外周血單個核細胞miRNA-492和miRNA-155水平表達與SNAPPE-Ⅱ評分對兒童急性呼吸窘迫綜合征預(yù)后價值研究

王慶妹，崔慧娟，杜京輝，莊元華

（1.兗礦新里程總醫(yī)院，山東鄒城 273500；2 .山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院，濟南 250021）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）發(fā)病機制復(fù)雜，表現(xiàn)為低順應(yīng)性、低氧血癥、呼吸窘迫，需要在早期及時進行干預(yù)，是重癥醫(yī)學(xué)科診療的重點難點[1]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）屬于一種非編碼RNA，在炎癥免疫反應(yīng)、血管生成、細胞凋亡等過程中發(fā)揮作用，能夠在不同體液及組織中分離檢測，是多種疾病診斷及預(yù)后效果評估的生物標(biāo)志物[2-3]。miR-155和miR-492在自身免疫、胰島素抵抗、腫瘤發(fā)生、調(diào)控多種蛋白表達中具有重要作用[4-5]，但是關(guān)于ARDS的相關(guān)研究卻少有報道。急性生理學(xué)評分圍產(chǎn)期補充（score for neonatal acute physiology perinatal extension，SNAPPE）-Ⅱ評分是一種應(yīng)用較廣的新生兒危重病例評分系統(tǒng)，對新生兒危重癥有良好的預(yù)測價值。本研究旨在分析血清miR-492和miR-155表達水平與新生兒SNAPPE-Ⅱ?qū)和毙院粑狡染C合征預(yù)后價值，詳細報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2019年9月～2020年11月期間兗礦新里程總醫(yī)院及山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院診治的70例ARDS患兒作為研究對象，并按照預(yù)后情況分為死亡組（n=18）及存活組（n=52）；選擇同期健康體檢兒童36例作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《急性呼吸窘迫綜合征蒙特勒（2017年版）》[6]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡0～12歲；③急性起病，重癥監(jiān)護室機械通氣時間≥72 h；④超聲心動圖檢查結(jié)果顯示無左心房高壓。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)其他嚴(yán)重肺部疾病，原發(fā)性肺泡表面活性物質(zhì)缺乏，肺和胸壁畸形及其他嚴(yán)重的先天畸形，肺外嚴(yán)重感染；②先天性代謝紊亂、先天性心臟病等疾?。虎叟R床資料不齊全。本次研究通過醫(yī)院倫理學(xué)會審核（倫理審批號2019934）。

1.2 儀器及試劑 熒光定量儀（ABI美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，型號：7300）；PCR 儀（Thermal cycler BIO-RAD，型號：C1000）；制冰機[Scotsman（思科特曼）,型號：AF100]；低溫離心機(Labogene，型號：Scanspeed 1730R)；微型振蕩器（海門市麒麟醫(yī)用儀器廠，型號：QL-901）；DEPC（Sigma）；Trizol [ Invitrogen（美國英杰生命技術(shù)有限公司）]。

1.3 方法

1.3.1 miR-492和miR-155的檢測：受試者入院后次日清晨采集空腹抗凝血，放置于溫度為4℃環(huán)境中，2 500r/min，離心10min，吸取上層血漿放置于-80℃環(huán)境下保存。剩余血細胞依據(jù)紅細胞裂解法獲得白細胞，得到白細胞TRIzol后，將其放置于-80℃環(huán)境下保存，采用實時定量PCR檢測血漿樣本中miR-492和miR-155的表達。miR-492的引物序列為（正向）：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’，（反向）5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；miR-155的 引物序列為（正向）：5’-CCTGCACTCAGGGCTGCCA ACACT-3’，（反向）5’-GGCATCATTGCCGCACGAA TCAGC-3’。每一個反應(yīng)重復(fù)測量三次，然后取平均值，通過血漿外參試劑盒合成展開外參正態(tài)化矯正。各個反應(yīng)體系中信號達到既定閥值的循環(huán)數(shù)作為Ct值，利用2-ΔΔCt法計算相對表達水平[7]。

1.3.2 臨床數(shù)據(jù)收集：收集受試者的詳細臨床資料，包括年齡、性別、原發(fā)病、病程、血氣分析結(jié)果、氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）。檢測血細胞檢測、肝腎功能、電解質(zhì)相關(guān)指標(biāo)。ARDS患兒在確診病情后12h內(nèi)評估患兒PaO2/FiO2及急性生理年齡與慢性健康（acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHEⅡ）評分[8]，應(yīng)用SNAPPE-Ⅱ評分對患兒進行評估，評分范圍0～162分，分值越高，病情越重[9]。采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測兒童miR-492和miR-155水平。以患兒診斷作為研究起點，患兒死亡或者出院作為研究終點。對比三組兒童PaO2/FiO2，SNAPPE-Ⅱ評分、APACHEⅡ評分、miR-492和miR-155水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 25.0工具進行數(shù)據(jù)處理，計量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計數(shù)資料用例數(shù)（比率）[n（%）]表示，分類變量采用卡方檢驗或t檢驗方法比較，采用Pearson分析miR-492，miR-155，SNAPPE-Ⅱ評 分 與PaO2/FiO2，APACHEⅡ評分間的相關(guān)性。用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析miR-492和miR-155水平，SNAPPE-Ⅱ評分預(yù)測ARDS患兒死亡率的價值，計算ROC曲線下面積（area under curve，AUC），所有測試均為雙尾檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料比較 見表1。ARDS患兒按照預(yù)后情況分為死亡組（n=18）及存活組（n=52），死亡組男性10例，女性8例；年齡1～12（5.35±1.85）歲。存活組男性29例，女性23例；年齡1～12（6.26±1.52）歲。對照組男性19例，女性17例；年齡2～12（5.53±1.35）歲。三組兒童在年齡及性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），ARDS患兒存活組與死亡組乳酸(LAC)、白細胞（WBC）、氧濃度(FiO2)和呼氣末氣道正壓(PEEP)、機械通氣時間、潮氣量和病程等臨床資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

表1 ARDS患兒存活組與死亡組一般資料比較（±s）

表1 ARDS患兒存活組與死亡組一般資料比較（±s）

類 別 存活組（n=52） 死亡組（n=18） t/χ2 P年齡（歲） 6.26±1.52 5.35±1.85 0.718 0.108性別（男/女） 29/23 10/8 1.347 0.425 BMI（kg/m2） 26.41±4.65 28.35±5.27 0.373 0.078 LAC（mg/dl） 2.93±0.97 2.92±1.41 0.583 0.074機械通氣時間（天） 4.59±2.01 5.66±2.48 2.883 0.583 WBC（×109/L） 12.73±7.85 10.12±5.93 0.421 0.073 FiO2（%） 42.62±7.19 43.41±8.32 1.191 0.235潮氣量（ml） 521.67±41.20 539.48±42.56 0.187 0.126 PEEP（cmH2O） 7.75±3.15 8.94±3.63 1.485 0.08病程（天） 6.35±1.29 7.85±1.63 0.482 0.139

2.2 三組兒童PaO2/FiO2，miR-492，miR-155，SNAPPE-Ⅱ評分和APACHEⅡ評分對比 見表2。對照組與ARDS組患兒比較，PaO2/FiO2，miR-492，miR-155，SNAPPE-Ⅱ和APACHEⅡ評分差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），ARDS組存活組與死亡組患兒比較，上述指標(biāo)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表2 三組兒童各指標(biāo)水平對比（±s）

表2 三組兒童各指標(biāo)水平對比（±s）

項目 對照組（n=36）ARDS組（n=70） χ2 P ARDS存活組（n=52）ARDS死亡組（n=18） χ2 P PaO2/FiO2（mmHg） 448.64±85.54 217.23±29.18 10.373 0.009 269.64±31.53 165.64±27.63 15.962 ＜0.001 APACHE-Ⅱ（分） 5.74±1.42 24.51±4.49 9.472 0.016 20.54±4.29 29.65±5.43 14.924 ＜0.001 miR-155 1.75±0.95 4.31±1.27 12.883 0.003 3.84±0.53 5.64±1.74 9.954 0.023 miR-492 3.75±0.98 7.76±2.08 9.191 0.025 5.63±1.41 9.54±2.25 9.245 0.031 SNAPPE-Ⅱ評分（分） 5.95±1.75 25.75±5.14 10.187 0.006 15.86±3.75 36.45±5.32 16.546 ＜0.001

2.3 三組兒童各指標(biāo)水平相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果表明，PaO2/FiO2與miR-492，miR-155，SNAPPE-Ⅱ評分具有顯著負相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（r=-0.584，-0.623，-0.594，均P＜0.05）；APACHEⅡ評 分 與miR-492，miR-155水 平，SNAPPE-Ⅱ評分呈顯著正相關(guān)性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（r=0.863, 0.868, 0.757, 均P＜0.05），

2.4 各指標(biāo)預(yù)測死亡的價值分析 見表3，圖1。對各指標(biāo)預(yù)測死亡率的分析顯示，miR-492的敏感度為83.33%，特異度為72.86%，臨界值為0.84；miR-155的敏感度為81.53%，特異度為91.43%，臨界值為1.43；SNAPPE-Ⅱ評分的敏感度為91.57%，特異度為84.57%，臨界值為22.8。miR-492，miR-155與SNAPPE-Ⅱ評分三者聯(lián)合的敏感度為94.57%，特異度為95.85%，陽性預(yù)測值為86.86%，陰性預(yù)測值為97.54%，三項指標(biāo)均對ARDS患兒死亡率有較好的預(yù)測作用，且三者聯(lián)合的診斷效能高于單一指標(biāo)，說明當(dāng)miR-492＞0.84，miR-155＞1.43，SNAPPE-Ⅱ評分＞22.8時，ARDS患兒的死亡率較高。

圖1 miR-492，miR-155聯(lián)合SNAPPE-Ⅱ評分的ROC曲線

表3 各指標(biāo)預(yù)測死亡的價值分析

3 討論

急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是由多種肺外致病因素引起的急性炎癥性肺損傷，是兒童時期的嚴(yán)重疾病，其標(biāo)志是肺泡膜通透性改變、肺表面活性劑功能障礙、彌漫性肺間質(zhì)和肺泡水腫、肺透明膜的形成和肺泡塌陷，可導(dǎo)致患兒死亡[10]，根據(jù)流行病學(xué)研究，該病的發(fā)病率在0.7% ～ 1.6%之間，當(dāng)并發(fā)其他呼吸道疾病時，發(fā)病率可增加3 ～4倍[11]。該病的治療缺少特效方式，主要是液體管理、營養(yǎng)支持、體外膜肺氧合、肺表面活性物質(zhì)替代、呼吸支持等治療。既往研究表明，多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）APACHEⅡ評分、休克與ARDS的預(yù)后相關(guān)[12]。炎癥功能障礙和細胞凋亡參與了ARDS的發(fā)展，因此細胞因子如白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在預(yù)測ARDS的預(yù)后中也有一定的價值[13]。然而，ARDS的治療難度仍然較大，具有較高的病死率。因此，研究ARDS發(fā)生發(fā)展的機制對其防治具有重要意義。

識別新的生物標(biāo)志物是改善ARDS患兒預(yù)后的重要方法，miRNA是小的非編碼RNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達。miRNA可以與靶基因的mRNA配對形成miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，從而降解或抑制靶基因的翻譯。多項研究發(fā)現(xiàn)，差異表達的miRNA與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，在各種急慢性炎癥性疾病中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[14]。miRNA與腫瘤的相關(guān)研究已成為醫(yī)學(xué)界的熱門話題。隨著對miRNA研究的不斷深入，多項研究已經(jīng)證實miRNA參與了ARDS的發(fā)生發(fā)展，在ARDS患者細胞凋亡及炎癥反應(yīng)中具有一定作用[15-16]。miRNA不僅存在于組織和細胞中，還存在于循環(huán)系統(tǒng)中，并且在包括ARDS在內(nèi)的多種疾病中差異表達，是診斷疾病及評估病情發(fā)展的新型生物標(biāo)志物[17]。最近的一項研究表明，miR-155可以通過Ang-2-Tie-2途徑分泌到膿毒癥患者的血液中[18]。miR-492位于12q22染色體上，腫瘤分泌的miR-492可以通過激活Toll樣受體誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，在轉(zhuǎn)移性肝母細胞瘤、直腸癌、宮頸癌、胰腺癌組織中均可發(fā)現(xiàn)其表達上調(diào)，與這些腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移有關(guān)[19]。此外，miR-492還可作為診斷急性心肌梗死的有效生物標(biāo)志物[20]。

本研究中，三組兒童PaO2/FiO2，miR-492，miR-155，APACHEⅡ和SNAPPE-Ⅱ評分對比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。說明血清miR-492和miR-155對ARDS患兒的病情進展具有一定影響，另一項研究表明，miR-155可以作為一種新的生物標(biāo)志物來預(yù)測ARDS 患兒的死亡率和預(yù)后[21]，與本研究結(jié)果一致。對于miR-492在ARDS中的表達及價值目前尚無報道，丁瑩等[22]發(fā)現(xiàn)，miR-492可調(diào)控單核巨噬細胞系統(tǒng)分泌免疫炎性因子，從而影響支原體肺炎的感染及發(fā)病，說明miR-492在急性炎癥中存在高表達。PaO2/FiO2，APACHEⅡ評分是一直以來評價ARDS病情的重要指標(biāo)。本研究相關(guān)性分析表明，PaO2/FiO2與miR-492，miR-155，SNAPPE-Ⅱ評分呈顯著負相關(guān)；APACHEⅡ評分與miR-492，miR-155，SNAPPE-Ⅱ評分呈顯著正相關(guān)。由此進一步說明，miR-492，miR-155表達水平升高與患兒病情嚴(yán)重程度有關(guān)，其中的原因有待進一步研究。有研究表明，SNAPPE-Ⅱ評分能夠有效預(yù)測ARDS患兒的死亡風(fēng)險，早期進行評分有助于預(yù)測病情嚴(yán)重程度并改善預(yù)后[23]。本研究ROC曲線分析顯示，三項指標(biāo)均對ARDS患兒死亡率有較好的預(yù)測作用，且三者聯(lián)合的診斷效能高于單一指標(biāo)，當(dāng)miR-492＞0.84，miR-155＞1.43，SNAPPE-Ⅱ評分＞22.8時，ARDS患兒的死亡率較高。

綜上所述，miR-492，miR-155，SNAPPE-Ⅱ評分聯(lián)合檢測能夠預(yù)測ARDS患兒的預(yù)后效果，miR-492，miR-155可作為ARDS的潛在標(biāo)志物。然而，本研究仍然處于初步階段，樣本來源比較單一，今后需要更多大樣本多中心臨床研究證實miR-492，miR-155在ARDS中的應(yīng)用價值，使其成為診斷及預(yù)測預(yù)后效果的新途徑。