結(jié)直腸癌組織miR-485-5p，miR-1207-3p和miR-590-3p水平表達(dá)與臨床病理特征及生存的相關(guān)性研究

馬勝輝，崔雪琴，李建華，王 翔

（1.承德市中心醫(yī)院腫瘤科,河北承德067000；2.河北省老年病醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，石家莊050011）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer, CRC）是人類主要的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率位于肺癌和肝癌之后,排在第三位；而死亡率則排在肺癌、肝癌和胃癌之后,是第四大致死性疾病，因此早期診斷和治療對(duì)降低死亡率具有重要的作用[1]。目前臨床上對(duì)于結(jié)直腸癌的具體發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，尋找簡(jiǎn)便有效的診斷及患者預(yù)后的標(biāo)志物對(duì)指導(dǎo)臨床治療尤為重要。有研究發(fā)現(xiàn)微小核糖核酸（microRNA, miRNA）在此病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[2]。有學(xué)者認(rèn)為[3-4]，miR-485-5p可能作為抑癌基因在結(jié)直腸癌中發(fā)揮作用,并對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡和周期有顯著影響。且有研究發(fā)現(xiàn)[5]，miR-1207-3p可通過(guò)抑制X 射線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因(X ray repair cross complementing gene, XRCC6)表達(dá)量來(lái)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29的凋亡。另有研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，miR-590-3p可促進(jìn)條件性編程細(xì)胞(conditional reprogramming cell, CRC)發(fā)生順鉑耐藥，其機(jī)制可能參與調(diào)控多亮氨酸重復(fù)區(qū)免疫球蛋白樣蛋白 1(leucine- rich repeats and immunoglobulinlike domains 1, LRIG1)進(jìn)而促進(jìn)多藥耐藥基因(multidrugresistance gene, MDRI)表達(dá)及減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。因此，本文對(duì)miR-485-5p，miR-1207-3p和miR-590-3p在結(jié)直腸癌患者演進(jìn)過(guò)程中的表達(dá)變化進(jìn)行研究，為結(jié)直腸癌的研究提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年1月～2020年1月承德市中心醫(yī)院病理科歸檔的資料齊全完整的84例結(jié)直腸癌組織石蠟標(biāo)本，患者年齡47～74歲，平均年齡63.17±6.18歲，病程1～3.5年，平均病程2.13±1.19年，癥狀：腹瀉28例，便秘30例，腹痛26例，此次研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后，所有研究對(duì)象及家屬均簽署了知情同意書(shū)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均符合《國(guó)家癌癥中心中國(guó)結(jié)直腸癌篩查與早診早治指南》[8]中對(duì)結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)影像學(xué)、病理組織學(xué)確診；②所有研究對(duì)象均未行放化療、靶向治療或者免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①結(jié)直腸癌晚期患者；②并發(fā)其他腫瘤者；③凝血功能異常者；④復(fù)發(fā)者；⑤認(rèn)知功能障礙者；⑥溝通障礙者；⑦全身感染性疾病者。

1.2 儀器與試劑 miR-485-5p，miR-1207-3p和miR-590-3p采用熒光定量PCR儀7300型（美國(guó)ABI公司），反轉(zhuǎn)錄酶、RT-PCR試劑盒（大連寶生物公司）。

1.3 方法 取患者直腸組織后置入10g/dl的甲醛溶液中固定24min，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，進(jìn)行連續(xù)切片，在取出樣本中的組織采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)miR-485-5p，miR-1207-3p和miR-590-3p表達(dá)水平，顯微鏡下觀察免疫組織化學(xué)染色情況（具體方法參考免疫組織化學(xué)法用于腫瘤患者病理診斷的效果評(píng)價(jià)[9]）。

對(duì)患者進(jìn)行為期1年的隨訪，統(tǒng)計(jì)生存、死亡情況，然后根據(jù)生存、死亡分組，生存組68例，死亡組16例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。應(yīng)用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，Levene法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用獨(dú)立樣本F/t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的運(yùn)用中位數(shù)（四分位間距）[M（Q1，Q3）]，組間采用Wilcoxon比較。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-485-5p，miR-1207-3p和miR-590-3p在結(jié)直腸癌組織、癌旁組織中的表達(dá)比較 見(jiàn)圖1。結(jié)直腸癌癌組織miR-485-5p（3.25±0.32fmol/ml），miR-1207-3p（1.45±0.14fmol/L）和miR-590-3p (2.63±0.26fmol/L)表達(dá)均低于癌旁組織(7.65±0.76fmol/L,5.81±0.58fmol/L, 8.95±0.89f/mol/L)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=48.900, 66.970, 62.470,P=0.016, 0.012,0.015)。

圖1 miR-485-5p，miR-1207-3p和miR-590-3p在結(jié)直腸癌組織、癌旁組織中的表達(dá)免疫組化圖

2.2 miR-485-5p，miR-1207-3p，miR-590-3p表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 見(jiàn)表1。不同性別、年齡、腫瘤直徑結(jié)直腸癌患者miR-485-5p，miR-1207-3p和miR-590-3p表達(dá)無(wú)明顯差異（均P＞0.05）。Ⅲ～Ⅳ期、中、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有肝轉(zhuǎn)移患者miR-485-5p，miR-1207-3p和miR-590-3p表達(dá)分別低于Ⅰ～Ⅱ期、高分化、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)肝轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 miR-485-5p，miR-1207-3p，miR-590-3p表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系（±s, fmol/L）

表1 miR-485-5p，miR-1207-3p，miR-590-3p表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系（±s, fmol/L）

臨床病理特征 n miR-485-5p t/F P miR-1207-3p t/F P miR-590-3p t/F P性別男 41 3.16±0.31 0.150 0.880 1.47±0.11 0.725 0.470 2.68±0.26 0.366 0.714女 43 3.15±0.30 1.49±0.14 2.66±0.24年齡（歲）＜50 42 3.24±0.30 0.295 0.768 1.44±0.14 1.637 0.105 2.61±0.23 0.373 0.709≥50 42 3.26±0.32 1.49±0.14 2.63±0.26 TNM分期Ⅰ～Ⅱ 22 6.01±0.60 27.890 0.012 4.54±0.45 50.800 0.021 5.94±0.59 35.830 0.031Ⅲ～Ⅳ 62 3.21±0.31 1.43±0.11 2.62±0.26腫瘤大小（cm）＞5 20 3.22±0.32 0.244 0.087 1.46±0.14 0.557 0.578 2.61±0.25 0.151 0.879≤5 64 3.24±0.32 1.44±0.14 2.62±0.26分化程度高分化 15 6.23±0.62 21.338 0.026 6.11±0.61 52.835 0.020 7.01±0.70 46.979 0.034中分化 18 5.15±0.51 5.45±0.54 5.02±0.50低分化 51 3.26±0.32 1.41±0.14 2.13±0.21淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有 65 3.19±0.31 27.550 0.034 1.44±0.14 44.980 0.034 2.67±0.26 27.700 0.040無(wú) 19 6.01±0.60 4.12±0.41 5.04±0.50肝轉(zhuǎn)移有 62 3.21±0.32 32.180 0.016 1.40±0.14 46.500 0.026 5.52±0.55 28.910 0.011無(wú) 22 6.67±0.66 4.17±0.41 2.04±0.20

2.3 死亡組與存活組miR-485-5p，miR-1207-3p和miR-590-3p比較 死亡組患者miR-485-5p（1.52±0.15fmol/L），miR-1207-3p（0.50±0.05fmol/L）和miR-590-3p（1.15±0.11fmol/L）均低于存活組（4.98±0.49fmol/L，2.40±0.24fmol/L，4.11±0.41fmol/L），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 27.820,31.370, 28.520, 均P＜0.001）。

2.4 miR-485-5p，miR-1207-3p和miR-590-3p對(duì)結(jié)直腸癌的預(yù)測(cè)價(jià)值分析 見(jiàn)表2，圖2。ROC曲線分析顯示，三項(xiàng)聯(lián)合曲線下面積、敏感度和特異度分別為0.823，86.30%和87.32%；miR-485-5p分別為0.699，85.78%和86.41%；miR-1207-3p分別為0.768，85.59%和71.14%；miR-590-3p分別為0.719，83.62%和87.62%，三項(xiàng)聯(lián)合對(duì)結(jié)直腸癌診斷價(jià)值高于單項(xiàng)檢測(cè)。

圖2 miR-485-5p，miR-1207-3p和miR-590-3p預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌的ROC曲線

表2 miR-485-5p，miR-1207-3p，miR-590-3p對(duì)結(jié)直腸癌的預(yù)測(cè)價(jià)值分析

2.5 miR-485-5p，miR-1207-3p和miR-590-3p之間相關(guān)性分析 miR-485-5p，miR-1207-3p，miR-590-3p之間相關(guān)性分析顯示，miR-485-5p與miR-1207-3p呈正相關(guān)（r=0.457，P=0.005）；miR-485-5p與miR-590-3p呈正相關(guān)（r=0.314，P=0.003）；miR-1207-3p與miR-590-3p呈正相關(guān)（r=0.332，P=0.002）。

3 討論

結(jié)直腸癌（CRC）在早期并無(wú)特殊的臨床表現(xiàn)，其早期常見(jiàn)癥狀為排便習(xí)慣或糞便性狀的改變，往往難以引起重視，而當(dāng)患者出現(xiàn)便血時(shí)，說(shuō)明病情已經(jīng)傾向惡化[10]。目前臨床上仍缺乏對(duì)結(jié)直腸癌的高效檢測(cè)指標(biāo)，且以手術(shù)為主要治療方式，無(wú)特效的治療手段。因此，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療顯得尤為重要，故此尋找高效診斷結(jié)直腸癌的敏感指標(biāo)和作用靶點(diǎn)對(duì)早期針對(duì)性治療和提高生存率具有重要的意義。細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)可以直接或間接作用于組織、細(xì)胞，造成某些細(xì)胞功能代謝障礙。腫瘤組織與正常組織之間miRNA的表達(dá)存在一定的差異。

miRNA可參與多種惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，在疾病演進(jìn)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[11]。多種腫瘤中都會(huì)出現(xiàn)miRNA的表達(dá)異常，且在不同腫瘤中呈現(xiàn)差異性表達(dá)，因此miRNA也被認(rèn)為是診斷惡性腫瘤的可靠標(biāo)志物[12]。miR-485-5p在多種腫瘤中處于低表達(dá)狀態(tài)，如在正常水平表達(dá)下miR-485-5p可有效抑制腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-485-5p可通過(guò)負(fù)性調(diào)控Sur-vivin基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制HCT116細(xì)胞的侵襲，這一結(jié)果提示了miR-485-5p可能會(huì)成為臨床靶向治療結(jié)直腸癌的關(guān)鍵，也從側(cè)面進(jìn)一步的明確腫瘤的發(fā)生原因[14]。對(duì)于其病理機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，miR-485-5p在癌組織中的表達(dá)水平明顯下降，而其低表達(dá)明顯抑制線粒體的呼吸，抑制癌變細(xì)胞在體外的遷移和侵襲潛能，并能有效抑制癌細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移[15]。此外，有多位權(quán)威專家在相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[16]，miR-485-5p的上調(diào)可有效降低胃癌等其他癌癥細(xì)胞中Flot1的表達(dá)，并且Flot1的過(guò)表達(dá)部分可逆轉(zhuǎn)miR-485-5p表達(dá)對(duì)癌細(xì)胞的惡性表型的抑制作用，這一結(jié)果表明了miR-485-5p可能是一種潛在的預(yù)后標(biāo)志物，并有望通過(guò)上調(diào)miR-485-5p達(dá)到抑制直腸癌發(fā)生及進(jìn)展?；谏鲜鲅芯勘尘埃狙芯恐蟹治鰉iR-485-5p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及與疾病演進(jìn)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與國(guó)內(nèi)外多數(shù)研究學(xué)者研究結(jié)果一致，顯示miR-485-5p在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)降低，且隨著患者疾病的不斷演進(jìn)，其水平愈低，此結(jié)果提示著，miR-485-5p可能參與調(diào)控結(jié)直腸癌的演進(jìn)，臨床上可根據(jù)其表達(dá)水平評(píng)估此病。

miR-1207-3p在部分癌癥中屬于抑癌基因的一種，在結(jié)直腸癌中miR-1207-3p的表達(dá)降低可抑制腫瘤的發(fā)展，這種表達(dá)現(xiàn)象在很多實(shí)驗(yàn)中都得到了相應(yīng)的印證[17]。然而，miR-1207-3p在結(jié)直腸癌中的臨床意義及預(yù)后價(jià)值尚未研究。目前臨床上隨著對(duì)miR-1207-3p的不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，miR-1207-3p在結(jié)直腸癌中表達(dá)降低，結(jié)直腸癌做上調(diào)處理后可抑制其增殖及耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。這可能成為未來(lái)治療結(jié)直腸癌的重要靶點(diǎn)。結(jié)直腸癌組織中miR-1207-3p表達(dá)與細(xì)胞增殖基因、腫瘤病理特征相關(guān)[19-20]。另有研究指出，miR-1207-3p可通過(guò)抑制XRCC6表達(dá)量來(lái)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者的miR-1207-3p表達(dá)量相較于癌旁組織表達(dá)量水平明顯降低，且在多變量的分析中，miR-1207-3p的表達(dá)可作為結(jié)直腸癌患者總生存的獨(dú)立預(yù)后因素，因此，miR-1207-3p可能是結(jié)直腸癌的一個(gè)新診斷及預(yù)后標(biāo)志物，與上述研究一致。

目前有研究發(fā)現(xiàn)miR-590-3p在乳腺癌等腫瘤組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的作用[21]。有相關(guān)研究報(bào)道，miR-590-3p可有效抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生及順鉑耐藥，其機(jī)制可能與負(fù)性調(diào)控某些細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)及減少細(xì)胞凋亡有關(guān)，但是具體的分子機(jī)制仍需要深入探究。有研究發(fā)現(xiàn)[22]，miR-590-3p在不同腫瘤的發(fā)生過(guò)程中可發(fā)揮不同的生物學(xué)功能，miR-590-3p在結(jié)直腸癌細(xì)胞和組織中表達(dá)下降，抑制細(xì)胞的增殖。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，miR-590-3p在結(jié)直腸癌組織中處于下降趨勢(shì)，通過(guò)miR-590-3p的上調(diào)可有效降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的表達(dá)，起到抑制作用。這與本文研究結(jié)果一致，因此，miR-590-3p可能會(huì)作為預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移潛能及惡性腫瘤生成的指標(biāo)。且在研究中發(fā)現(xiàn)，miR-485-5p，miR-1207-3p和miR-590-3p表達(dá)與結(jié)直腸癌患者性別、年齡，腫瘤直徑無(wú)關(guān)，與TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移表達(dá)相關(guān)，Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者中miR-485-5p，miR-1207-3p和miR-590-3p表達(dá)降低。這表明miR-485-5p，miR-1207-3p和miR-590-3p可作為結(jié)直腸癌惡化程度的檢測(cè)指標(biāo)。而在患者最終結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值分析中，低表達(dá)的miR-485-5p，miR-1207-3p和miR-590-3p可能對(duì)于最終結(jié)局有較好的預(yù)測(cè)性。本研究尚存在一定局限性，如本研究為單中心研究，病例數(shù)偏少，需要多中心、大樣本研究進(jìn)一步驗(yàn)證本研究所獲得的miR-485-5p，miR-1207-3p和miR-590-3p對(duì)結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值較高的結(jié)果，為臨床上結(jié)直腸癌的早期診斷提供新方向。

綜上所述，miR-485-5p，miR-1207-3p和miR-590-3p在結(jié)直腸癌中具有一定的相關(guān)性，其水平的異常表達(dá)可加重疾病與腫瘤惡化程度，可用于結(jié)直腸癌患者的臨床診斷及預(yù)后判斷。