糖尿病腎病患者血清miR-188-5p及miR-379-5p的表達(dá)及其臨床意義

周仕群，王 聰，江 強，陳岳堯，符妹麗（儋州市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，海南儋州 571179）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是2型糖尿病患者常見的微血管并發(fā)癥，也是引起終末期腎病及糖尿病患者死亡的主要原因之一[1]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類新型的調(diào)控人體基因組學(xué)的小分子RNA，其異常表達(dá)與炎癥反應(yīng)、糖脂代謝紊亂等密切相關(guān)，可能參與DN的發(fā)生發(fā)展[2-3]。有研究認(rèn)為，miR-188-5p及miR-379-5p在DN患者中存在異常表達(dá)，其通過調(diào)控多種信號通路參與DN的發(fā)生發(fā)展，可能為DN的早期診斷及靶向治療提供新的視野[4-5]。本研究通過檢測2型糖尿病患者血清miR-188-5p及miR-379-5p表達(dá)水平，分析其與DN發(fā)生的相關(guān)危險因素及其診斷DN的價值，旨在為DN的診療提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2018年1月～2020年12月儋州市人民醫(yī)院收治的2型糖尿病患者162例，其中男性95例，女性67例，年齡38～85（56.37±11.40）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合中國2型糖尿病防治指南（2017年版）中2型糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②知情同意參與本次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)自身免疫性疾病、惡性腫瘤、泌尿系統(tǒng)感染及其他腎臟疾病者；②服用影響尿清蛋白排泄及腎功能的藥物。根據(jù)尿清蛋白/尿肌酐(urinary albumin /creatinine, UACR)比值，將162例2型糖尿病患者分為單純2型糖尿病組（正常清蛋白尿）54例（UACR＜30mg/g）和108例DN組（UACR≥30mg/g）；108例DN患者分為微量清蛋白尿組50例（UACR 30～300mg/g）和大量清蛋白尿組58例（UACR＞300mg/g）。另選取健康體檢正常者50例作為對照組，其中男性30例，女性20例，年齡40～83(58.15±8.72)歲。

1.2 儀器與試劑 7500型熒光定量PCR儀（ABI公 司），PCR試 劑 盒，RNeasy試 劑 盒，miRNA Easy試劑盒和Trizol試劑盒由上海生物工程有限公司提供。日立7600型全自動生化儀及配套試劑。

1.3 方法

1.3.1 miR-188-5p及miR-379-5p檢測：所有患者均于確診當(dāng)日采集靜脈血5 ml并離心分離血清，在ABI 7500型熒光定量PCR儀上檢測miR-188-5p及miR-379-5p。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系15μl（5μl RNA模板，3μl U6及miRNA特異性莖環(huán)引物，0.15μl 100mmol/L脫氧核糖核苷酸，1.00μl逆轉(zhuǎn)錄酶，1.50μl10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.19μl RNase抑制劑，4.16μl雙蒸水）。PCR總反應(yīng)體系為20μl：1μl引物及探針Mix（20×），10μl TaqMan通用混合物溶液（2×），1.33 μl反向轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸，7.67μl雙蒸餾水。采用2-△Ct法計算miR-188-5p及miR-379-5p水平。

1.3.2 生化指標(biāo)檢測: 使用日立7600型全自動生化儀及配套試劑檢測尿微量清蛋白（mALB）、空腹血糖（FBG）、糖化血紅蛋白（HbAlc）、血肌酐（sCr）和尿素氮（BUN）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；兩組比較采用t檢驗。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。應(yīng)用多因素Logistic回歸分析影響DN發(fā)生的危險因素。繪制受試者工作特征（ROC）曲線分析miR-188-5p，miR-379-5p及mALB水平診斷DN的價值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組臨床一般資料比較 見表1。DN組和2型糖尿病組HbAlc及FBG水平與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.815, 8.214; 6.217, 7.983, 均P＜0.05）。DN組 病 程、sCr，BUN，UACR及mALB均明顯高于2型糖尿病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.782, 5.260, 5.184, 13.548, 12.163, 均P＜0.05）。

表1 各組臨床一般資料比較[（±s），n（%）]

表1 各組臨床一般資料比較[（±s），n（%）]

項目 對照組（n=50） 2型糖尿病組（n=54） DN組（n=108） χ2/F值 P值男性 30（60.0） 29（53.7） 66（61.1） 0.619 0.447年齡（歲） 58.15±8.72 55.48±10.96 57.10±12.35 1.904 0.195病程（年） - 7.80±4.18 11.75±6.30 7.151 0.000體質(zhì)指數(shù)(kg/m2) 23.82±2.54 24.15±2.73 24.53±2.81 0.602 0.593 HbAlc(%) 4.58±0.83 8.16±1.65 8.75±1.84 9.973 0.000 FBG(mmol/L) 5.06±0.58 9.17±2.72 10.05±3.26 8.417 0.000 sCr (μmol/L) 69.20±11.37 72.14±12.90 145.81±55.37 7.105 0.000 BUN(mmol/L) 5.24±1.13 5.68±1.25 9.22±3.46 6.528 0.000 UACR（mg/g） - 16.38±5.92 483.25±106.37 18.850 0.000 mALB (mg/L) 7.52±2.46 8.63±3.05 147.62±51.30 16.712 0.000

2.2 DN組、2型糖尿病組和對照組血清miR-188-5p及miR-379-5p水平比較 見表2。DN組血清miR-188-5p及miR-379-5p水平均明顯低于2型糖尿病組和對照組（t=10.316, 14.517; 13.805, 16.218,均P＜0.05），且2型糖尿病組血清miR-188-5p及miR-379-5p水平均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.425, 10.738，均P＜0.05）。

表2 DN組、2型糖尿病組和對照組血清miR-188-5p及miR-379-5p水平比較（±s）

表2 DN組、2型糖尿病組和對照組血清miR-188-5p及miR-379-5p水平比較（±s）

項目 對照組（n=50） 2型糖尿病組（n=54） DN組（n=108） F值 P值miR-188-5p 1.06±0.35 0.71±0.20 0.20±0.08 16.813 0.000 miR-379-5p 1.84±0.71 1.15±0.35 0.57±0.16 19.516 0.000

2.3 不同清蛋白尿組血清miR-188-5p及miR-379-5p水平比較 大量清蛋白尿組血清miR-188-5p（0.06±0.01）及miR-379-5p（0.24±0.10）水平均明顯低于微量清蛋白尿組（0.47±0.13, 0.98±0.25），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.926, 12.714, 均P＜0.05）。

2.4 多因素Logistic回歸分析2型糖尿病患者發(fā)生DN的危險因素 見表3。以2型糖尿病患者是否發(fā)生DN為因變量，將差異有統(tǒng)計學(xué)意義的變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示病程、sCr，BUN，UACR，mALB，miR-188-5p及miR-379-5p是影響2型糖尿病患者發(fā)生DN的獨立危險因素（均P＜0.05）。

表3 多因素Logistic回歸分析2型糖尿病患者發(fā)生DN的危險因素

2.5 miR-188-5p，miR-379-5p及mALB水 平診 斷DN的價值見表4，圖1。miR-188-5p，miR-379-5p及mALB水平診斷DN的最佳截值分別為0.46，0.85，82.40 mg/L，三項聯(lián)合診斷DN的曲線下面積明顯高于miR-188-5p，miR-379-5p及mALB單項檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其敏感度和特異度分別為97.4%和85.3%。

圖1 miR-188-5p，miR-379-5p水平診斷DN的ROC曲線

表5 miR-188-5p，miR-379-5p及mALB水平診斷DN的價值

3 討論

糖尿病腎病（DN）的發(fā)生發(fā)展與免疫炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、代謝異常以及表觀遺傳學(xué)有關(guān)，其中表觀遺傳學(xué)在DN中發(fā)病機制是當(dāng)前研究的熱點[7]。miRNA作為一類非編碼的小分子RNA，通過參與細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)節(jié)而影響生物體的各項生命活動，在DN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，有望成為DN診斷的潛在標(biāo)志物以及藥物治療的新靶點[8]。既往研究表明，miRNA通過影響多條信號通路中多種信號分子的表達(dá)參與DN的發(fā)病過程，與DN患者的腎功能損傷、間質(zhì)纖維化和足細(xì)胞凋亡有關(guān)，可能為了解DN的發(fā)病機制提供新思路[9-10]。mALB是評估腎功能損害的重要指標(biāo)，其與DN的發(fā)病關(guān)系密切[11]。

本研究顯示，DN組血清miR-188-5p，miR-379-5p水平均明顯低于2型糖尿病組和對照組，且2型糖尿病組明顯低于對照組，提示miR-188-5p及miR-379-5p低表達(dá)可能參與DN的發(fā)生。本研究中大量清蛋白尿組血清miR-188-5p及miR-379-5p水平均明顯低于微量清蛋白尿組，提示miR-188-5p及miR-379-5p低表達(dá)有利于促進(jìn)DN患者的病情進(jìn)展。MA等[12]研究表明，miRNA調(diào)節(jié)多種生物細(xì)胞功能，miRNA的表達(dá)改變與DN發(fā)生密切相關(guān)，可能是預(yù)測DN發(fā)生的獨立因子。YU等[13]研究認(rèn)為，miRNA可能通過促進(jìn)腎臟纖維化、新生血管形成等途徑參與DN的發(fā)生和發(fā)展，可作為診斷DN的無創(chuàng)生物學(xué)指標(biāo)。本研究多因素Logistic回歸分析顯示，miR-188-5p及miR-379-5p是影響2型糖尿病患者發(fā)生DN的重要危險因素。提示2型糖尿病患者血清miR-188-5p及miR-379-5p水平降低，其發(fā)生DN的風(fēng)險較高。mALB是早期診斷腎小球微血管病變的有效指標(biāo)，mALB水平升高可促進(jìn)DN的發(fā)生發(fā)展，是預(yù)測DN發(fā)生的危險因子[14]。此外，病程，sCr，BUN及UACR也是影響DN發(fā)生的危險因素，這可能使糖尿病病程延長導(dǎo)致DN的發(fā)病風(fēng)險增加，長期的高sCr，BUN及UACR不僅會造成腎小球硬化，還會使腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌纖維細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致腎功能損傷。

本研究應(yīng)用ROC曲線分析顯示，miR-188-5p及miR-379-5p聯(lián)合mALB診斷DN的曲線下面積（0.952，95%CI：0.890～0.997）最大，其敏感度和特異度分別為97.4%和85.3%。說明miR-188-5p，miR-379-5p及mALB三項聯(lián)合檢測對DN診斷的效能較好，miR-188-5p及miR-379-5p有望成為DN診斷的新型生物標(biāo)志物。陳燕等[15]研究顯示，DN患者尿mALB水平明顯升高，尿mALB是早期DN發(fā)病的獨立危險因素，可協(xié)助早期DN的診斷,具有一定的臨床價值。GHOLAMINEJAD等[16]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，DN患者中miRNA表達(dá)失調(diào)，且其低表達(dá)參與DN的病情進(jìn)展，在DN發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，可能是DN患者的一個非侵入性的潛在生物標(biāo)志物。

綜上所述，DN患者血清miR-188-5p及miR-379-5p水平明顯降低，是影響2型糖尿病患者發(fā)生DN的獨立危險因素，聯(lián)合mALB在DN診斷中具有較好的價值。