青霉素結(jié)合蛋白3編碼基因ftsI在多重耐藥鮑曼不動桿菌中表達(dá)及碳青霉烯類誘導(dǎo)對其表達(dá)的影響

游鎧旭，魏 星，徐 革（成都醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院/成都市郫都區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,成都 611730）

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii，AB）是醫(yī)院感染最常見的病原菌之一，根據(jù)2018年全國耐藥檢測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示[1]，鮑曼不動桿菌檢出227 091株(位居革蘭陰性菌第四位)，其對碳青霉烯類藥物耐藥率高達(dá)56.1%，給臨床治療帶來極大的挑戰(zhàn)。目前研究發(fā)現(xiàn)[2]，鮑曼不動桿菌產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制有以下4個方面：①細(xì)菌合成滅活酶和修飾酶[3-4]；②細(xì)胞外膜通透性下降；③外排泵的主動外排活性增加；④抗生素作用的靶位發(fā)生改變，如青霉素結(jié)合蛋白（penicillin binding protein,，PBPs）功能改變等[5]。最后一種機(jī)制相關(guān)研究較少。PBPs于1972年由WILKE等[6]首次報(bào)道，因其能與青霉素共價(jià)結(jié)合而得名。PBPs是細(xì)菌胞漿膜上的微小蛋白質(zhì)，β 內(nèi)酰胺類抗生素可專一的與細(xì)菌PBPs結(jié)合，使肽聚糖的合成受到抑制，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，導(dǎo)致其死亡。若細(xì)菌PBPs含量或結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，可導(dǎo)致其與抗生素的親和力下降，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥[7-8]。鮑曼不動桿菌含有7種PBPs[9]，其中ftsI編碼PBP3，作為一種轉(zhuǎn)肽酶[10]，參與細(xì)菌肽聚糖合成，也是β-內(nèi)酰胺類抗生素的結(jié)合位點(diǎn)。最新研究[11-13]發(fā)現(xiàn)ftsI在多種細(xì)菌耐藥中起主要作用。但有關(guān)鮑曼不動桿菌中PBP3編碼基因ftsI的相關(guān)研究較少，課題組前期[14]對鮑曼不動桿菌中PBP1a編碼基因ponA進(jìn)行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)多重耐藥鮑曼不動桿菌（multi drug resistantAcinetobacter baumannii，MDR-AB）中PBP1a 蛋白構(gòu)象不同于敏感株（SDF）；碳青霉烯類抗生素誘導(dǎo)可導(dǎo)致MDR-AB中ponA 基因表達(dá)下調(diào)，在此基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步檢測MDR-AB中ftsI攜帶情況，分析與SDF株的空間結(jié)構(gòu)差異，探究碳青霉烯誘導(dǎo)對ftsI表達(dá)的影響，從基因水平上對ftsI在MDR-AB耐藥中的作用進(jìn)行初步了解，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 采集2019年1月～6月成都市郫都區(qū)人民醫(yī)院經(jīng)臨床分離所得MDR-AB，待將重復(fù)菌株剔除后，合計(jì)得到38株菌株。其中26株(68.42%)源自痰液，6株(15.79%)源于血液，4株(10.53%)源于分泌物，2株(5.26%)源于尿液。38株菌對慶大霉素（GEN）、美羅培南（MEM）、妥布霉素（TOB）、亞胺培南（IMP）等抗生素耐藥率較高，達(dá)70%以上；對頭孢哌酮/舒巴坦（SCF）的耐藥率為57.89%。沒有檢出對多黏菌素B（POL）耐藥的菌株。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌（E.coli）ATCC25922與銅綠假單胞菌（P.Aeruginosa）ATCC27853。

1.2 儀器與試劑 抗生素亞胺培南(imipenem)、美羅培南(meropenem)、多尼培南(donipenem)購于北京索萊寶；DNA提取試劑盒，總RNA提取試劑盒，qRT-PCR試劑購于大連 Takara 公司。所用儀器為實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（上海宏石產(chǎn)品），在菌株鑒定與藥敏方面，所應(yīng)用的儀器為細(xì)菌鑒定與藥敏分析儀（國產(chǎn)美華，MA120型）。

1.3 方法

1.3.1 ftsI基因檢測：將收集的鮑曼不動桿菌菌株取出，室溫復(fù)蘇，在巧克力平板上分區(qū)劃線，37℃培養(yǎng)18～20h，之后挑取單菌落于含200μl 無菌超純水的離心管中，按細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書步驟提取鮑曼不動桿菌DNA。ftsI編碼基因長度為1 977 bp，長度較長，采用分段擴(kuò)增的方式進(jìn)行PCR。借助GeneBank與NCBI查詢鮑曼不動桿菌（AB）ftsI基因序列，借助軟件primer 5.0完成引物的設(shè)計(jì)，其合成工作則由上海生工負(fù)責(zé)。引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系借鑒前期實(shí)驗(yàn)條件開展，PCR反應(yīng)量為0.05ml，條件：預(yù)變性 5min，95℃；變性，30s，94℃；退火，30s ，55℃；延伸，30s，72℃；合計(jì)35個循環(huán)。準(zhǔn)備5μl擴(kuò)增產(chǎn)物，用來進(jìn)行瓊脂糖凝膠（1g/dl）電泳處理，計(jì)時(shí)10 ～20min。

表1 檢測ftsI基因引物序列

1.3.2 測序分析：將38株MDR-AB擴(kuò)增后的PCR條帶切膠回收，送上海生工進(jìn)行測序分析。所測得ftsI基因序列，用DNAMAN軟件拼接成后通過Chromas軟件讀取，使用BLAST Search進(jìn)行比對。

1.3.3 耐藥菌株與敏感株（SDF）ftsI編碼蛋白結(jié)構(gòu)比較：選擇菌株MDR-AB-1作為代表菌株進(jìn)行研究，將MDR-AB-1 與敏感株（SDF ）ftsI基因序列翻譯成的氨基酸序列通過Swiss-Model Workplace進(jìn)行同源建模（模板為PDB.4kqr.1.A亞單位），Swiss-Pdb Viewer 4.0作相似性分析。作為比對的敏感株（SDF）來源：(SDF, NC-010400.1，European Bioinformatics Institute，) ，ftsI基因序列下載自基因組數(shù)據(jù)庫(www.biocyc.org)。

1.3.4 碳?xì)涿瓜╊愓T導(dǎo)過程觀察：自1.3.1步驟已復(fù)蘇菌株中挑單菌落洗脫到LB液體培養(yǎng)基（10ml）內(nèi)，35℃振蕩培養(yǎng)16～18h，取菌液5ml轉(zhuǎn)入12孔細(xì)菌培養(yǎng)板中，分別添加1類碳青霉烯類抗生素（亞胺培南、美羅培南、多尼培南）當(dāng)做誘導(dǎo)劑，調(diào)整抗生素最終濃度為1mg/L，作用1h后，將菌液吸入無菌離心管，15 000r/min離心10min，吸棄上清液并收集細(xì)菌待下一步試驗(yàn)。

1.3.5 qPCR定量檢測ftsI表達(dá)：使用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）對誘導(dǎo)前后鮑曼不動桿菌青霉素結(jié)合蛋白3 (PBP3)編碼基因ftsI轉(zhuǎn)錄的mRNA進(jìn)行定量檢測。根據(jù)RNA提取試劑盒所示步驟，完成細(xì)菌RNA的提取收集。取模板5μl加入反應(yīng)體系及引物，總體積為20μl，擴(kuò)增。內(nèi)參基因是16sRNA，引物序列如下[14]：F: 5’-CAGCTCGTGTCGTGAGATGT-3’；R:5’-CGTAAGGGCCATGATGACTT-3’，反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)，42℃，60 min；預(yù)變性環(huán)節(jié)，95℃，1min；變性環(huán)節(jié)，94℃，0.5 min；退火環(huán)節(jié)，56℃，20s；延伸環(huán)節(jié)，72℃，0.5min；熒光收集，80℃，8 s，合計(jì)安排35個循環(huán)。采用相對定量（2-△△Ct）法計(jì)算鮑曼不動桿菌ftsI在碳?xì)涿瓜╊愓T導(dǎo)前后表達(dá)情況。將抗生素誘導(dǎo)后檢測的Ct值作為試驗(yàn)組，對應(yīng)的誘導(dǎo)前的Ct值作為對照組，內(nèi)參基因的Ct值作為參考，根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)數(shù)據(jù)，計(jì)算ftsI基因的相對表達(dá)情況，并與對照組作出比較。數(shù)據(jù)用三個復(fù)孔Ct值的平均數(shù)，具體的計(jì)算方法如下：

ΔCt試驗(yàn)組=Ct試驗(yàn)組ftsI基因-Ct試驗(yàn)組16sRNA基因

ΔCt對照組=Ct對照組ftsI基因-Ct對照組16sRNA基因

-ΔΔCt=ΔCt對照組-ΔCt試驗(yàn)組

2-△△Ct值為ftsI基因的表達(dá)差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用 SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件，采用方差分析對多組間數(shù)據(jù)比較，數(shù)據(jù)表示方式為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），結(jié)果為P＜0.05說明對比組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鮑曼不動桿菌ftsI基因表達(dá)及突變情況

2.1.1 ftsI基因擴(kuò)增結(jié)果：部分菌株凝膠電泳結(jié)果見圖1。由于ftsI基因長度約2 000bp，因此采用分2段擴(kuò)增的方法，均擴(kuò)增出ftsI基因。

圖1 部分菌株ftsI凝膠電泳圖

2.1.2 測序分析：將38株MDR-AB測序結(jié)果均一致，與美國國立生物信息中心GenBank 中標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 17978 ftsI基因(登錄號為CP000521.1）序列號進(jìn)行比較，99.54%同源，僅第1544位的C＞T。

2.1.3 MDR-AB-1菌株與SDF株ftsI基因序列分析和氨基酸同源建模分析：將MDR-AB-1株 ftsI基因序列與SDF株序列相比較，99%同源，存在7處差異。分別是第186位A＞G，第255位G＞A，第395位G＞C，第496位A＞G，第685位C＞T，第771位A＞G和第820位A＞T。

將基因序列翻譯成的氨基酸序列進(jìn)行同源建模（模板為PDB.4kqr.1.A亞單位）Swiss-Pdb Viewer 4.0作相似性分析，見圖2。圖中，MDR-AB-1菌株ftsI編碼蛋白PBP3空間結(jié)構(gòu)由紅色表示，SDF菌株P(guān)BP3空間結(jié)構(gòu)由白色表示，MDR-AB-1菌株P(guān)BP3空間結(jié)構(gòu)與SDF菌株存在的差異主要是SDF菌株多出251號位賴氨酸，252號位蘇氨酸，253號位甘氨酸和254號位纈氨酸組成的一個無規(guī)則卷曲部分。

圖2 MDR-AB-1株與SDF株P(guān)BP3蛋白分子三維立體結(jié)構(gòu)比較

2.2 碳?xì)涿瓜┱T導(dǎo)后耐藥菌株fstI基因表達(dá)檢測 見表2。38株鮑曼不動桿菌經(jīng)三種碳青霉烯誘導(dǎo)后，MDR-AB基因表達(dá)相對于未處理組均出現(xiàn)不同程度的變化，亞胺培南組、美羅培南組ftsI表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），多尼培南組誘導(dǎo)變化不明顯。

表2 碳青霉烯誘導(dǎo)后ftsI相對表達(dá)結(jié)果

3 討論

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii，AB）是臨床中一類廣泛發(fā)生的可導(dǎo)致院內(nèi)感染的革蘭陰性桿菌，這些年，對于碳青霉烯類抗生素鮑曼不動桿菌所表現(xiàn)出的耐藥率一直居高不下[1,15]，全國耐藥率均值在50%以上，局部區(qū)域甚至高達(dá)80%，并且鮑曼不動桿菌不僅對多種青霉素類及頭孢菌素類抗生素天然耐藥，且在使用敏感藥物治療過程中極易產(chǎn)生獲得性耐藥，可選用的抗生素越來越少，給臨床治療帶來極大的困難。在對鮑曼不動桿菌耐藥機(jī)制的研究過程中[2,16]產(chǎn)碳青霉烯酶[4,17]，喪失膜孔蛋白或此蛋白表達(dá)減少，外排泵活性提高等相關(guān)分析比較全面，然而較少涉及青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）的分析。

青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）是構(gòu)成細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的重要蛋白，參與細(xì)菌肽聚糖合成，維持形態(tài)結(jié)構(gòu)等功能，是細(xì)菌生長中不可缺少的物質(zhì)[2,18]。按照在SDS-PAGE中的分子量、PBPs氨基酸序列、在細(xì)胞中的功能等三個方面，細(xì)菌PBPs可分成兩組[19]：高分子量組(high-molecular-mass，HMM)與低分子量組(LMM) 的PBPs。β-內(nèi)酰胺類抗生素主要與HMM組結(jié)合，從而抑制β-內(nèi)酰胺酶活性殺死細(xì)菌[20]。已有的報(bào)道顯示[9,21]，鮑曼不動桿菌含 有7種PBPs（PBP1a，PBP1b，PBP2，PBP3，PBP5/6，PBP6，PBP7），PBPs編碼基因突變或表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致與β-內(nèi)酰胺類的親和力減弱，細(xì)菌形成耐藥[22]。

PBP3與細(xì)菌分裂有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)[18]，細(xì)菌DNA 復(fù)制完成，隨后ftsI基因編碼PBP3被激活，幾乎同一時(shí)間，催化發(fā)生羧基酶反應(yīng)，肽聚糖合成反應(yīng)。張洋洋等[23]對62株鮑曼不動桿菌進(jìn)行全基因序列分析發(fā)現(xiàn)，碳青霉烯耐藥株（CRAB）與碳青霉烯敏感株（CSAB）相比較，PBP1b，PBP3，PBP5/6，PBP6和PBP7氨基酸序列存在差異改變，并從蛋白組學(xué)的角度推測鮑曼不動桿菌PBPs與碳青霉烯類藥物抗性相關(guān)。前期，本課題組[359051616]已發(fā)現(xiàn)鮑曼不動桿菌PBP1a編碼基因ponA在耐藥過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本課題進(jìn)一步對ftsI進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)38株MDR-AB中，ftsI基因檢測率100%，測序結(jié)果顯示，相較于敏感株（SDF），有基因突變發(fā)生，將基因序列翻譯成氨基酸序列，Swiss-Model Workplace同源建模后發(fā)現(xiàn)耐藥株與SDF株P(guān)BP3空間結(jié)構(gòu)存在顯著差異，這可導(dǎo)致與β-內(nèi)酰胺類藥物親和力下降，可能是鮑曼不動桿菌產(chǎn)生耐藥的因素之一。

此外，研究發(fā)現(xiàn)[24-26]細(xì)菌在亞最低抑菌濃度（亞-MIC）作用下，細(xì)菌會變得更加適應(yīng)環(huán)境，表現(xiàn)為耐藥性增加、毒力增強(qiáng)、生物膜形成能力增加等。本實(shí)驗(yàn)采用亞-MIC濃度的3種碳青霉烯類抗生素對MDR-AB進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)ftsI基因表達(dá)發(fā)生不同程度改變，其中亞胺培南組、美羅培南組ftsI基因表達(dá)較誘導(dǎo)前明顯下調(diào)。有關(guān)亞胺培南能夠于體外誘導(dǎo)AB的PBP基因ponA(PBP1a)，ftsI(PBP3)， dacC (PBP5/6) PBPs異常表達(dá)已被證實(shí)[27]，本文進(jìn)一步證實(shí)MEM誘導(dǎo)可導(dǎo)致鮑曼不動桿菌ftsI 的表達(dá)顯著下調(diào)，但多尼培南的誘導(dǎo)效果不顯著，可能是不同種類的碳?xì)涿瓜╊惪股氐姆肿咏Y(jié)構(gòu)不同，作用PBP的主要靶位不同導(dǎo)致[7]。

實(shí)驗(yàn)不足之處在于尚不能證明ftsI 在鮑曼不動桿菌耐藥過程中是否起主要作用，以及PBP3與其余6種PBPs相互間的關(guān)系，需要后期進(jìn)一步深入研究。對PBPs在鮑曼不動桿菌耐藥機(jī)制中的研究，可進(jìn)一步揭示其耐藥機(jī)制的復(fù)雜性，為臨床科學(xué)使用抗生素和有針對性地研發(fā)新的抗生素提供科學(xué)依據(jù)。