食管鱗狀細(xì)胞癌組織PTOV1，IGBP1的表達(dá)與臨床病理特征和預(yù)后相關(guān)性研究

徐 超，徐 珊，竇 燕，閆玲新，孔曉明，郭改莉（邯鄲市中心醫(yī)院消化科，河北邯鄲 056001）

食管癌是臨床上常見的惡性腫瘤，據(jù)有關(guān)調(diào)查統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2018年全球食管癌的新發(fā)病例數(shù)為57.20萬人，死亡人數(shù)50.90萬例，嚴(yán)重危害人們的健康[1]。近年來，隨著治療技術(shù)的不斷發(fā)展，大量的食管癌患者均可得到有效的治療，但由于食管癌早期臨床癥狀隱匿，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，患者預(yù)后普遍較差[2]。因此，尋找食管癌早期診斷及預(yù)后判斷的標(biāo)志物對于提高患者生存率具有重要意義。前列腺腫瘤過表達(dá)蛋白1(prostate tumor overexpressed 1, PTOV1)是一種保守的銜接蛋白，最初在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的作用[3]。目前已有研究報道，在宮頸癌[4]、卵巢癌[5]、前列腺癌[6]中存在PTOV1高表達(dá)。免疫球蛋白結(jié)合蛋白1(immunoglobulin binding protein，IGBP1)是一種在多種組織中廣泛存在的蛋白，具有抗凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用，鱗狀細(xì)胞癌是食管癌的主要類型，占食管癌的90%以上，食管癌的發(fā)生與細(xì)胞有絲分裂異常、增殖和凋亡失衡等有密切關(guān)系[7]。PTOV1和IGBP1在食管癌的發(fā)生發(fā)展中可能起到重要的作用，但目前國內(nèi)對于食管鱗狀細(xì)胞癌組織中PTOV1，IGBP1表達(dá)情況及與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系尚未見報道。鑒于此，本研究探討食管鱗狀細(xì)胞癌組織PTOV1，IGBP1的表達(dá)及與臨床病理特征和預(yù)后不良的關(guān)系，旨在為食管鱗狀細(xì)胞癌的臨床診治提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2013年6月～2015年11月期間邯鄲市中心醫(yī)院收治的食管鱗狀細(xì)胞癌患者70例，其中男性45例、女性25例，年齡40～79（59.82±7.69）歲；腫瘤大?。骸?cm 28例、＞2cm 42例；組織學(xué)分級：低分化38例、中分化22例、高分化10例；TNM分期：Ⅰ期12例、Ⅱ期26例、Ⅲ期32例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均符合《病理學(xué)》中的食管鱗狀細(xì)胞癌的有關(guān)規(guī)定[8]，經(jīng)腹、右胸兩切口食管鱗狀細(xì)胞癌切除手術(shù)治療，術(shù)后經(jīng)病理確診為食管鱗狀細(xì)胞癌；②患者初次發(fā)病，具有腫瘤組織及對應(yīng)癌旁組織（距離腫瘤邊緣＞3cm），病歷資料完整；③患者術(shù)前未經(jīng)放療、化療及免疫治療；④患者及其家屬對研究知情同意且簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①治療時并發(fā)其他系統(tǒng)腫瘤者；②病情嚴(yán)重，預(yù)計生存期＜6個月者；③并發(fā)免疫系統(tǒng)疾病及血液系統(tǒng)疾病者。本研究經(jīng)過邯鄲市中心醫(yī)院倫理學(xué)委員會審查同意。

1.2 儀器與試劑 兔抗人PTOV1單克隆抗體（上海邦景實業(yè)有限公司），兔抗人IGBP1單克隆抗體（上海澤葉生物科技有限公司），DAB顯色液（武漢純度生物科技有限公司），免疫組化染色試劑盒（武漢純度生物科技有限公司），IXplore Pro倒置顯微鏡（日本Olympus）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)SP法：將手術(shù)切除的癌組織、癌旁組織經(jīng)10g/dl中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，制成4μm連續(xù)切片。經(jīng)過梯度乙醇水化，3g/dl H2O2消化內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗后高溫高壓抗原修復(fù)，加入山羊血清封閉抗原，并加入兔抗人PTOV1單克隆抗體、兔抗人IGBP1單克隆抗體，飽和濕度過夜，加入生物學(xué)二抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，返藍(lán)，梯度乙醇脫水，透明，樹膠封片。

1.3.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定：采用免疫組織化學(xué)半定量判定標(biāo)準(zhǔn)：①標(biāo)本染色評分：以PBS代替生物學(xué)一抗作陰性對照，用試劑盒配套陽性樣本作為陽性對照。無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；②陽性細(xì)胞比例評分：陽性細(xì)胞比例≤10% 1分；陽性細(xì)胞比例11%～50% 2分；陽性細(xì)胞比例51%～75% 3分；陽性細(xì)胞比例＞75% 4分。將兩項積分乘積得總積分：0～3分為（－），4～5分為（+），6～7分為（++），8分以上為（+++）。+～+++判定為陽性[9]。

1.3.3 隨訪：所有患者出院后通過門診復(fù)查或電話隨訪，隨訪5年，隨訪截止時間為2020年11月，患者生存時間為就診日期至隨訪截止日期或死亡日期，記錄患者生存情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較實施卡方檢驗。應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，實施Log-rank檢驗。應(yīng)用COX比例風(fēng)險回歸模型分析食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后不良的危險因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁組織中PTOV1，IGBP1蛋白表達(dá)情況 見表1。食管鱗狀細(xì)胞癌組織PTOV1，IGBP1蛋白陽性率顯著高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 食管鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁組織中PTOV1，IGBP1蛋白表達(dá)情況 [n=70，n(%)]

2.2 PTOV1，IGBP1蛋白與食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系 見表2。不同年齡、性別、腫瘤大小食管鱗狀細(xì)胞癌組織中PTOV1蛋白陽性率、IGBP1蛋白陽性率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。組織學(xué)低分化，TNM分期Ⅲ期食管鱗狀細(xì)胞癌組織PTOV1蛋白陽性率、IGBP1蛋白陽性率均顯著高于組織學(xué)中高分化，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期食管鱗狀細(xì)胞癌組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表2 PTOV1，IGBP1蛋白與食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 不同 PTOV1，IGBP1蛋白表達(dá)情況食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后情況 見圖1。截至2020年11月，共有66例患者完成隨訪，失訪4例，失訪率5.71%；患者存活36例，死亡30例。繪制生存曲線結(jié)果顯示，PTOV1蛋白陽性表達(dá)患者5年生存率低于PTOV1蛋白陰性表達(dá)患者，IGBP1蛋白陽性表達(dá)患者5年生存率低于IGBP1蛋白陰性表達(dá)患 者（Log-rankχ2=8.122, 6.987,P=0.002, 0.007）。

圖1 不同PTOV1，IGBP1蛋白表達(dá)情況食管鱗狀細(xì)胞癌患者生存曲線

2.4 食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后不良影響因素的COX比例風(fēng)險回歸模型分析 見表3。建立COX比例風(fēng)險回歸模型，結(jié)果顯示組織學(xué)低分化、TNM分期Ⅲ期、PTOV1蛋白陽性、IGBP1蛋白陽性是食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后不良的危險因素（P＜0.05）。

表3 食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后不良影響因素的COX比例風(fēng)險回歸模型分析

3 討論

我國是食管癌的高發(fā)國家，每年因食管癌死亡的患者約為37萬例，占全球的一半以上[10]。食管癌的發(fā)病具有很強(qiáng)的地域分布特征，我國以河北、河南、山西等地為食管癌高發(fā)地區(qū)[11]。近年來，盡管食管癌的治療技術(shù)不斷的發(fā)展，使得大量的食管癌患者得到了有效救治，但患者的臨床預(yù)后并未得到根本性的改善，其主要原因在于食管癌具有較強(qiáng)的侵襲性，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，早期發(fā)病隱匿，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，預(yù)后通常較差[12-13]。目前，對于食管癌的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，相關(guān)研究表明，食管癌的發(fā)生是基于基因水平表達(dá)異常并引起細(xì)胞增殖、分化異常所致[14]。研究食管癌相關(guān)分子表達(dá)及與臨床病理特征和預(yù)后不良的關(guān)系對于指導(dǎo)治療、提高患者預(yù)后具有重要意義。

PTOV1基因位于染色體19q13.3，可以分別編碼一個由416個氨基酸組成的蛋白及一個由374個氨基酸組成的蛋白[15]。研究表明，PTOV1啟動子區(qū)域有轉(zhuǎn)錄因子SP1和SP2結(jié)合的保守區(qū)域及雄性激素反應(yīng)原件[16]。CUI等[17]報道，在乳腺癌中PTOV1可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路引起乳腺細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變，促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。SANTAMARíA 等[18]報道，PTOV1可以作用于脂茷蛋白flotillin-1，影響細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂。YANG等[19]報道，PTOV1可以抑制Notch信號通路下游多個靶基因，促進(jìn)細(xì)胞癌變。IGBP1是一種參與細(xì)胞分化的調(diào)控蛋白[20]。以往有報道顯示，IGBP1能與蛋白磷酸酶A2相結(jié)合，起到抗凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用，通過miR-3941抑制IGBP1表達(dá)后可以降低肺腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞凋亡[21]。LncRNA-IGBP1-AS1可以通過下調(diào)IGBP1，降低乳腺癌的增殖和侵襲能力，提示IGBP1可以促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展[22]。

我們通過對食管鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁組織PTOV1，IGBP1蛋白表達(dá)進(jìn)行了比較，分析發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細(xì)胞癌存在PTOV1，IGBP1蛋白的異常高表達(dá)，提示PTOV1，IGBP1蛋白表達(dá)升高可能促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)PTOV1，IGBP1蛋白表達(dá)可能與食管鱗狀細(xì)胞癌患者組織分化程度、TNM分期有密切關(guān)系。目前尚無PTOV1，IGBP1蛋白與食管鱗狀細(xì)胞癌的相關(guān)報道。黃麗斯等[23]報道，在子宮內(nèi)膜癌中PTOV1與患者組織分化程度、子宮內(nèi)膜癌浸潤密切相關(guān)。結(jié)合之前的文獻(xiàn)研究報道，筆者推測PTOV1可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展；PTOV1可能與flotillin-1相互作用，促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌變；PTOV1可能通過抑制Notch信號通路，促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生和發(fā)展；IGBP1可能與蛋白磷酸酶A2相結(jié)合，抑制凋亡，促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖。

本研究對患者進(jìn)行了5年隨訪結(jié)果顯示，PTOV1蛋白陰性表達(dá)，IGBP1蛋白陰性表達(dá)患者生存情況較好。分析其原因可能與PTOV1，IGBP1蛋白陽性表達(dá)患者組織學(xué)分化低、腫瘤惡性程度更高、可能存在淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。而組織學(xué)低分化、TNM分期Ⅲ期、PTOV1蛋白陽性、IGBP1蛋白陽性是食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后不良的危險因素。提示檢測PTOV1，IGBP1蛋白表達(dá)情況可以為食管鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后判斷提供依據(jù)，或許可以為食管鱗狀細(xì)胞癌新藥開發(fā)提供新的研究方向。但本研究也存在樣本量較少，僅通過對病例的病理標(biāo)本研究，未涉及到細(xì)胞和信號通路的研究等不足，研究仍有待于今后進(jìn)一步優(yōu)化及豐富。

綜上所述，食管鱗狀細(xì)胞癌組織中存在PTOV1，IGBP1蛋白異常高表達(dá)，兩者與食管鱗狀細(xì)胞癌的組織分化程度、TNM分期及預(yù)后有一定關(guān)系，組織學(xué)低分化、TNM分期Ⅲ期、PTOV1蛋白陽性、IGBP1蛋白陽性是食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后不良的危險因素，可能為食管鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后判斷提供依據(jù)。