非小細(xì)胞肺癌患者血漿miR-520f，miR-143-3p表達(dá)與病理特征和預(yù)后的相關(guān)性研究

張玲玲，張小霞，於瀟瀟，葛 琴（南通市腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南通 226361）

隨著非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）研究的不斷深入，靶向治療和免疫治療逐漸應(yīng)用于臨床，患者生存率得到一定程度提高，但是總體生存率仍然較低，尤其是發(fā)生轉(zhuǎn)移的中晚期患者[1]，其5年生存率不到5%[2]。微小核糖核酸（micro RNA，miRNA）參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡等調(diào)控，在惡性腫瘤中或發(fā)揮致癌基因作用或發(fā)揮抑癌基因作用[3]。其中miR-520f，miR-143-3p具有抑制癌細(xì)胞增殖和侵襲功能，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用[4-5]。但是miR-520f，miR-143-3p在NSCLC的報(bào)道并不多見(jiàn)，其作用機(jī)制以及和患者預(yù)后的關(guān)系尚不明確，鑒于此本研究檢測(cè)NSCLC患者血漿miR-520f，miR-143-3p表達(dá)并分析其臨床意義，旨在為病情評(píng)估和預(yù)后預(yù)測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究已獲得南通市腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，選擇2015年1月～2017年1月南通市腫瘤醫(yī)院收治的81例首次確診為NSCLC患者（NSCLC組），排除其它類(lèi)型肺癌；入組前已經(jīng)接受手術(shù)、放化療治療；并發(fā)其它部位腫瘤、肺結(jié)核。男性42例，女性39例，年齡51～72（63.35±4.21）歲，吸煙史（吸煙史定義為每天吸煙20支，煙齡≥20年）51例。另選擇62例體檢者為對(duì)照組，男性38例，女性24例，年齡51～70（63.09±4.17）歲，吸煙史13例。兩組年齡、性別、吸煙史比例比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 試劑和儀器 Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；SuperScript IV 反轉(zhuǎn)錄酶，VeritiPro PCR儀（美國(guó)賽默飛公司）；Optima XPN系列超速離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）。

1.3 方法 NSCLC組術(shù)前（對(duì)照組體檢當(dāng)日）采集肘靜脈血，參照劉旭輝等[6]的操作方法，2-ΔΔCt計(jì)算miR-520f，miR-143-3p相對(duì)表達(dá)量，引物序列見(jiàn)表1。采用電話隨訪方式對(duì)NSCLC患者進(jìn)行定期隨訪（每3個(gè)月一次）和生存狀況統(tǒng)計(jì)，時(shí)間截止2020年9月。自病理確診至影像學(xué)或?qū)嶒?yàn)室復(fù)查發(fā)現(xiàn)的腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或全因死亡/隨訪截止時(shí)間為無(wú)疾病進(jìn)展（progression-free survival，PFS）生存時(shí)間。自病理確診至全因死亡/隨訪截止時(shí)間為總體生存（overall survival，OS）時(shí)間，統(tǒng)計(jì)隨訪期間NSCLC患者PFS，OS生存率。

表1 引物序列和反應(yīng)條件

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和分析，miR-520f， miR-143-3p以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用Studentt檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（n）表示，采用χ2檢驗(yàn)；繪制NSCLC患者Kaplan-Meier生存曲線，Log-Rank檢驗(yàn)不同miR-520f，miR-143-3p表達(dá)下患者生存率差異。COX風(fēng)險(xiǎn)比例回歸檢驗(yàn)NSCLC患者隨訪期間死亡的因素。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組血漿miR-520f，miR-143-3p表達(dá)比較成組設(shè)計(jì)資料的t檢驗(yàn)結(jié)果顯示NSCLC患者血漿miR-520f（1.82±0.32）， miR-143-3p（0.35±0.06）表達(dá)低于對(duì)照組（2.51±0.49，0.94±0.11），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.160, 40.986，均P＜0.01）。

2.2 血漿miR-520f，miR-143-3p水平與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系 見(jiàn)表2。成組設(shè)計(jì)資料的t檢驗(yàn)結(jié)果顯示TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC患者血漿miR-520f表達(dá)低于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），低中度分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC患者血漿miR-143-3p表達(dá)低于高度分化、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

表2 不同臨床病理特征患者血漿miR-520f，miR-143-3p表達(dá)差異（±s）

表2 不同臨床病理特征患者血漿miR-520f，miR-143-3p表達(dá)差異（±s）

類(lèi) 別 n miR-520f t值 P值 miR-143-3p t值 P值性別 男 42 1.67±0.28 1.862 0.066 0.33±0.05 0.817 0.416女39 1.79±0.30 0.34±0.06年齡 (歲) ≥60 46 1.68±0.27 1.919 0.059 0.33±0.04 0.811 0.420＜60 35 1.80±0.29 0.34±0.07吸煙史 有 51 1.70±0.28 1.177 0.243 0.33±0.05 0.807 0.422無(wú)30 1.78±0.32 0.34±0.06腫瘤直徑(cm) ≥3 35 1.68±0.23 1.545 0.126 0.33±0.04 0.466 0.643＜3 46 1.77±0.28 0.33±0.05病理類(lèi)型 腺癌 45 1.68±0.25 1.800 0.075 0.33±0.03 1.286 0.202鱗癌 36 1.79±0.30 0.34±0.06分化程度 低中度分化 42 1.69±0.26 1.309 0.194 0.30±0.04 5.035 ＜0.01高度分化 39 1.77±0.29 0.37±0.08 TNM分期 Ⅰ～Ⅱ期 33 1.89±0.35 4.335 ＜0.01 0.31±0.04 3.349 ＜0.01Ⅲ～Ⅳ期 48 1.62±0.21 0.35±0.06淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 是 23 1.52±0.20 4.983 ＜0.01 0.26±0.03 7.604 ＜0.01否58 1.81±0.29 0.36±0.06

2.3 不同血漿miR-520f，miR-143-3p表達(dá)NSCLC患者預(yù)后差異及PFS，OS生存曲線圖 生存分析曲線圖見(jiàn)圖1,圖2。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示低表達(dá)miR-520f組（miR-520f＜1.82，n=39）NSCLC患者PFS生存率、OS生存率分別為58.97%（23/39），76.92%（30/39），低 于 高表 達(dá)miR-520f組（miR-520f≥1.82，n=42）的90.48%（38/42），95.24%（40/42），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log Rankχ2=9.270，5.303，P=0.002，0.021）；低表達(dá)miR-143-3p組（miR-143-3p＜0.35，n=36）NSCLC患者PFS生存率、OS生存率分別為58.33%（21/36），75.00%（27/36），低于高表達(dá)miR-143-3p組（miR-143-3p≥0.35，n=45）的88.89%（40/45），95.56%（43/45），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log Rankχ2=9.079，6.857，P=0.003，0.009）。

圖1 不同血漿miR-520f表達(dá)NSCLC患者PFS，OS生存曲線圖

圖2 不同血漿miR-143-3p表達(dá)NSCLC患者PFS，OS生存曲線圖

2.4 NSCLC患者終點(diǎn)事件的COX回歸分析 見(jiàn)表3。經(jīng)單因素COX回歸分析：腫瘤直徑、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移、miR-520f，miR-143-3p與NSCLC終點(diǎn)事件有關(guān)（均P＜0.05）。多因素COX回歸分析：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-520f，miR-143-3p與NSCLC患者終點(diǎn)事件獨(dú)立相關(guān)（均P＜0.001）。

表3 影響NSCLC患者預(yù)后的COX回歸分析

3 討論

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）早期癥狀隱匿，檢出率低，確診時(shí)多數(shù)已處于中晚期，喪失最佳手術(shù)時(shí)機(jī)，生存狀況差[6]，探尋預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后的非侵入性指標(biāo)十分重要。miRNA 是一類(lèi)非編碼小分子RNA，通過(guò)特異性識(shí)別靶mRNA3’非編碼區(qū)，導(dǎo)致靶mRNA降解，翻譯抑制，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)，參與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種miRNA與NCSLC發(fā)病有關(guān) [7-8]。

miR-520f是miR-520家族成員之一，定位于19號(hào)染色體，具有調(diào)控胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)、分化作用[9]。miR-520f已被證實(shí)參與多種惡性腫瘤發(fā)生和進(jìn)展，體外研究顯示敲除胃癌細(xì)胞中miR-520f可導(dǎo)致細(xì)胞的侵襲性增殖[10]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-520f過(guò)表達(dá)可抑制小鼠肺轉(zhuǎn)移[11]。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC組miR-520f表達(dá)低于健康對(duì)照組，且miR-520f表達(dá)與NSCLC患者TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-520f在NSCLC中發(fā)揮抑癌基因作用。體外研究表明miR-520可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，下調(diào)miR-520f可能減弱細(xì)胞凋亡抑制作用，并導(dǎo)致化療耐藥[11-12]。miR-520f可通過(guò)靶向調(diào)控4跨膜區(qū)的L6超家族成員1抑制肝癌細(xì)胞增殖和侵襲[13]，也可通過(guò)靶向調(diào)控去整合素-金屬蛋白酶9和Ⅱ型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-p受體抑制癌細(xì)胞侵襲，在惡性腫瘤中發(fā)揮抗侵襲和抗轉(zhuǎn)移作用[11]。本研究統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示miR-520f低表達(dá)與患者低生存率有關(guān)，miR-520f低表達(dá)是NSCLC終點(diǎn)事件發(fā)生的危險(xiǎn)因素，提示miR-520f可以為NSCLC預(yù)后評(píng)估提供一定參考。

miR-143-3p是miR-143家族成員之一，位于人類(lèi)基因組5號(hào)染色體33位，可調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期等，miR-143-3p表達(dá)顯著降低癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力[14]。miR-143-3p已被證實(shí)在卵巢癌[14]、骨肉瘤[15]、鼻鱗狀細(xì)胞癌[16]等多種腫瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)，但是miR-143-3p在NSCLC的作用機(jī)制尚不清楚，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-143-3p在NSCLC呈低表達(dá)，miR-143-3p低表達(dá)與低分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)，說(shuō)明miR-143-3p表達(dá)缺失可能與NSCLC癌細(xì)胞惡性增殖、侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。YANG等[17]人報(bào)道顯示miR-143-3p通過(guò)負(fù)向調(diào)控核糖核酸還原酶M2亞基（ribonucleotide reductase M2 subunit，RRM2）抑制NSCLC癌細(xì)胞生長(zhǎng)，而這一調(diào)控機(jī)制受LINC00667調(diào)控，提示miR-143-3p通過(guò)LINC00667/miR-143-3p/RRM2信號(hào)通路參與NSCLC發(fā)生和進(jìn)展。本研究生存分析曲線圖顯示低miR-143-3p表達(dá)NSCLC患者PFS，OS生存率偏低，經(jīng)COX回歸分析miR-143-3p低表達(dá)與NSCLC患者隨訪期間終點(diǎn)事件的發(fā)生密切相關(guān)，說(shuō)明miR-143-3p的表達(dá)缺失是NSCLC患者腫瘤復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、死亡的主要因素之一，這與miR-143-3p表達(dá)缺失導(dǎo)致對(duì)癌細(xì)胞增殖、侵襲抑制作用減弱、致癌基因表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。

綜上，NSCLC患者血漿中miR-520f，miR-143-3p表達(dá)均下調(diào)，miR-520f，miR-143-3p表達(dá)缺失是NSCLC增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的潛在因素，與患者低生存率密切相關(guān)。miR-520f，miR-143-3p可以為NSCLC預(yù)后評(píng)估、臨床治療、病情評(píng)估提供一定信息。