IL-2和IFN-γ細胞因子分泌情況。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示(±s)，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用Bonferroni法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組間PD1+TIM-3+T細胞水平 見表1。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，AML不同疾病階段患者外周血和骨髓中CD4+PD1+TIM-3+T和CD8+PD1+TIM-3+T水平高于HC組（F=9.149, 6.068, 3.438, 4.807, 均P＜0.001）。CR患者外周血和骨髓中CD4+PD1+TIM-3+T細 胞（t=6.320, 8.841, 37.420; 18.221, 8.216,30.176, 均P＜0.001）和CD8+PD1+TIM-3+T細胞(t=5.417, 6.096, 12.610; 5.201, 6.034, 10.874, 均P＜0.001)水平明顯低于ND，NR和HR患者，差異均有統(tǒng)計學意義。AML患者外周血和骨髓中CD8+PD1+TIM-3+T細胞數(shù)明顯高于CD4+PD1+TIM-3+T細胞數(shù)（t=8.227, 7.289, 均P＜0.001），且ND患者骨髓中CD4+PD1+TIM-3+T和CD8+PD1+TIM-3+T細胞水平明顯高于外周血（t=6.297，7.527，均P＜0.001），差異均有統(tǒng)計學意義。

表1 各組間PDI+TIM-3+T細胞水平比較[(±s)%]

表1 各組間PDI+TIM-3+T細胞水平比較[(±s)%]

項目 n 外周血 骨髓CD4+PDI+TIM-3+T CD8+PDI+TIM-3+T CD4+PDI+TIM-3+T CD8+PDI+TIM-3+T ND 45 2.24±0.43 4.35±1.24 5.38±1.62 8.89±1.86 CR 35 1.45±0.52 3.22±0.70 2.25±1.12 6.64±2.28 NR 24 2.75±0.85 5.21±1.08 5.94±2.19 9.03±2.91 HR 16 7.74±1.06 8.95±1.41 10.39±2.03 12.62±3.74 HC 60 0.48±0.21 0.87±0.35 0.71±0.27 1.15±0.54

2.2 各組間PD1+T細胞水平 見表2。ND患者外周血和骨髓CD4+PD1+T和CD8+PD1+T細胞水平明顯高于HC組（F=13.810, 8.02, 7.541, 10.540, 均P＜0.001）。CR患者外周血和骨髓中CD4+PD1+T細胞（t=4.576, 3.164, 5.625; 5.012, 4.012, 4.783, 均P＜0.001）和CD8+PD1+T細胞（t=5.293，3.091，5.091;6.012, 2.897, 4.907, 均P＜0.001）明顯低于ND, NR和HR患者，差異均有統(tǒng)計學意義。

表2 各組間PDI+T細胞水平比較[(±s)%]

表2 各組間PDI+T細胞水平比較[(±s)%]

項目 n 外周血 骨髓CD4+PDI+TIM-3+T CD8+PDI+TIM-3+T CD4+PDI+T CD4+PDI+TIM-3+T ND 45 33.79±9.52 40.19±8.75 42.49±7.54 46.26±12.25 CR 35 27.99±6.83 31.51±8.24 32.64±7.89 35.24±7.91 NR 24 34.07±6.76 35.24±10.37 39.08±7.84 41.48±12.22 HR 16 38.51±3.85 39.67±5.89 44.54±7.60 47.47±10.55 HC 60 0.48±0.25 6.23±2.38 6.18±2.44 8.11±2.57

2.3 各組間PD1+T細胞產(chǎn)生IL-2和IFN-γ的表達差異 見表3。AML不同疾病階段患者的外周血和骨髓中CD4+PD1+T細胞和CD8+PD1+T細胞產(chǎn)生的IL-2和IFN-γ細胞因子比較，HR患者外周血和骨髓產(chǎn)生IL-2和IFN-γ細胞因子表達水平明顯低于HC組和ND組（F=6.218, 5.925,均P＜0.001），差異有統(tǒng)計學意義。

表3 各組間PD1+T細胞IL-2和IFN-γ的表達[（±s）%]

表3 各組間PD1+T細胞IL-2和IFN-γ的表達[（±s）%]

注：ND vs HR, FND=6.157, 5.868, 4.563, 4.182, 3.979, 5.167, 3.179, 7.192,均P＜0.01; HC vs HR, FHC=7.271, 6.162, 5.178, 4.781, 5.267, 4.892,8.278, 均P＜0.01。

組別 n 外周血IL-2 外周血IFN-γ 骨髓IL-2 骨髓IFN-γ CD4+PD1+T CD8+PD1+T CD4+PD1+T CD8+PD1+T CD4+PD1+T CD8+PD1+T CD4+PD1+T CD8+PD1+T ND 45 27.54±8.54 13.78±4.78 19.58±6.71 28.45±8.95 27.94±10.15 12.56±4.05 22.45±9.45 50.15±14.84 CR 35 27.01±12.12 11.56±6.12 14.45±6.78 27.02±11.65 26.12±11.48 11.26±4.95 20.56±8.54 42.45±12.51 NR 24 25.46±11.45 9.74±4.56 12.54±8.45 26.45±11.41 25.45±11.40 10.26±5.12 20.12±11.36 40.46±17.56 HR 16 19.12±10.21 10.05±5.15 14.10±7.45 24.97±10.45 24.87±12.56 8.72±4.89 19.58±10.47 40.12±16.54 HC 60 28.12±9.87 14.58±6.12 20.45±8.12 29.12±9.02 28.01±9.18 13.01±6.12 23.12±8.49 55.45±16.87

2.4 各組間TIM-3+T細胞水平 見表4。AML患者外周血和骨髓中CD4+TIM-3+T和CD8+TIM-3+T細胞水平明顯高于HC組（F=24.230, 9.101, 16.010,12.540, 均P＜0.001），且CR患者中CD4+TIM-3+T和CD8+TIM-3+T細胞水平明顯低于HR組(t=3.986,4.621,均P＜0.001)，差異均有統(tǒng)計學意義。

表4 各組間TIM-3+T細胞水平比較[(±s)%]

表4 各組間TIM-3+T細胞水平比較[(±s)%]

項目 n外周血 骨髓CD4+TIM-3+T CD8+TIM-3+T CD4+TIM-3+T CD8+TIM-3+T ND 45 28.34±9.14 28.83±8.48 35.75±7.30 38.76±16.55 CR 35 23.08±9.20 24.27±5.78 32.63±11.85 36.16±13.19 NR 24 25.14±5.80 25.46±9.79 34.37±8.07 35.92±10.05 HR 16 33.30±5.81 35.49±6.65 46.18±7.94 48.35±6.77 CH 60 2.64±1.13 6.27±2.38 3.17±1.01 4.56±1.21

2.5 各組間TIM-3+T細胞產(chǎn)生IL-2和IFN-γ的表達差異 見表5。AML不同疾病階段患者的外周血和骨髓中CD4+TIM-3+T細胞和CD8+TIM-3+T細胞產(chǎn)生IL-2和IFN-γ細胞因子比較，HR患者外周血和骨髓產(chǎn)生IL-2和IFN-γ細胞因子表達水平明顯低于HC組和ND組（F=5.841,5.017,均P＜0.001）。

表5 各組間TIM-3+T細胞IL-2和IFN-γ的表達[(±s)%]

表5 各組間TIM-3+T細胞IL-2和IFN-γ的表達[(±s)%]

注：ND vs HR, FND=8.172, 6.892, 5.268, 4.972, 5.175, 6.218, 3.768, 3.826, 均P＜0.01; HC vs HR, FHC=8.361, 7.028, 4.278, 4.279, 5.829, 6.170,4.926, 5.182, 均P＜0.001。

組別 n外周血IL-2 外周血IFN-γ 骨髓IL-2 骨髓IFN-γ CD4+PD1+ CD8+PD1+ CD4+PD1+ CD8+PD1+ CD4+PD1+ CD8+PD1+ CD4+PD1+ CD8+PD1+ND 45 22.15±10.24 14.29±7.15 19.15±7.85 49.87±16.78 24.46±11.21 13.15±4.54 18.58±9.57 54.58±19.25 CR 35 15.12±7.01 10.20±5.68 15.45±6.78 47.05±18.75 20.44±10.75 11.21±6.48 16.28±9.13 52.18±18.47 NR 24 14.46±7.12 7.05±3.18 14.54±8.45 46.45±15.26 20.21±10.32 10.02±5.48 15.22±10.14 50.66±18.44 HR 16 12.86±6.45 7.81±3.26 15.26±7.45 45.23±18.21 19.87±10.24 8.58±4.13 14.59±9.32 50.26±18.38 HC 60 23.26±10.48 15.06±7.64 19.57±8.61 49.12±19.15 25.45±12.14 14.22±7.32 19.40±10.52 55.87±19.22

3 討論

急性髓系白血病（AML）是一種惡性血液腫瘤，治療效果差，生存率低，目前新型免疫治療是治療AML的有效方法[7-8]。T細胞衰竭是機體在腫瘤持續(xù)的抗原刺激下出現(xiàn)的免疫狀態(tài)低下，髓系白血病細胞的共刺激信號能夠促進Th1細胞功能衰竭，通過上調(diào)PD1,TIM-3,LAG-3和CTLA-4等免疫位點，引起相應(yīng)的IL-2,TNF-α和IFR-γ分泌減少，誘導T細胞衰竭[1,9-10]。Tex在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，Tex可削弱機體的免疫，引起腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸反應(yīng)和免疫攻擊，促進腫瘤的生長和增殖。既往研究表明初診AML患者骨髓中CD8+T淋巴細胞功能喪失與AML患者預(yù)后不良相關(guān)，主要與喪失腫瘤表面抗原、誘導T淋巴細胞的耗竭、觸發(fā)免疫逃逸有關(guān)[8,11]。有研究提示白血病患者異基因造血干細胞移植后體內(nèi)的Tex增多，能夠預(yù)測其復(fù)發(fā)風險明顯增多[12]?？梢?，免疫位點的免疫逃逸機制參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。因此，逆轉(zhuǎn)T細胞功能反應(yīng)降低的免疫檢查點可能是治療AML患者有效的靶向免疫治療方法。

AML患者中白血病細胞與抗原呈遞細胞具有共同的細胞表面特征，能夠與Th1細胞相互作用，上調(diào)T細胞的抗原受體T細胞（T cell receptor,TCR），觸發(fā)T細胞增殖和減少細胞因子或趨化因子的分泌而發(fā)揮作用[11]。AML患者中PD1，TIM-3等常見免疫檢查點可抑制免疫應(yīng)答，誘發(fā)T細胞耗竭，導致免疫逃逸發(fā)生，參與該病的發(fā)病過程[13]。目前，多項研究已證實PD1及其他T細胞抑制性通路參與AML疾病進展，其中PD1是CD28受體家族的一個重要的抑制性免疫檢測點，在活化的效應(yīng)性T細胞（Teff細胞）和Tex細胞表面表達，包括PDL1和PDL2兩個配體，在正常免疫反應(yīng)狀態(tài)下，PD1能阻止TCR活化信號通路的傳遞，具有抑制T細胞活化功能,發(fā)揮免疫逃逸作用[14-16]。TIM-3是Tex細胞表面的另一個重要的抑制性通路受體，而腫瘤的發(fā)生發(fā)展與TIM-3的高表達密切相關(guān)[17-20]。

為了檢測AML患者外周血和骨髓中T細胞的免疫檢查點（PD1和TIM-3）的表達情況與AML疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，AML患者中外周血和骨髓中PD1和TIM-3表達明顯增高，與既往研究一致[15,19]，表明PD1和TIM-3的表達上調(diào)與機體免疫功能下降和抗白血病能力下降有關(guān)，能夠促進AML疾病的發(fā)生發(fā)展[15,19-21]。本研究提示骨髓中CD4+PD1+TIM-3+T和CD8+PD1+TIM-3+T細胞表達明顯高于外周血，可能與AML患者骨髓微環(huán)境中存在更多的抑制性免疫因子、T細胞受損嚴重、免疫檢查點的Tex水平表達增加有關(guān)[8,22-23]。在外周血和骨髓中，CD8+PD1+TIM-3+T細胞的表達量明顯高于CD4+PD1+TIM-3+T細胞，提示AML患者疾病發(fā)展過程中CD8+細胞毒性T細胞功能受損更為嚴重。經(jīng)治療后獲得CR的AML患者外周血和骨髓中PD1的表達均下降，能夠有效提高機體的免疫功能，而NR和HR患者的T細胞表面的PD1和TIM-3明顯增加，可能與AML患者治療后出現(xiàn)白血細胞耐藥和治療療效不佳有關(guān)。另外，HR患者外周血和骨髓中PD1+T和TIM-3+T細胞所產(chǎn)生IL-2和IFN-γ細胞因子表達水平明顯低于對照組和ND患者，表明AML復(fù)發(fā)患者免疫功能低下，誘發(fā)T細胞耗竭，細胞因子的分泌減少，能夠促進腫瘤的增殖分化。

綜上所述，本研究通過檢測AML不同疾病階段患者的外周血和骨髓中CD4+PD1+TIM-3+T細胞和CD8+PD1+TIM-3+T細胞表達水平，研究發(fā)現(xiàn)，CR患者外周血和骨髓中CD4+/CD8+PD1+TIM-3+T細胞數(shù)量較ND患者明顯減少，HR患者明顯增多；與外周血標本比較，骨髓T細胞耗竭更為明顯，外周血和骨髓中CD8+PD1+TIM-3+T細胞表達明顯高于CD4+PD1+TIM-3+T；另外，HR患者外周血和骨髓中PD1+T細胞和TIM-3+T細胞所產(chǎn)生IL-2和IFN-γ細胞因子表達水平明顯降低，提示AML復(fù)發(fā)患者存在T細胞耗竭水平明顯增多，分泌的免疫性IL-2和IFN-γ細胞因子減少的現(xiàn)象，參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。因而，在AML治療過程中，動態(tài)監(jiān)測PD1和TIM-3等免疫位點的表達水平變化，能夠預(yù)測AML患者臨床治療療效和疾病進展的預(yù)后判斷。