視網(wǎng)膜母細胞瘤組織中賴氨酸羥化酶2表達及其對瘤細胞遷移和侵襲的影響

章晉偉，曹剛琴，汪 建（愛爾眼科醫(yī)院集團大冶愛爾眼科醫(yī)院，湖北黃石 435000）

視網(wǎng)膜母細胞瘤作為兒童特別是5歲以內(nèi)嬰幼兒最常見的惡性程度較高的眼內(nèi)腫瘤，不僅影響患兒視力和生活質(zhì)量，而且給患兒生命安全帶來了嚴重威脅[1]。近年來，隨著臨床診療手段的不斷進展，在保留患兒眼球及提高生存率方面取得了一定效果，但仍有一部分患兒治療失敗[2]。有研究指出[3]，腫瘤細胞高侵襲、轉(zhuǎn)移性是導致視網(wǎng)膜母細胞瘤患兒治療失敗及導致死亡的重要原因。前膠原賴氨酸-2-酮戊二酸-5-雙加氧酶2（procollagen-lysine 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2，PLOD2）是PLOD家族成員之一，參與了膠原纖維交聯(lián)及重構(gòu)[4]，而膠原纖維重構(gòu)與腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移密切相關[5]，研究表明[6-7]，PLOD2在食管癌、喉癌組織中高表達，且與腫瘤轉(zhuǎn)移及患者預后有關。本研究通過檢測PLOD2蛋白在視網(wǎng)膜母細胞瘤組織中表達比較不同病理指標的差異性，并觀察下調(diào)Y79細胞中PLOD2表達對細胞遷移和侵襲力的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象 來源于湖北省黃石市大冶愛爾眼科醫(yī)院和中國人民解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院2011年3月～2019年3月間行眼球摘除手術(shù)治療的患兒73例，其中男童45例，女童28例，年齡6個月～12歲，中位年齡4.1歲，發(fā)病側(cè)：左側(cè)38例，右側(cè)35例；分化程度：低-未分化33例；中-高分化40例；按照國際視網(wǎng)膜母細胞瘤分期標準（IIRC）：D期30例，E期43例；發(fā)生脈絡膜浸潤26例；發(fā)生視神經(jīng)浸潤38例。納入標準：①均為單眼；②術(shù)前未接受放化療治療；③術(shù)后病理確診為視網(wǎng)膜母細胞瘤；④臨床資料完整。同期，收集32例因外傷行手術(shù)治療患兒的正常視網(wǎng)膜組織作為對照組，其中，男童19例，女童13例，年齡8個月～14歲，中位年齡4.7歲。兩組患兒在性別、年齡均衡可比。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，所有患兒家屬均知情同意。

1.2 儀器與試劑 兔抗人PLOD2多克隆抗體（美國CST公司），免疫組織化學試劑盒和配套試劑（武漢博士德生物工程有限公司），Y79細胞（美國ATCC公司），胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)液、青霉素和鏈霉素（美國Gibco公司），胰蛋白酶（上海甘源實業(yè)有限公司），PLOD2和內(nèi)參引物由上海生工生物公司設計合成，Trizol總RNA提取試劑（上海酶聯(lián)生物公司），Lipofectamine 2000試劑（美國Invitrogen公司），PLOD2干擾及陰性對照序列均由上海吉瑪公司設計合成，逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒（大連寶生物公司），Transwell小室（美國Corning公司），基質(zhì)膠（美國BD公司），兔抗人E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）和N-鈣黏蛋白（N-cadherin，N-cad）多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），CX41生物顯微鏡（日本Olympus公司），LightCycler 96實時熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司），凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學法檢測組織中PLOD2蛋白表達：按照試劑盒說明，組織石蠟標本經(jīng)切片、烤片、脫蠟、脫水、滅活內(nèi)源性過氧化物酶。10g/dl山羊血清封閉，加入1:400稀釋的一抗兔抗人PLOD2多克隆抗體，室溫孵育60min，滴加二抗，37℃孵育30min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片、觀察，用PBS替代一抗作為陰性對照。結(jié)果判定[8]：PLOD2蛋白主要表達于細胞質(zhì)中，①根據(jù)染色：無著色0分，淡黃1分，棕黃2分，黃褐3分；②按陽性細胞比：＜5% 0分，5%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分和＞75% 4分；按①×②總分，≤4分（-），＞4分（+）。

1.3.2 細胞培養(yǎng)和處理：Y79細胞置于含10g/dl胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：5ml/dl CO2，37℃培養(yǎng)箱，胰酶消化、傳代，將對數(shù)生長期細胞消化后接種于6孔板，1×106個/孔，常規(guī)培養(yǎng)24h，將細胞分為PLOD2干擾組（I組）、陰性對照組（NC組）和空白組（B組），按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑操作說明分別轉(zhuǎn)染PLOD2干擾序列、陰性對照序列和不作任何處理。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h進行后續(xù)實驗。

1.3.3 RT-qPCR檢測PLOD2 mRNA表達：取細胞，按Trizol法提取總RNA，并檢測純度及濃度。對總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-qPCR檢測細胞中PLOD2 mRNA表達量。引物：PLOD2：上游：5’-GA CAGCGTTCTCTTCGTCCTCA-3’，下游：5’-CTCCA GCCTTTCGTGGTGACT-3’；GAPDH：上 游：5’-TC AGCAATGCCTCCTGCAC-3’，下游：5’-TCTGGGTG GCAGTGATGGC-3’。條件：96℃ 2min，95℃ 30s，58℃ 30s，73℃ 30s，循環(huán)38次。用2-△△Ct法計算細胞中PLOD2 mRNA表達量。

1.3.4 細胞遷移實驗：取各組細胞，離心取沉淀，用無血清培養(yǎng)液按2×106/ml重懸。小室上室中加入100μl 懸液，同時取含10ml/dl胎牛血清的培養(yǎng)液600μl加入下室，常規(guī)培養(yǎng)24h，將小室取出，4g/dl多聚甲醛固定，1g/dl結(jié)晶紫作用15min，自然干燥，鏡下觀察。重復實驗3次。

1.3.5 細胞侵襲實驗：用培養(yǎng)液稀釋基質(zhì)膠，涂抹在小室上室，風干使用。其余步驟同1.3.4。

1.3.6 Western blot法檢測PLOD2，E-cad和N-cad蛋白表達：取各組細胞，加入細胞裂解液，提取總蛋白，并用BCA法檢測濃度。取總蛋白30μg，行SDS-聚丙烯酰胺電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5g/dl脫脂奶粉封閉120min，4℃下加入目標抗體[兔抗人PLOD2，E-cad和N-cad多克隆抗體（稀釋比例1:500，1:1 000和1:800）]，過夜孵育，用TBST沖洗3次，室溫下加入二抗，孵育120min。避光加入ECL液，顯影后拍照，利用Quantity One軟件對條帶進行分析，計算目標蛋白相對于內(nèi)參蛋白的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學分析 將研究結(jié)果數(shù)據(jù)納入SPSS 13.0統(tǒng)計軟件中，計數(shù)資料采用百分率（%）表示，使用χ2檢驗；計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，使用方差分析進行組間比較，經(jīng)t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜母細胞瘤和對照組組織中PLOD2蛋白表達 見圖1。與對照組比較，PLOD2蛋白在視網(wǎng)膜母細胞瘤組織中陽性表達率明顯升高（75.34%vs 25.00%）， 差異有統(tǒng)計學意義（χ2=23.493，P＜0.001）。

圖1 免疫組織化學法檢測PLOD2蛋白在視網(wǎng)膜母細胞瘤和對照組組織中的表達（SP×200）

2.2 不同臨床病理指標間PLOD2蛋白表達差異 見表1。不同性別、年齡、發(fā)病側(cè)和分化程度的視網(wǎng)膜母細胞瘤患者組織中PLOD2蛋白陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與IIRC分期D期、未發(fā)生脈絡膜浸潤和未發(fā)生視神經(jīng)浸潤比較，IIRC分期E期、發(fā)生脈絡膜浸潤和發(fā)生視神經(jīng)浸潤的視網(wǎng)膜母細胞瘤患者組織中PLOD2蛋白陽性表達率明顯升高，以上差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

表1 PLOD2蛋白在不同臨床病理指標間的表達差異[n，(%)]

2.3 三組細胞中PLOD2 mRNA表達量 與NC組和B組比較，PLOD2 mRNA在I組細胞中相對表達量明顯降低（0.27±0.09 vs 1.01±0.08， 1.00±0.05），組間差異有統(tǒng)計學意義（F=183.919，P＜0.001）。NC組與B組PLOD2mRNA相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.392,P=0.704）。

2.4 下調(diào)PLOD2表達抑制細胞遷移力和侵襲力見表2和圖2。與NC組和B組比較，I組下調(diào)PLOD2表達后細胞遷移能力和侵襲能力均顯著降低（均P＜0.05）。I組與B組比較遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)(t=3.849, 7.415)，I組與NC組比較遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)（t=4.041, 5.225）差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。NC組與B組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.469, 0.939,P=0.649, 0.370）。

圖2 各組細胞遷移能力（A：I組，B：NC組，C：B組，結(jié)晶紫×100）

表2 三組細胞遷移和侵襲能力比較（±s，個）

表2 三組細胞遷移和侵襲能力比較（±s，個）

項 目 I組 NC組 B組 F P遷移細胞數(shù) 108.17±7.52 124.67±6.59 126.83±9.20 10.163 0.002侵襲細胞數(shù) 88.17±6.1 111.50±9.05 115.83±6.77 24.094 ＜ 0.001

2.5 下調(diào)PLOD2表達抑制細胞EMT的形成 見表3和圖3。與NC組和B組比較，下調(diào)PLOD2表達后N-cad蛋白相對表達量明顯降低，而E-cad蛋白相對表達量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。I組與B組PLOD2，E-cad蛋白，N-cad蛋白相對表達量比較（t=16.028, 9.558, 9.363），I組與NC組PLOD2，E-cad蛋白，N-cad蛋白相對表達量比較（t=19.220, 8.977, 6.756），差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。NC組與B組比較，PLOD2，E-cad蛋白，N-cad蛋白相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（t=0.806, 0.900, 0.833,P=0.439, 0.389,0.425）。提示PLOD2促進細胞EMT形成。

圖3 各組細胞侵襲能力（A：I組，B：NC組，C：B組，結(jié)晶紫×100）

表3 3組細胞中PLOD2，E-cad和N-cad蛋白表達比較（±s,個）

表3 3組細胞中PLOD2，E-cad和N-cad蛋白表達比較（±s,個）

項 目 I組 NC組 B組 F P PLOD2蛋白 0.23±0.05 0.78±0.05 0.81±0.07 189.573 ＜0.001 E-cad蛋白 0.78±0.11 0.28±0.08 0.23±0.09 62.122 ＜0.001 N-cad蛋白 0.38±0.08 0.81±0.14 0.87±0.10 36.641 ＜0.001

圖3 各組細胞中PLOD2，E-cad和N-cad蛋白表達

3 討論

視網(wǎng)膜母細胞瘤作為嬰幼兒最常見且致盲率、致死率較高的眼內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，近年來發(fā)病率呈上升趨勢[9]，給嬰幼兒生命安全構(gòu)成嚴重威脅。有研究指出[10]，視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移是導致患兒死亡的主要危險因素。研究表明[11]，腫瘤微環(huán)境特別是細胞外基質(zhì)在腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用舉足輕重。有研究指出[12]，膠原纖維作為細胞外基質(zhì)主要成分，其發(fā)生增多、重構(gòu)及硬度增加會加速腫瘤細胞快速運動。PLOD家族包括PLOD1，PLOD2和PLOD3，在促進膠原成熟及分泌中發(fā)揮重要作用[13]，其中，PLOD2受缺氧誘導因子1調(diào)節(jié)，可特異性調(diào)控膠原纖維交聯(lián)模式，在膠原纖維交聯(lián)、排列、重構(gòu)中發(fā)揮關鍵性作用[14]。有研究指出[15]，PLOD2是晚期胃癌腹膜擴散的潛在調(diào)節(jié)劑。亦有研究指出[16]，PLOD2在食管癌組織中表達升高，且與腫瘤轉(zhuǎn)移相關。李丹等[17]指出，PLOD mRNA在肺腺癌組織中表達升高，與預后關系密切。本研究顯示，PLOD2蛋白在視網(wǎng)膜母細胞瘤組織中陽性表達率高于癌旁組織，說明視網(wǎng)膜母細胞瘤組織中PLOD2蛋白呈高表達。同時，對不同病理特征患兒組織中PLOD2蛋白表達情況比較發(fā)現(xiàn)，IIRC分期E期、發(fā)生脈絡膜浸潤和視神經(jīng)浸潤患兒組織中陽性表達率升高，說明PLOD2蛋白可能與腫瘤惡性化進程有關，參與了腫瘤進展及脈絡膜和視神經(jīng)浸潤過程。

有研究指出[15]，PLOD2可促進胃癌細胞侵襲和遷移，導致胃癌的腹膜擴散。亦有研究指出[18]，PLOD2可調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細胞的遷移和侵襲。本研究通過轉(zhuǎn)染PLOD2干擾物的方法下調(diào)Y79細胞中PLOD2基因表達，RT-qPCR和Western blot實驗結(jié)果均提示成功下調(diào)細胞中PLOD2表達。本研究Transwell實驗示，下調(diào)PLOD2可顯著抑制細胞遷移和侵襲。NAGARAJA等[19]指出，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤細胞遷移和侵襲密切相關。而KIYOZUMI等[15]亦指出，PLOD2是膽管癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關鍵調(diào)節(jié)劑。本研究結(jié)果顯示，抑制PLOD2基因表達后，細胞中與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中上皮性標志物E-cad蛋白表達量升高，而間質(zhì)標志物N-cad蛋白表達量降低，表明PLOD2表達被抑制后可抑制細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，從而使細胞遷移和侵襲能力被抑制。

綜上所述，PLOD2蛋白在視網(wǎng)膜母細胞瘤組織中高表達，可能通過促進EMT形成而促進癌細胞的遷移和侵襲能力，但其可能的機制尚待開展相關研究予以明確。