非小細胞肺癌組織中miR-30a和CD73的表達水平與預后相關(guān)性分析

馬彥娥，蘇虎艷，王倩如，郝光軍（榆林市第一醫(yī)院腫瘤診療中心，陜西榆林 719000）

肺癌是美國人癌癥相關(guān)死亡的主要原因，每年約有15.4萬美國人死于肺癌[1]。近年來，肺癌在中國的發(fā)病率和死亡率也逐年增加，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是一種常見的肺癌類型，約占肺癌總數(shù)的80%，10年總生存率仍較低，尋找能早期評估NSCLC患者預后的指標非常關(guān)鍵[2]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）在腫瘤中的研究越來越受到關(guān)注，miRNA通過與靶基因mRNA特異性結(jié)合來調(diào)控mRNA蛋白表達，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展進程[3]。最新研究發(fā)現(xiàn)[4]，微小RNA-30a（miR-30a）在NSCLC患者血清和腫瘤組織中均表達下調(diào)，低表達miR-30a與較差生存率有關(guān)，具有作為NSCLC篩查和預后生物標志物的潛力。CD73，也稱為胞外5’-核苷酸酶（ecto-5’-nucleotidase），有研究發(fā)現(xiàn)，CD73的過表達在NSCLC腫瘤中產(chǎn)生了免疫抑制性微環(huán)境，可催化釋放細胞外腺苷抑制T細胞的抗腫瘤功能并誘導T細胞凋亡，從而幫助腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視[5-6]。因此，本研究通過同時檢測NSCLC腫瘤組織中miR-30a和CD73表達情況，分析其表達水平與患者預后的關(guān)系，討論其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2015年8月～2019年12月于陜西省榆林市第一醫(yī)院術(shù)后病理檢查證實為非小細胞肺癌組織120例為研究組，其中男性67例，女性53例，年齡34～76歲，中位年齡64歲。病理類型：腺癌76例，鱗癌44例；分化程度：低分化癌47例，中高分化癌73例；TNM分期：Ⅰ期34例，Ⅱ期61例，Ⅲ期25例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移66例。50例正常癌旁組織（距離癌組織5cm以上，其中有70例患者癌旁組織資料缺失）為對照組。納入標準：①均為首次確診，并于本院治療；②預計生存時間＞3個月；③術(shù)前未接受過其他任何抗腫瘤治療；④TNM分期為Ⅰ～Ⅲ期；⑤臨床資料及隨訪資料完整。排除標準：①并發(fā)其他惡性腫瘤；②有肺癌家族史；③并發(fā)精神、意識、聽覺障礙患者；④并發(fā)其他肺部疾病。本研究獲得本院倫理委員會批準通過。

1.2 儀器與試劑 實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）儀（濟南來寶醫(yī)療器械有限公司），TRIzol試劑（美國Sigma公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR擴增試劑盒（Thermo Scientific公司），兔抗人CD73多克隆抗體（艾美捷科技有限公司），DAB顯色試劑盒（上海博湖生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR技術(shù)檢測miR-30a相對表達量：首先將組織樣本勻漿，利用TRIzol試劑提取組織中的RNA，并檢測RNA的濃度和純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進行PCR擴增。miR-30a以U6為內(nèi)參，引物序列由上海生工生物工程公司合成。miR-30a上游引物：5’-ACAC TCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC-3’，下 游引物：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AA CGCTTCACGAATTTGCGT-3’。利用2-ΔΔCt計算miR-30a相對表達量。

1.3.2 免疫組織化學法檢測CD73的表達情況：將組織樣本用甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋，以4μm連續(xù)切片，再常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復，采用鏈霉親合素-生物素復合物（SP）法進行染色，方法步驟嚴格按試劑盒說明書操作，一抗采用兔抗人CD73多克隆抗體，稀釋濃度1∶100，滴加一抗后于4℃冰箱孵育過夜，再滴加生物素標記的二抗，DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。用磷酸鹽緩沖液（PBS）作為陰性對照。

以組織細胞顯色為棕黃色為表達陽性，選取5個高倍鏡視野進行雙盲法評定，由病理科兩位經(jīng)驗豐富的醫(yī)師分別給出結(jié)果。按染色強度評分：無染色0分，淺黃色1分，黃色或黃棕色2分，棕褐色3分；按陽性細胞百分比評分：無陽性細胞記0分，＜25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，＞75%記4分。取兩種方法得分的乘積，＞1分為表達陽性（+），≤1分為表達陰性（-），≥3分為高表達，＜3分為低表達。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS25.0軟件進行數(shù)據(jù)的錄入與分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗比較NSCLC癌組織和正常癌旁組織中miR-30a的表達水平；計數(shù)資料以頻數(shù)（n）或百分比（%）表示，采用χ2檢驗分析miR-30a和CD73表達水平與NSCLC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系；采用Kaplan-Meier法進行生存分析，組間差異比較利用對數(shù)秩檢驗（LogRank test）；多因素COX回歸分析影響NSCLC患者預后的危險因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-30a在NSCLC癌組織和正常癌旁組織中的表達水平比較 miR-30a在NSCLC癌組織中的表達水平為1.17±0.21，明顯低于正常癌旁組織（1.62±0.48），差異有統(tǒng)計學意義（t=8.521，P=0.000）。

2.2 免疫組織化學檢測結(jié)果 見圖1。CD73在NSCLC癌組織中主要定位于細胞質(zhì)和細胞膜，高表達標本染色以棕色為主。CD73在NSCLC癌組織及癌旁正常組織中的陽性表達率分別為63.33%（76/120）和32.00%（16/50），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=13.955，P=0.000）。

圖1 免疫組織化學檢測CD73在NSCLC癌組織和正常癌旁組織中的表達（SP，×200）

2.3 NSCLC癌組織中miR-30a，CD73表達情況與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 見表1。以miR-30a在癌組織中表達水平中位數(shù)（1.20）為分界點將其分為miR-30a高表達組（61例）和低表達組（59例），根據(jù)免疫組織化學評分是否≥3分將其分為CD73高表達組（68例）和低表達組（52例），分析可知，miR-30a，CD73表達與NSCLC患者年齡、性別、病理類型無關(guān)（均P＞0.05），與腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（均P＜0.05）。

表1 NSCLC癌組織中miR-30a，CD73表達情況與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

2.4 生存分析 見圖2。隨訪一年，統(tǒng)計NSCLC患者miR-30a，CD73表達情況與生存狀況的關(guān)系，結(jié)果顯示miR-30a高表達組NSCLC患者一年累積生存率（86.89%, 53/61）明顯高于低表達組（59.32%,35/59）（Log Rankχ2=11.652，P=0.000）；CD73高表達組NSCLC患者一年累積生存率（58.82%,40/68）明顯低于低表達組（92.31%, 48/52）（Log Rankχ2=16.894，P=0.000）。

圖2 miR-30a，CD73表達與NSCLC患者生存時間的關(guān)系

2.5 影響NSCLC患者預后的危險因素分析 見表2。以NSCLC患者預后不良（隨訪時患者死亡）為因變量（1=預后不良，0=預后良好），將TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及miR-30a，CD73納入自變量進行多因素COX回歸分析，結(jié)果顯示分化程度低（HR=1.677，95%CI：1.092～2.576），發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR=1.574，95%CI：1.043～2.376）是影響NSCLC患者預后不良的危險因素，而miR-30a低表達（HR=1.479，95%CI：1.027～2.130），CD73高表達（HR=1.501，95%CI：1.059～2.128）是影響NSCLC患者預后不良的獨立危險因素。

表2 影響NSCLC患者預后的危險因素

3 討論

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，嚴重影響患者的身心健康。NSCLC作為肺癌中的一種，主要源于支氣管黏膜上皮或肺泡上皮細胞惡化，根據(jù)其病理類型主要有腺癌、鱗癌、大細胞癌、腺鱗癌等[7]。NSCLC的發(fā)病機制尚不清楚，但根據(jù)流行病學研究顯示，主要與環(huán)境因素、自身因素及遺傳因素等有關(guān)。因此，需要找到能早期評估NSCLC患者預后的生物學指標為改善預后提供依據(jù)。

miRNAs是一類小的（平均22個氨基酸）內(nèi)源性非編碼RNA分子，在癌癥的發(fā)生及進展中起重要作用，主要是通過與位于目標靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)的目標序列結(jié)合來調(diào)節(jié)致癌和/或腫瘤抑制基因，最終導致目標mRNA降解或蛋白翻譯受阻[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-30a在腫瘤轉(zhuǎn)移中被下調(diào)，對維持上皮性狀至關(guān)重要，因此miR-30a是轉(zhuǎn)移性癌癥中高度下調(diào)的miRNAs之一，在轉(zhuǎn)化生長因子β促進的腫瘤轉(zhuǎn)移過程中下降，最終導致侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)間充質(zhì)因子表達增加[10-11]。YU等[12]研究報道，胃癌組織中miR-30a表達水平較癌旁非惡性組織低，其可通過靶向成纖維細胞活化蛋白α抑制胃癌轉(zhuǎn)移。此外有研究表明[13]，特發(fā)性肺間質(zhì)性纖維化患者支氣管肺泡灌洗液中miR-30a表達下調(diào)，其可通過靶向成纖維細胞活化蛋白α減弱轉(zhuǎn)化生長因子β1誘導的肺成纖維細胞活化。本研究結(jié)果顯示，在NSCLC患者腫瘤組織中miR-30a相對表達量明顯低于癌旁正常組織，與上述結(jié)論一致。分析其水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果表明腫瘤分化程度低、臨床分期Ⅲ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的miR-30a水平明顯較低，提示miR-30a水平可能與NSCLC腫瘤分化、遷移有關(guān)。ZHOU等[14]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺導管腺癌組織中miR-30a-5p表達降低與患者預后不良有一定關(guān)系，且上調(diào)miR-30a-5p表達可增加胰腺導管腺癌對吉西他濱的化療敏感性。此外，有研究證實[15]，miR-30a可削弱NSCLC腫瘤細胞對新輔助化療（即DDP和PEM聯(lián)合治療）的抗性，抑制DDP/PEM誘導的自噬并促進DDP/PEM引發(fā)的NSCLC腫瘤細胞凋亡，因此低水平的miR-30a與NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、晚期TNM分期及較差生存期有關(guān)，為臨床治療NSCLC提供潛在治療靶標。本研究分析了NSCLC患者術(shù)后一年的生存情況，結(jié)果顯示miR-30a低表達者具有較差生存情況，進一步COX回歸分析結(jié)果顯示低miR-30a是影響NSCLC患者預后不良的獨立危險因素，miR-30a的表達可能作為預測NSCLC預后的有效指標。

研究發(fā)現(xiàn)，CD73主要在內(nèi)皮細胞、上皮細胞及一些免疫亞群細胞上內(nèi)源性表達，可催化細胞外單磷酸腺苷去磷酸化為腺苷和無機磷酸鹽[16]。CD73的表達與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和免疫耐受的腫瘤微環(huán)境轉(zhuǎn)錄組特征密切相關(guān)，臨床證實這些與疾病進展和治療耐藥性有關(guān)[17]。DIETRICH等[18]研究表明，抑制CD73表達有助于增強T24人膀胱癌細胞系的放射敏感度。沈海濤等[19]研究發(fā)現(xiàn)，外周血CD73+表達水平升高與原發(fā)性肝癌發(fā)生及患者肝損傷密切相關(guān)。國內(nèi)學者高鋒等[20]研究發(fā)現(xiàn)，CD73在NSCLC腫瘤組織中表達水平較正常肺組織明顯升高，且與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與本研究結(jié)果一致，提示CD73參與NSCLC腫瘤細胞浸潤、轉(zhuǎn)移。該研究還發(fā)現(xiàn)過表達的CD73可促進T細胞凋亡并抑制T細胞抗腫瘤作用，證實CD73是一種致癌因子。另有研究發(fā)現(xiàn)，在正常支氣管和肺泡上皮不表達CD73，而在癌細胞、癌癥相關(guān)成纖維細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞中過度表達，且CD73的高表達與乳酸脫氫酶5和癌細胞的缺氧誘導因子1α表達直接相關(guān)[6]。本研究結(jié)果顯示，CD73高表達NSCLC患者一年累積生存率明顯低于低表達患者，且高表達CD73是影響NSCLC患者預后不良的獨立危險因素，表明CD73在NSCLC預后預測中起重要作用。早期研究發(fā)現(xiàn)[21]，CD73是miR-30a-5p的直接靶標，而過表達miR-30a-5p抑制了NSCLC體外和體內(nèi)的細胞增殖，CD73與miR-30a是否存在直接靶向關(guān)系有待進一步細胞實驗驗證。

綜上所述，NSCLC的發(fā)生發(fā)展受多因素共同調(diào)控，miR-30a表達下調(diào)，CD73表達上調(diào)，二者表達水平與腫瘤分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是影響NSCLC患者預后不良的獨立危險因素。CD73，miR-30a在NSCLC中的具體作用機制有待進一步體外實驗證實。