急性缺血性腦卒中患者血清miR-433-5p表達水平及其與Hcy及MMP-9的相關性研究

王 景，董 坤，黃 優(yōu)，陳海戀，林兆信，何超明

（三亞中心醫(yī)院/海南省第三人民醫(yī)院神經(jīng)內科，海南三亞 572000）

急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）是嚴重危害人類生命健康和生活質量的急性腦血管疾病[1]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類非編碼小分子RNA，參與AIS的發(fā)生發(fā)展[2]。研究表明，miR-433-5p的異常表達與AIS的發(fā)生發(fā)展密切相關，有望作為AIS診斷的潛在指標[3]。同型半胱氨酸（homocysteine, Hcy）及基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）可反映動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展程度，參與AIS的組織損傷和炎癥反應過程，是AIS發(fā)生的主要危險因子[4-5]。本研究通過檢測血清miR-433-5p在AIS中表達情況，分析其與Hcy及MMP-9的相關性，探討miR-433-5p對AIS的診斷價值，有助于指導AIS的診療。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2019年1月～2021年3月在三亞中心醫(yī)院收治的106例AIS ，其中男性72例，女性34例，年齡37～86（58.12±9.64）歲。納入標準：①符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南（2018年）》[6]診斷標準；②經(jīng)頭顱CT或MRI檢查顯示缺血性病灶。排除標準：腦外傷及其他腦血管疾病者。根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（national institutes of health stroke scale, NIHSS）評分評估患者的神經(jīng)功能缺損程度，其中輕度神經(jīng)功能缺損30例（輕度組，NIHSS評分＜5分），中度神經(jīng)功能缺損48例（中度組，5分≤NIHSS評分≤20分），重度神經(jīng)功能缺損28例（重度組，NIHSS評分＞20分）。另選擇健康體檢正常者60例作為對照組，其中男性42例，女性18例，年齡40～85（59.37±9.10）歲。各組性別、年齡等資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 儀器與試劑 ABI 7500型熒光定量PCR儀（ABI公司）；PCR試劑盒，逆轉錄試劑盒和TRIzol試劑盒（Qiagen公司）；AU5800全自動生化分析儀（貝克曼），HCY試劑盒（上海生物科技有限公司），MMP-9試劑盒（武漢賽培生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 miR-433-5p：采集研究對象靜脈血3 ml，離心分離血清，應用實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測miR-433-5p。上游引物：5’-ATACTGGCATCATGA CTGTAC-3’，下游引物：5’-GC ATCGATGTAACT GTGAGT-3’。PCR總反應體系為20 μl：1 μl引物及探針Mix，10 μl TaqMan通用混合物溶液，1.33 μl反轉錄產(chǎn)物互補DNA，7.67 μl無核酸酶的水；擴增條件：95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，45個循環(huán)。

1.3.2 Hcy及MMP-9檢測 ：另采集研究對象靜脈血2 ml，使用貝克曼AU5800全自動生化分析儀檢測Hcy水平；采用酶聯(lián)免疫吸附法測定MMP-9水平。

1.4 統(tǒng)計學分析 SPSS20.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；組間比較采用t’檢驗。繪制受試者工作特征曲線（ROC）分析血清miR-433-5p，Hcy及MMP-9水平對AIS的診斷價值。相關性分析采用Pearson相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 AIS組和對照組血清miR-433-5p，Hcy及MMP-9水平比較 與對照組比較，AIS組血清miR-433-p（2.96±0.94 vs 0.81±0.17），Hcy（19.14±5.30μmol/L vs 5.65±1.13μmol/L）及MMP-9水平（151.36±29.75μg/L vs 77.93±11.28μmol/L）升高，差異均有統(tǒng)計學意義（t=16.718, 14.216, 10.152，均P＜0.001）。

2.2 不同神經(jīng)功能缺損患者血清miR-433-5p，Hcy及MMP-9水平比較 見表1。與中度組和輕度組比較，重度組血清miR-433-5p，Hcy及MMP-9水平均升高（t=9.847～14.636，均P＜0.05），且中度組血清miR-433-5p，Hcy及MMP-9水平均高于輕度組（t=11.713，8.425, 7.732, 均P=0.000），差異均有統(tǒng)計學意義。

表1 不同神經(jīng)功能缺損患者血清miR- 433-5p，Hcy及MMP-9水平比較（±s）

表1 不同神經(jīng)功能缺損患者血清miR- 433-5p，Hcy及MMP-9水平比較（±s）

項 目 輕度組（n=30） 中度組（n=48） 重度組（n=28） F值 P值miR -433-5p 1.83±0.57 2.80±0.91 4.36±1.20 12.918 ＜0.001 Hcy（μmol/L） 11.35±3.24 18.20±4.86 29.12±6.48 9.650 ＜0.001 MMP-9（μg/L） 85.27±11.93 140.83±25.64 227.15±48.20 7.934 ＜0.001

2.3 血清miR-433-5p，Hcy及MMP-9水平對AIS的診斷價值 見表2和圖1。miR-433-5p診斷AIS的AUC為0.851（95%CI：0.792～0.908），高于Hcy（0.756，95%CI：0.695～0.814）及MMP-9（0.698，95%CI：0.637～0.756），差異有統(tǒng)計學意義（Z=6.472，8.151，均P＜0.05），敏感度和特異度分別為89.4%和82.0%。

表2 血清miR- 433-5p，Hcy及MMP-9水平對AIS的診斷價值

圖1 血清miR-433-5p，Hcy及MMP-9水平診斷AIS的ROC曲線

2.4 miR-433-5p與Hcy，MMP-9的相關性分析 見圖2。Pearson相關分析顯示，AIS患者血清miR-433-5p表達水平與Hcy及MMP-9均呈正相關（r=0.842，0.714，均P＜0.01）。

圖2 miR-433-5p與Hcy，MMP-9的相關性

3 討論

急性缺血性腦卒中（AIS）是最常見的腦卒中類型，其致殘率和死亡率較高，位居全球第二位，早期診斷、早期治療及早期康復對該病的救治至關重要。目前，關于AIS的早期診斷具有較大的挑戰(zhàn)性，仍需要改進AIS的診斷生物標志物。同型半胱氨酸（Hcy）作為人體內的含硫氨基酸，是動脈粥樣硬化發(fā)生的危險因子，對判斷腦卒中預后具有較好的幫助[7]。基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）是一種基質金屬蛋白酶，通過誘導下游炎性因子，促進氧化應激損傷，參與動脈粥樣硬化及腦梗死發(fā)生[8]。miRNA是一類內源性非編碼RNA分子，可在轉錄后調節(jié)基因表達，參與神經(jīng)修復、炎癥和氧化應激，在AIS發(fā)生過程中扮演重要角色[9]。ZHAO等[10]研究指出，miRNA異常表達與動脈粥樣硬化斑塊的形成及破裂有關，參與腦卒中的發(fā)生。

本研究顯示，與對照組比較，AIS組血清miR-433-5p，Hcy及MMP-9水平升高，重度組血清miR-433-5p，Hcy及MMP-9水平均高于中度組和輕度組，說明血清miR-433-5p，Hcy及MMP-9水平升高與AIS患者的神經(jīng)功能缺損的嚴重程度有關，可能參與AIS的發(fā)生發(fā)展。以往的研究認為，Hcy水平升高是促進腦卒中患者病情發(fā)生及進展的危險因子，對判斷腦卒中患者的病情嚴重程度及預后有很大幫助[11]。ZHENG等[12]研究發(fā)現(xiàn)，血清MMP-9水平在AIS患者中明顯升高，且與患者的病情嚴重程度有關，MMP-9對評估腦卒中患者病情進展情況具有一定的價值。另有研究表明，miRNA通過靶向作用于多種蛋白在腦卒中的免疫炎癥反應、細胞凋亡及氧化應激反應的過程起了重要的調節(jié)作用，可為腦卒中的診斷、治療及預后提供新的策略[13]。本研究ROC曲線分析顯示，血清miR-433-p診斷AIS的AUC高于Hcy及MMP-9，其最佳臨界值取1.96時，診斷AIS的敏感度和特異度較高。由此可見，與Hcy及MMP-9相比，miR-433-5p診斷AIS的敏感度和特異度較高，對AIS診斷具有較高的臨床應用價值，有望作為AIS診斷的分子標志物。CAO等[14]研究表明，AIS患者存在miRNA差異表達，其對AIS診斷具有很好的前景，未來有望作為AIS診斷的有用標志物。本研究相關分析顯示，AIS患者miR-433-5p水平與Hcy及MMP-9均呈正相關，提示miR-433-5p可能與Hcy及MMP-9共同促進動脈粥樣硬化形成，在AIS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此，我們推測miR-433-5p的高表達可能與AIS發(fā)生有關。另有研究認為，miRNA在基因表達和分泌的轉錄后調控中發(fā)揮著重要作用，參與了AIS的發(fā)生發(fā)展，其作為AIS診斷和預后敏感生物標志物具有巨大的潛力，將為臨床上AIS診療帶來很大的幫助[15]。

綜上所述，血清miR-433-5p表達水平在AIS患者中明顯升高，且與Hcy及MMP-9水平呈正相關，miR-433-5p有望作為AIS診斷的有用標志物。但本研究的樣本例數(shù)不多，而且為單中心的臨床分析，未來仍需更大樣本的多中心研究來證實，使其更好的應用于臨床。