DOCK1通過AMPK/mTOR通路對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的調(diào)控機(jī)制研究

李 丹，張忠山，李洵婷，曹蘇娟（湘南學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，湖南郴州 423000）

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)起源于骨髓造血組織，是漿細(xì)胞過度增生所致的惡性腫瘤，多發(fā)于40～60歲中年男性[1-2]。了解MM發(fā)病機(jī)制和分子改變對改善患者生存質(zhì)量具有重要意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，胞質(zhì)分裂作用因子1（dedicator of cytokinesis 1，DOCK1）在乳腺癌、肝癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中表現(xiàn)出的促癌基因?qū)傩裕軌虼龠M(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程，且與部分實(shí)體瘤患者不良預(yù)后相關(guān)[3-5]。另研究還發(fā)現(xiàn)，DOCK1可抑制白血病SKM-1細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在骨髓增生異常綜合征向急性髓系白血病的轉(zhuǎn)化中扮演促進(jìn)作用[6]。PAN等[7]研究報(bào)道，依諾肝素通過抑制DOCK1表達(dá)及波形蛋白磷酸化和Akt激活，可使非小細(xì)胞肺癌對吉非替尼的敏感度增加，提示DOCK1可能是一個(gè)新的腫瘤治療靶標(biāo)。因此探究DOCK1在MM中的作用及機(jī)制可為MM的臨床治療提供新的方向。腺苷酸活化蛋白激酶（5’-AMP activated protein kinase,AMPK）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路和氧化應(yīng)激在腫瘤生長、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，MM細(xì)胞株存在AMPK的磷酸化激活，在紫檀烯治療前使用AMPK抑制劑Compound C進(jìn)行預(yù)處理可誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡[9]?；诩韧芯繄?bào)道DOCK1的癌基因?qū)傩?，本研究觀察了DOCK1在MM中的表達(dá)及其對癌細(xì)胞增殖、凋亡及自噬的作用，并探討了DOCK1是否可通過調(diào)控AMPK/mTOR通路參與調(diào)節(jié)MM細(xì)胞的增殖、凋亡和自噬，以期為MM的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株U266，RPMI 8266及人正常骨髓細(xì)胞MNC均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，接種于含10g/dl胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃，5ml/dl CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24～48 h更換培養(yǎng)基1次，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。另選取本院收治的多發(fā)性骨髓瘤患者及同期行骨髓穿刺并明確骨髓功能無異常的非血液病健康患者骨髓組織，各20例，檢測骨髓組織中DOCK1表達(dá)情況。

1.2 儀器與試劑 胎牛血清，RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；Trizol試劑，Lipfetamine2000（美國Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄盒（日本Takara公司）；CCK-8試劑盒，Annexin V/PI凋亡試劑盒（中國貝博生物）；RIPA裂解液，PMSF蛋白酶抑制劑，BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒，SDS-PAGE凝膠速配試劑盒（碧云天生物科技公司）；GAPDH單克隆抗體，Bax單克隆抗體，Bcl-2單克隆抗體（美國Abcam公司）；c-Myc單克隆抗體，cyclin D1單克隆抗體，LC3II單克隆抗體，P62單克隆抗體，AMPK/p-AMPK單克隆抗體及mTOR/p-mTOR單克隆抗體（美國CST公司）；DOCK1沉默慢病毒（LVDOCK1-shRNA），陰性對照慢病毒（LV-NC）及重組人DOCK1過表達(dá)質(zhì)粒hDOCK1-pCXN2-Flag（上海吉凱生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對數(shù)生長期待測細(xì)胞，以50 μl/孔接種于24孔板，分別加入3個(gè)LV-DOCK1-shRNA，LV-NC慢病毒及重組人DOCK1過表達(dá)質(zhì)粒hDOCK1-pCXN2-Flag，室溫靜置15 min后加入500 μl新鮮培養(yǎng)基，孵育24 h，離心棄上清，加入500 μl新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；于病毒感染第6天，加入0.3 μg/ml嘌呤霉素，連續(xù)培養(yǎng)72 h，換成不含嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)2天；在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞熒光強(qiáng)度，當(dāng)轉(zhuǎn)染率＞70%，細(xì)胞可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，選取LV-DOCK1-shRNA轉(zhuǎn)染效率最顯著的一組進(jìn)行后續(xù)研究。實(shí)驗(yàn)分組：主要設(shè)為空白對照組，LVDOCK1-shRNA轉(zhuǎn)染組，LV-NC（陰性對照組）及LV-DOCK1-shRNA+DOCK1過表達(dá)（hDOCK1組）共轉(zhuǎn)染組。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測 DOCK1 mRNA相對表達(dá) ：按照Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，引物由上海生工生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，DOCK1引物序列為Forward: 5’-GGATGACCTGGA GAAGGAG-3’，Reverse：5’-CGCAGGGGACTTA TCGT-3’；GAPDH引物序列為Forward：5’- ACGG ATTTGGTCGTATTGG-3’，Reverse：5’- TCCCGTT CTCAGCCTTG-3’。配置20 μl PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5s，60 ℃ 30s，循環(huán)40次。以2-ΔΔCt計(jì)算相對表達(dá)量，ΔCt=Ct目的基因－Ct內(nèi)參，Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.3.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性：取對數(shù)生長期細(xì)胞，離心后重懸細(xì)胞沉淀，以5×104個(gè)/ ml的細(xì)胞密度接種于96孔板，每孔50 μl細(xì)胞懸液，分別培養(yǎng)24，48，72 h 時(shí)，每孔加入10 μl CCK-8 試劑，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng) 2 h，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔吸光度值（A值）。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：收集各組待測細(xì)胞，低速離心5 min，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入緩沖液收集細(xì)胞懸液，洗滌混勻后，取200 μl細(xì)胞懸液至流式細(xì)胞管，按試劑盒說明書中建議的試劑體系用量依次加入5 μl Annexin V-FITC及5 μl PI后輕輕混勻，在室溫下避光孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。

1.3.5 Western blot 檢測相關(guān)蛋白表達(dá)：收集待測細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解緩沖液，離心后提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度。用10 g/dl SDS-PAGE上樣緩沖液電泳分離所有蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫下?lián)u床封閉1 h，分別加入增殖相關(guān)蛋白c-Myc，cyclin D1；凋亡相關(guān)蛋白Bax，Bcl-2；自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I，P62及AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白AMPK，p-AMPK，mTOR，p-mTOR和內(nèi)參GAPDH孵育過夜。用TBST清洗5次后，在室溫下用二抗孵育1 h。然后再次用TBST清洗膜3次后采用電化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色，觀察目標(biāo)蛋白灰色條帶。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；癌組織及癌旁正常組織中表達(dá)差異比較采用配對t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MM組織及細(xì)胞中DOCK1相對表達(dá) RTqPCR檢測顯示，MM細(xì)胞U266，RPMI 8266中DOCK1相對表達(dá)分別為9.84±2.56和8.67±2.42，明顯高于人正常骨髓細(xì)胞MNC1.32±0.56，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=15.088，P＜0.05）；同時(shí)檢測發(fā)現(xiàn)，MM患者骨髓組織中DOCK1相對表達(dá)（0.57±0.16）也明顯高于健康患者（2.84±0.73 ），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.458，P＜0.001）。表明DOCK1在多發(fā)性骨髓瘤中顯著高表達(dá)。

2.2 DOCK1轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證 見表1。RT-qPCR檢測顯示，轉(zhuǎn)染LV-DOCK1-shRNA2組和LV-DOCK1-shRNA3組U266細(xì)胞中DOCK1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均較空白對照組明顯降低，其中LV-DOCK1-shRNA2組降低最為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tmRNA=8.499,6.455；t蛋白=9.712,6.475，均P＜0.05）；LVDOCK1-shRNA1組和陰性對照組U266細(xì)胞中DOCK1 mRNA和蛋白表達(dá)與空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。RPMI 8266細(xì)胞中DOCK1 mRNA水平和蛋白表達(dá)水平變化與U266細(xì)胞一致，以轉(zhuǎn)染LV-DOCK1-shRNA2組降低最為顯著（tmRNA=8.312,6.672；t蛋白=10.114,8.141，均P＜0.05）。表明敲低DOCK1表達(dá)轉(zhuǎn)染成功，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇LV-DOCK1-shRNA2進(jìn)行研究。

表1 DOCK1在U266，RPMI 8266細(xì)胞中的表達(dá)（±s, n=3）

表1 DOCK1在U266，RPMI 8266細(xì)胞中的表達(dá)（±s, n=3）

細(xì)胞 表達(dá)水平 空白對照組 陰性對照組 LV-DOCK1-shRNA1組LV-DOCK1-shRNA2組LV-DOCK1-shRNA3組 F P U266 mRNA 1.01±0.10 1.26±0.19 1.23±0.19 0.22±0.05 0.41±0.09 53.572 ＜0.001蛋白 1.00±0.10 1.22±0.15 1.20±0.14 0.16±0.02 0.44±0.06 61.198 ＜0.001 RPMI 8266 mRNA 0.98±0.09 1.16±0.15 1.13±0.16 0.22±0.04 0.37±0.07 47.146 ＜0.001蛋白 1.02±0.11 1.25±0.13 1.23±0.13 0.20±0.03 0.36±0.05 75.204 ＜0.001

2.3 敲低DOCK1抑制細(xì)胞的增殖能力 見表2。CCK-8法檢測顯示，LV-DOCK1-shRNA2組的U266，RPMI 8266細(xì)胞增殖率在24，48和72 h均顯著低于空白對照組（tU266=11.840，5.466，5.360；tRPMI8266=10.788，6.802，6.617，均P＜0.05）和陰性對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（補(bǔ)充t值），陰性對照組和空白對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表3。Western blot檢測結(jié)果顯示，LV-DOCK1-shRNA2組 的U266，RPMI 8266細(xì) 胞增殖相關(guān)蛋白c-Myc，cyclin D1表達(dá)水平也顯著低于空白對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tU266=8.212，10.271；tRPMI8266細(xì)胞=11.676，8.135，均P＜0.05）和陰性對照組（補(bǔ)充t值），陰性對照組和空白對照組差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表2 低DOCK1對細(xì)胞增殖的影響（±s, n=3）

表2 低DOCK1對細(xì)胞增殖的影響（±s, n=3）

細(xì)胞 時(shí)間（h） 空白對照組 陰性對照組 LV-DOCK1-shRNA2組 F P U266 24 0.71±0.05 0.74±0.06 0.26±0.02 100.108 ＜0.001 48 1.13±0.10 1.21±0.13 0.68±0.06 24.089 ＜0.001 72 1.45±0.12 1.50±0.14 0.92±0.10 21.130 0.002 RPMI 8266 24 0.65±0.05 0.73±0.06 0.24±0.02 95.677 ＜0.001 48 1.18±0.10 1.30±0.13 0.62±0.06 38.872 ＜0.001 72 1.51±0.12 1.62±0.14 0.87±0.09 35.067 ＜0.001

表3 敲低DOCK1對細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白c-Myc，cyclin D1的影響（±s, n=3）

表3 敲低DOCK1對細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白c-Myc，cyclin D1的影響（±s, n=3）

細(xì)胞 蛋白 空白對照組 陰性對照組 LV-DOCK1shRNA2組 F P U266 c-Myc 1.00±0.09 1.16±0.18 0.22±0.01* 56.061 ＜0.001 cyclin D1 1.01±0.10 1.05±0.10 0.31±0.03* 71.584 ＜0.001 RPMI 8266 c-Myc 1.04±0.11 1.06±0.09 0.25±0.02* 93.248 ＜0.001 cyclin D1 1.02±0.10 1.21±0.12 0.41±0.03* 62.146 ＜0.001

2.4 敲低DOCK1促進(jìn)細(xì)胞的凋亡和自噬 見表4。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，LV-DOCK1-shRNA2組的U266，RPMI 8266細(xì)胞凋亡率24，48h均 顯著高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tU266=11.020，9.815；tRPMI8266=9.814，10.346， 均P＜0.05）和陰性對照組（補(bǔ)充t值），陰性對照組和空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表5。Western blot檢測顯示，與空白對照組和陰性對照組比較，LV-DOCK1-shRNA2組的U266，RPMI 8266細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2表達(dá)水平明顯降低（tU266=11.616，5.587；tRPMI8266=10.717，4.236，均P＜0.05）；自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I表達(dá)水平明顯升高，P62表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tU266=14.697，6.340；tRPMI8266=15.940，6.701，均P＜0.05）。陰性對照組和空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表4 敲低DOCK1對細(xì)胞凋亡率的影響（±s, n=3）

表4 敲低DOCK1對細(xì)胞凋亡率的影響（±s, n=3）

細(xì)胞 時(shí)間（h） 空白對照組 陰性對照組 LV-DOCK1-shRNA2組 F P U266 24 4.78±0.62 5.52±0.85 19.35±2.60* 77.051 ＜0.001 48 5.01±0.64 5.88±0.89 24.87±4.15* 61.533 ＜0.001 RPMI 8266 24 4.26±0.59 4.98±0.62 17.32±2.69* 60.868 ＜0.001 48 4.57±0.60 5.38±0.71 22.61±3.58* 68.306 ＜0.001

表5 敲低DOCK1對細(xì)胞凋亡、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s, n=3）

表5 敲低DOCK1對細(xì)胞凋亡、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s, n=3）

細(xì)胞 蛋白 空白對照組 陰性對照組 LV-DOCK1-shRNA2組 F P U266 Bax 0.72±0.06 0.67±0.06 2.48±0.31 92.588 ＜0.001 Bcl-2 1.37±0.14 1.40±0.15 0.79±0.08 21.940 0.002 LC3-II/LC3-I 0.98±0.09 0.91±0.09 4.22±0.45 147.178 ＜0.001 P62 2.59±0.42 2.56±0.39 0.84±0.12 26.342 0.001 RPMI 8266 Bax 0.80±0.09 0.66±0.08 2.67±0.35 82.736 ＜0.001 Bcl-2 1.19±0.20 1.30±0.22 0.58±0.07 14.511 0.005 LC3-II/LC3-I 0.94±0.10 0.87±0.09 4.04±0.39* 173.300 ＜0.001 P62 2.28±0.32 2.35±0.31 0.85±0.08* 31.477 ＜0.001

2.5 DOCK1 對AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 見表6。Western blot檢測顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，LV-DOCK1-shRNA2組的U266，RPMI 8266細(xì)胞中AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白p-AMPK表達(dá)水平明顯升高（tU266=9.804，tRPMI8266細(xì)胞=9.749，均P＜0.05），p-mTOR表達(dá)水平明顯降低（tU266= 9.468，tRPMI8266細(xì)胞=9.959，均P＜0.05），AMPK和mTOR表達(dá)無顯著變化；陰性對照組和空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），提示DOCK1 參與MM發(fā)生可能與其調(diào)控AMPK/mTOR通路有關(guān)。與LV-DOCK1-shRNA2+ hDOCK1組比較，LV-DOCK1-shRNA2組的U266，RPMI 8266細(xì)胞中AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白p-AMPK表達(dá)水平明顯升高（tU266=7.749，tRPMI8266細(xì)胞=6.927，均P＜0.05），p-mTOR表達(dá)水平明顯降低（tU266= 7.674，tRPMI8266細(xì)胞=7.215，均P＜0.05）。為驗(yàn)證DOCK1是否真能調(diào)控AMPK/mTOR通路發(fā)揮作用，研究在U266，RPMI 8266細(xì)胞的LV-DOCK1-shRNA2組中轉(zhuǎn)染重組人hDOCK1-pCXN2-Flag質(zhì)粒使DOCK1表達(dá)恢復(fù)，發(fā)現(xiàn)p-AMPK和p-mTOR表達(dá)水平也被逆轉(zhuǎn)得到恢復(fù)，見表6。證實(shí)DOCK1 確實(shí)可調(diào)控AMPK/mTOR通路來影響多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生。

表6 DOCK1 對AMPK/mTOR通路蛋白表達(dá)的影響（±s, n=3）

表6 DOCK1 對AMPK/mTOR通路蛋白表達(dá)的影響（±s, n=3）

細(xì)胞 蛋白 空白對照組 陰性對照組 LV-DOCK1-shRNA2組 LV-DOCK1-shRNA2+ hDOCK1組 F P U266 p-AMPK 1.00±0.12 1.14±0.11 2.67±0.30 1.35±0.24 40.542 ＜0.001 AMPK 1.02±0.10 1.00±0.09 1.04±0.12 1.03±0.11 0.079 0.970 p-mTOR 1.26±0.17 1.20±0.15 0.31±0.03 1.08±0.09 38.707 ＜0.001 mTOR 1.03±0.11 1.01±0.11 1.01±0.10 1.02±0.08 0.027 0.993 RPMI 8266 p-AMPK 1.01±0.09 1.08±0.10 2.91±0.37 1.56±0.27 40.892 ＜0.001 AMPK 1.04±0.13 1.10±0.12 1.13±0.15 1.11±0.14 0.245 0.862 p-mTOR 1.34±0.15 1.31±0.14 0.36±0.04 1.07±0.12 43.002 ＜0.001 mTOR 1.00±0.10 1.01±0.12 0.96±0.09 0.99±0.08 0.144 0.931

3 討論

DOCKs家族是一類具有鳥嘌呤核苷酸交換因子活性的蛋白家族，共包含11個(gè)家族成員[10]。其中DOCK1異常是多種免疫缺陷疾病的重要原因，既往研究報(bào)道DOCK1基因的異常表達(dá)與某些腫瘤的發(fā)病機(jī)制、治療和預(yù)后相關(guān)[11-12]，DOCK1過表達(dá)可促進(jìn)多種實(shí)體瘤的生長、轉(zhuǎn)移、侵襲等。除了在實(shí)體瘤中的促癌作用，有研究發(fā)現(xiàn)，DOCK1的過表達(dá)可導(dǎo)致急性髓系白血病的不良預(yù)后，其可能與干細(xì)胞特性、細(xì)胞增殖、遷移和趨化相關(guān)[13]。但目前DOCK1對MM的作用未曾涉及到。本研究首先探討了DOCK1對MM細(xì)胞增殖活性的影響，發(fā)現(xiàn)敲低DOCK1表達(dá)顯著抑制了MM細(xì)胞的增殖，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，提示DOCK1在MM中扮演促癌基因角色。

自噬是一種高度保守的由應(yīng)激誘導(dǎo)的能量代謝過程，在饑餓時(shí)通過降解回收細(xì)胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)和細(xì)胞器而得以存活，對細(xì)胞是一種保護(hù)機(jī)制[14]。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮既促進(jìn)、又抑制的雙重作用，一方面自噬可以作為一種防御機(jī)制，防止胞質(zhì)內(nèi)受損細(xì)胞器和代謝產(chǎn)物的堆積，保護(hù)受損的腫瘤細(xì)胞；另一方面，當(dāng)細(xì)胞過度自噬時(shí)可作為腫瘤的抑制機(jī)制，與凋亡共同促進(jìn)細(xì)胞死亡[15-16]。因此如何通過調(diào)節(jié)自噬達(dá)到抗腫瘤的目的仍需要更深層次的研究。LC3是檢測自噬活性最為常用的標(biāo)志蛋白，研究表明在自噬過程中LC3-I會轉(zhuǎn)化為LC3-II，LC3-II表達(dá)量與發(fā)生自噬的程度呈正比[17]。自噬上游表達(dá)增強(qiáng)或者下游降解阻斷，都會導(dǎo)致P62的聚集，最終P62會納入成熟的自噬體內(nèi)，并在自噬體內(nèi)降解，表明P62表達(dá)水平與自噬負(fù)相關(guān)，通常P62的水平與LC3-II/LC3-I的大小結(jié)合起來作為評價(jià)自噬水平的高低[18]。而本研究檢測結(jié)果顯示，敲低DOCK1表達(dá)明顯促進(jìn)了MM細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3-II的表達(dá)，而抑制了P62表達(dá)水平，提示DOCK1低表達(dá)可誘導(dǎo)MM細(xì)胞的自噬。

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[19]，二甲雙胍通過靶向AMPK/mTORC1和mTORC2通路可誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞自噬和G0/G1期細(xì)胞周期阻滯。AMPK/mTOR通路在細(xì)胞增殖、代謝、凋亡、基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞遷移中等發(fā)揮關(guān)鍵作用，AMPK在多種腫瘤中起到抑癌作用，激活A(yù)MPK可抑制mTOR磷酸化，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[20]。本研究探究發(fā)現(xiàn)，敲低DOCK1表達(dá)后AMPK/mTOR通路相關(guān)蛋白p-AMPK表達(dá)水平明顯升高，p-mTOR表達(dá)水平明顯降低；再次轉(zhuǎn)染恢復(fù)DOCK1表達(dá)后， AMPK和mTOR磷酸化水平被逆轉(zhuǎn)，提示DOCK1可能通過調(diào)控AMPK/mTOR通路，進(jìn)而調(diào)節(jié) MM細(xì)胞的增殖、凋亡和自噬，參與MM的發(fā)生發(fā)展。然腫瘤發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，DOCK1調(diào)控AMPK/mTOR通路影響MM發(fā)生的機(jī)制還需更進(jìn)一步的研究去探究證實(shí)。

綜上所述，DOCK1高表達(dá)可促進(jìn)MM細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞的凋亡和自噬，其可能通過調(diào)控AMPK/mTOR信號通路參與了MM的發(fā)生發(fā)展，DOCK1有望成為治療MM的潛在靶點(diǎn)。