miR-146b-5p對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖抑制及克隆形成的機(jī)制研究

姜富祥，阿爾賓，高 飛，王 興

（內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市醫(yī)院脊柱外科，內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000）

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一種高度惡性的骨架癌，起源于間充質(zhì)組織中梭形細(xì)胞的未成熟類骨質(zhì)基質(zhì)，是青少年最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤[1-2]。目前手術(shù)、放化療是OS的主要治療方式，針對(duì)OS的靶向治療藥物仍在研究[3]，然而臨床治療效果有限，故深入研究OS的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，找尋針對(duì)OS的新的有效治療方法及分子標(biāo)志物意義重大。微小核糖核酸分子（micro RNA，miRNA）是具有15～25個(gè)核苷酸的小非編碼RNA（small non-coding RNA）調(diào)控分子，其可與基因3’UTR區(qū)結(jié)合發(fā)揮功能，具有廣泛的生物學(xué)功能，研究證實(shí)miRNA參與了細(xì)胞凋亡、新陳代謝、發(fā)育、增殖和細(xì)胞分化等生物學(xué)過程[4-7]。近年發(fā)現(xiàn)，miR-146b-5p與許多人類惡性腫瘤有關(guān)，例如在乳腺癌中，lncRNA NEAT1通過抑制miR-146b-5p表達(dá)可促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移[8]。miR-146b-5p通過調(diào)節(jié)IRAK1/NF-κB通路提高非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)酪氨酸激酶抑制劑的敏感度[9]。證實(shí)miR-146b-5p可抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及細(xì)胞遷移和侵襲等多種致癌途徑[10-12]，在人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，可作為新的腫瘤分子研究靶標(biāo)。有研究顯示，miR-146b-5p在OS中過表達(dá)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，但miR-146b-5p在OS細(xì)胞增殖中的相關(guān)分子機(jī)制尚在探索階段。故本研究通過體外細(xì)胞試驗(yàn)擬探究miR-146b-5p在OS中的表達(dá)與其對(duì)OS細(xì)胞增殖和克隆形成的影響及相關(guān)分子機(jī)制，以期為OS的臨床診治提供新的研究靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 人骨肉瘤細(xì)胞U2OS細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)在含10g/dl胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，加入青霉素100 IU/ml和鏈霉素100 μg/ml，在37℃，5ml/dl CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取2018年1月～2020年12月內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市醫(yī)院病理科留存的30例骨肉瘤組織及對(duì)應(yīng)正常組織樣品，均經(jīng)病理確認(rèn)為骨肉瘤，術(shù)前未行任何相關(guān)治療，組織樣本來源于手術(shù)獲取，低溫液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器及試劑 DMEM培養(yǎng)液（美國(guó)HyClone公司）；鏈霉素、青霉素、胰酶（美國(guó)Gibco公司）；Lipofectamine 2000（北京優(yōu)尼康生物科技有限公司）；酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；MTS細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、克隆形成檢測(cè)試劑盒（美國(guó)corning公司）；PCR儀（美國(guó)ABI公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；雙熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)（北京Promega公司）；蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽（美國(guó)Bio-Rad公司），DUSP16抗體（美國(guó)SigmaAldrich公司）；miR-146b-5p引物 序 列，miR-146b-5p mimics，miR-146b-5p ASO（反義核酸）及siRNA-DUSP16和無義序列siCTL由上海吉瑪生物制藥有限公司設(shè)計(jì)合成；DUSP16-3’UTR-WT野生型質(zhì)粒和DUSP16-3’UTR-MUT突變型質(zhì)粒報(bào)告基因載體（美國(guó)Promega公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組：待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%左右時(shí)，按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書將NC-mimics，miR-146b-5p mimics，NC-ASO，miR-146b-5p-ASO及siRNA-DUSP16和siCTL分別轉(zhuǎn)染至U2OS細(xì)胞，設(shè)為miR-146b-5p陰性過表達(dá)組（NC-mimics組），miR-146b-5p過表達(dá)組（miR-146b-5p mimics組）和miR-146b-5p陰性抑制組（NC-ASO），miR-146b-5p抑制組（miR-146b-5p-ASO組）及DUSP16敲低表達(dá)組（shDUSP16），DUSP16對(duì)照組（siCTL組）；更換DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)（qRT-PCR）：取轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞采用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板配置RCR反應(yīng)體系行RT-PCR擴(kuò)增分析。miR-146b-5p引物序列：上 游5’- CGTGCCACTGACAAGTGAAT-3’,下 游5’-CGACCAGAACTCAGTCGACA-3’；內(nèi)參GAPDH上 游5’- GTCACAGCATTTGCTCGTATTG-3’,下 游5’-CTCCTGCAACATCGTGATCGG-3’；反應(yīng)條件:95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)。試驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

1.3.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞以1×107個(gè)/孔接種于96孔板，每孔設(shè)3個(gè)生物復(fù)孔，37 ℃，5ml/dl CO2孵育待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染；配制MTS反應(yīng)液，每孔加入MTS液 100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，在490 nm處測(cè)量各孔吸光度值（A值），繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，試驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

1.3.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)：待各組細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔設(shè)3個(gè)生物復(fù)孔，培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，收集細(xì)胞，PBS洗滌兩次，去除多余洗滌液，用含0.5g/dl結(jié)晶紫的甲醇溶液固定15 min，水洗、晾干，Giemsa染色30 min，在590 nm處測(cè)A值，試驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

1.3.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：將轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞接種到6孔板，待其生長(zhǎng)密度為90%時(shí)將含有海腎熒光素酶的DUSP16-3’UTR-WT野生型和DUSP16-3’UTR-MUT突變型質(zhì)粒及miR-146b-5p轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，采用雙熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)進(jìn)行熒光素酶活性測(cè)定，試驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

1.3.6 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞加入裂解液提取總蛋白，并測(cè)定其濃度及純度；取定量蛋白制樣，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5g/dl脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜；洗膜3次，加入二抗室溫孵育1 h，洗膜3次，化學(xué)發(fā)光，暗房顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

1.3.7 miR-146b-5p靶標(biāo)預(yù)測(cè)：通過microRNA網(wǎng)站進(jìn)行預(yù)測(cè)miR-146b-5p與DUSP16的結(jié)合位點(diǎn)，行進(jìn)一步研究。

1.3.8 DUSP16與骨肉瘤預(yù)后的相關(guān)性：通過公共osteosarcoma R2數(shù)據(jù)庫(kù)http://r2.amc分析DUSP16與骨肉瘤預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)；多組間差異比較采用oneway ANOVA分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；骨肉瘤組織及其對(duì)應(yīng)正常組織中表達(dá)差異比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤中miR-146b-5p表達(dá) 見圖1。qRTPCR檢測(cè)顯示，30組骨肉瘤組織中miR-146b-5p表達(dá)（4.096±1.237）較鄰近正常組織（5.895±0.834）顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.605，P＜0.001）。

圖1 miR-146b-5p在骨肉瘤組織及鄰近正常組織中的表達(dá)

2.2 過表達(dá)和敲低miR-146b-5p效率驗(yàn)證 qRTPCR檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染miR-146b-5p mimics組細(xì)胞中miR-146b-5p表達(dá)（4.562±0.026）較NC-mimics組（1.003±0.002）明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=236.393，P＜0.001）；轉(zhuǎn)染miR-146b-5p-ASO組細(xì)胞中miR-146b-5p表達(dá)（0.394±0.002）較NCASO組（1.251±0.003）明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=411.689，P＜0.001），表明過表達(dá)和敲低miR-146b-5p表達(dá)的骨肉瘤細(xì)胞系構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 miR-146b-5p對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖及克隆形成的影響 見表1。增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，miR-146b-5p過表達(dá)明顯抑制了骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力（t=13.233～34.599，均P＜0.01），敲低miR-146b-5p表達(dá)則顯著促進(jìn)了骨肉瘤細(xì)胞的增殖（t=7.610～9.247，均P＜0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，miR-146b-5p mimics組細(xì)胞克隆形成率（48.912±2.032）較NCmimics組（160.834±9.031）明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=20.942，P＜0.001）；miR-146b-5p-ASO組細(xì)胞克隆形成率（239.658±11.034）較NCASO組（128.502±2.413）明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.046，P＜0.001）。

表1 過表達(dá)和敲低miR-146b-5p對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響（A值，± s）

表1 過表達(dá)和敲低miR-146b-5p對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響（A值，± s）

時(shí)間 NC-mimics組 miR-146b-5p mimics組 t P NC-ASO組 miR-146b-5p-ASO組 t P第1天 0.153±0.003 0.152±0.006 0.258 0.808 0.152±0.004 0.153±0.005 0.271 0.800第2天 0.262±0.002 0.199±0.008 13.233 0.000 0.273±0.004 0.349±0.016 7.982 0.001第3天 0.382±0.006 0.248±0.003 34.599 ＜0.001 0.381±0.008 0.458±0.012 9.247 0.001第4天 0.459±0.015 0.297±0.013 14.136 0.000 0.457±0.017 0.554±0.013 7.851 0.001第5天 0.495±0.013 0.318±0.015 15.445 0.000 0.496±0.021 0.612±0.016 7.610 0.002

2.4 miR-146b-5p靶基因的預(yù)測(cè)驗(yàn)證及調(diào)控關(guān)系見圖2。 檢索microRNA網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)，miR-146b-5p與DUSP16 3’UTR區(qū)域存在靶向結(jié)合位點(diǎn)（圖2a）。研究將DUSP16-3’UTR-WT和DUSP16-3’UTRMUT質(zhì)粒載體及miR-146b-5p 共轉(zhuǎn)染至U2OS細(xì)胞，經(jīng)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顯示，轉(zhuǎn)染miR-146b-5p mimics組DUSP16-3’UTR-WT熒光素酶活性（0.394±0.002）較NC-mimics組（1.001±0.002）顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=371.710，P＜0.001）；而DUSP16-3’UTR-MUT熒光素酶活性（0.998±0.003）較NC-mimics組（1.001±0.001）無顯著改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.643，P=0.176）（圖2b），證實(shí)DUSP16是miR-146b-5p的潛在靶基因。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，miR-146b-5p mimics組細(xì)胞中DUSP16表達(dá)（0.231±0.013）較NC-mimics組（1.011±0.002）明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=102.715，P＜0.001），相反的miR-146b-5p-ASO組細(xì)胞中DUSP16表達(dá)（3.264±0.026）較NC-ASO組（1.009±0.003）明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=149.232，P＜0.001），說明miR-146b-5p負(fù)向調(diào)控DUSP16表達(dá)。

圖2 miR-146b-5p靶基因的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

2.5 DUSP16在骨肉瘤中的表達(dá)特征及miR-146b-5p與DUSP16的調(diào)控關(guān)系驗(yàn)證 見圖3，表2。30組骨肉瘤組織中DUSP16表達(dá)（5.683±0.457）相比鄰近正常組織（4.665±0.531）顯著高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.959，P＜0.001），與miR-146b-5p在骨肉瘤中的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.667，P＜0.05）；通過osteosarcoma R2數(shù)據(jù)庫(kù)http://r2.amc分析發(fā)現(xiàn)DUSP16具有明顯的高表達(dá)預(yù)后差特征（圖3a）。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過表達(dá)miR-146b-5p顯著抑制細(xì)胞增殖，在miR-146b-5p mimics組細(xì)胞中過表達(dá)DUSP16后細(xì)胞增殖速率回歸到正常水平，在NC-mimics組中過表達(dá)DUSP16后細(xì)胞增殖速率較之前明顯升高（圖3b，表2），說明miR-146b-5p通過負(fù)調(diào)控DUSP16表達(dá)在骨肉瘤細(xì)胞中發(fā)揮功能。

表2 miR-146b-5p調(diào)控DUSP16對(duì)細(xì)胞增殖的影響（A值，±s）

表2 miR-146b-5p調(diào)控DUSP16對(duì)細(xì)胞增殖的影響（A值，±s）

注：*與NC-mimics組相比，t=13.338, 33.359, 60.381, 96.851; 12.568, 32.564, 59.051, 95.763; 22.059, 28.593, 33.250, 63.479, 均P＜0.001；#與miR-146b-5p-mimics組相比，t=12.825, 33.359, 11.172, 97.214, 均P＜0.001。

時(shí)間 NC-mimics組 miR-146b-5pmimics組miR-146b-5pmimics+vector組miR-146b-5pmimics+DUSP16組NC-mimics+DUSP16組 F P第1天 0.177±0.001 0.174±0.003 0.172±0.001 0.175±0.002 0.174±0.002 2.605 0.100第2天 0.298±0.002 0.246±0.004* 0.249±0.003 0.296±0.002# 0.384±0.009* 409.447 ＜0.001第3天 0.401±0.002 0.275±0.003* 0.278±0.002 0.401±0.003# 0.509±0.009* 1356.056 ＜0.001第4天 0.523±0.003 0.296±0.004* 0.301±0.001 0.254±0.004# 0.398±0.008* 1651.033 ＜0.001第5天 0.566±0.002 0.299±0.003* 0.302±0.002 0.567±0.002# 0.741±0.006* 2631.974 ＜0.001

圖3 骨肉瘤中DUSP16表達(dá)特征及其與miR-146b-5p的調(diào)控關(guān)系驗(yàn)證

2.6 miR-146b-5p調(diào)控DUSP16參與P53信號(hào)通路在骨肉瘤中發(fā)揮作用 見圖4。研究經(jīng)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染siRNA敲低DUSP16表達(dá)，發(fā)現(xiàn)siDUSP16組P53磷酸化水平（1.342±0.019）較轉(zhuǎn)染無義序列siCTL組（0.452±0.013）顯著升高（t=66.960，P＜0.001），同時(shí)P53靶基因P21（腫瘤抑制子）表達(dá)（3.136±0.145）也較siCTL組（1.110±0.014）顯著升高（t=24.089，P＜0.001），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4a），說明在骨肉瘤中DUSP16可參與調(diào)控P53信號(hào)通路。進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，miR-146b-5p mimics組細(xì)胞中P21表達(dá)（4.995±0.214）較NC-mimics組（1.001±0.002）顯著升高（t=32.325，P＜0.001）；在過表達(dá)miR-146b-5p組細(xì)胞中再次過表達(dá)DUSP16后，P21表達(dá)（0.986±0.012）較單獨(dú)過表達(dá)miR-146b-5p組顯著降低（t=32.398，P＜0.001）（圖4b），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此說明miR-146b-5p通過靶向調(diào)控DUSP16表達(dá)在骨肉瘤中發(fā)揮作用是通過P53信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。

圖4 miR-146b-5p調(diào)控DUSP16參與P53信號(hào)通路在骨肉瘤中發(fā)揮作用

3 討論

骨肉瘤（OS）占兒童惡性腫瘤的2.4%，惡性程度高，易侵犯周圍軟組織，常發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移至肺及骨骼等部位，約10%～20% OS患者診斷時(shí)已發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，預(yù)后明顯惡性[13]。且據(jù)報(bào)道，非轉(zhuǎn)移性O(shè)S患者5年生存率可達(dá)80.5%，轉(zhuǎn)移性O(shè)S患者5年生存率僅為15%～30%[14]。故基于分子生物學(xué)角度探究OS發(fā)生、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，找尋新的有效的OS治療靶標(biāo)對(duì)提高患者預(yù)后意義顯著。

近年研究發(fā)現(xiàn)miRNA可通過堿基互補(bǔ)方式與靶基因3’-UTR區(qū)結(jié)合，降解mRNA或抑制mRNA翻譯，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞多種生物學(xué)過程，參與腫瘤的惡性發(fā)展[15,6,8]。miRNAs表達(dá)失調(diào)是腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的誘因[8]。大量研究證實(shí)，不同miRNAs異常表達(dá)與OS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及不良預(yù)后相關(guān)，如miRNA-505，miR-210-5p和microRNA-320a等[16-18]，由此可見mRNAs在OS中的發(fā)生及轉(zhuǎn)移中起著重要作用。miR-146b是近年研究新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，位于第10號(hào)染色體，包含miR-146b-3p和miR-146b-5p兩種形式，其中后者在人肝臟、脾臟組織中呈不同程度高表達(dá)[12]。而在腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-146b-5p缺失通過IL-17A途徑能夠促進(jìn)T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的遷移和侵襲[19]。通過碘參與下調(diào)miR-146b-5p可抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖[10]。lnc-AL445665.1-4可能通過與miR-146b-5p的相互作用參與了子宮多發(fā)平滑肌瘤的發(fā)生發(fā)展[11]。lncRNA-NEAT1通過miR-146b-5p/NOTCH1信號(hào)通路促進(jìn)了T細(xì)胞急性淋巴母細(xì)胞白血病(T-ALL)細(xì)胞的增殖[20]。此外還發(fā)現(xiàn)，miR-146b-5p在乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等人類惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)[21]，提示其可能作為抑癌基因發(fā)揮作用，參與惡性腫瘤的發(fā)展進(jìn)程，可作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。本研究顯示，骨肉瘤組織中miR-146b-5p顯著低表達(dá)，其過表達(dá)能夠抑制OS細(xì)胞的增殖和克隆形成，發(fā)揮抑癌基因特性，故探究其發(fā)揮作用的分子機(jī)制意義重大。

本研究檢索生物學(xué)信息數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)miR-146b-5p與DUSP16存在結(jié)合位點(diǎn)，經(jīng)熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)DUSP16是miR-146b-5p的靶基因。研究表明，雙重特異性磷酸酶16（DUSP16，也稱為促分裂原活化的蛋白激酶磷酸酶7）通過減弱磷酸絲氨酸/蘇氨酸和磷酸酪氨酸殘基（例如p38和JNK途徑21）的磷酸化可抑制其靶激酶的活化[22]。DUSP16表達(dá)調(diào)節(jié)能夠控制ERK和p38 MAP激酶活性，介導(dǎo)化療誘導(dǎo)的乳腺癌干細(xì)胞富集[23]。靶向DUSP16/TAK1信號(hào)通過抑制JNK MAPK減輕高脂飲食(HFD)小鼠的肝臟血脂異常和炎癥[24]。并發(fā)現(xiàn)DUSP16表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)人類肝癌細(xì)胞的增殖[25]。CircDUSP16通過調(diào)控miR-497-5p/TKTL1軸促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞發(fā)育[26]。CircDUSP16通過海綿化miR-145-5p促進(jìn)了胃癌的發(fā)生和侵襲[27]。而本研究中發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織中DUSP16顯著高表達(dá)，具有明顯的高表達(dá)預(yù)后差特征，與miR-146b-5p存在顯著負(fù)相關(guān)，暗示了DUSP16的癌基因?qū)傩浴＝?jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)證實(shí)， DUSP16過表達(dá)促進(jìn)了OS細(xì)胞增殖，miR-146b-5p對(duì)OS細(xì)胞的增殖調(diào)控與其對(duì)DUSP16表達(dá)的調(diào)控相關(guān)。作用機(jī)制方面，既往研究報(bào)道在三陰性乳腺癌化療過程中，DUSP16 表達(dá)顯著降低導(dǎo)致p38被激活，從而促進(jìn)了化療耐藥乳腺癌干細(xì)胞表型的規(guī)范，為臨床治療提供了新靶點(diǎn)[23]。既往HAO等[28]也報(bào)道，小鼠模型中DUSP1可抑制p38 MAPK磷酸化，導(dǎo)致HCC細(xì)胞中P53磷酸化增強(qiáng)，從而激活p53和p21并誘導(dǎo)其表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的凋亡。所以本研究進(jìn)一步探究了miR-146b-5p調(diào)控DUSP16對(duì)P53信號(hào)通路的影響，發(fā)現(xiàn)敲低DUSP16可促使P53磷酸化及P53靶基因P21表達(dá)顯著升高，證實(shí)miR-146b-5p調(diào)控DUSP16可能通過P53信號(hào)通路參與了OS的發(fā)生發(fā)展。故繼續(xù)探究miR-146b-5p調(diào)控DUSP16對(duì)P53信號(hào)通路的影響機(jī)制可為OS的診斷及治療提供更加有效的參考靶標(biāo)。

綜上所述，OS中miR-146b-5p低表達(dá)通過靶向負(fù)調(diào)控DUSP16參與OS細(xì)胞的增殖及克隆形成，與P53信號(hào)通路關(guān)系密切。