基于GAS、NO和MLCK信號(hào)通路觀察一指禪推法干預(yù)脾虛家兔的作用機(jī)制

曾林琳，王繼紅，黃澤芳，賈文瀚

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405)

一指禪推法是臨床常見(jiàn)的推拿手法，該手法適應(yīng)癥廣泛，可用于治療胃脘痛、腹瀉、便秘等消化系統(tǒng)疾病，如曹仁發(fā)教授在臨床上運(yùn)用一指禪推法治療腸易激綜合征[1]。在前期實(shí)驗(yàn)中，閆冬等[2]研究不同頻率段一指禪推法對(duì)脾虛家兔胃腸黏膜形態(tài)學(xué)影響的實(shí)驗(yàn)中得出，101～150次/min頻率段的一指禪推法干預(yù)后的脾虛家兔的胃腸黏膜最接近健康組家兔，因此本次實(shí)驗(yàn)選取101～150次/min頻率段作為一指禪推法的頻率。另外，基于前期研究基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)采用MFF多點(diǎn)薄膜壓力傳感器測(cè)試手法壓力，該設(shè)備可以實(shí)時(shí)測(cè)試手法的壓力變化，根據(jù)多人多次進(jìn)行的手法模擬操作，經(jīng)過(guò)反復(fù)測(cè)定和觀察評(píng)估，最終選定以150 mN作為該手法統(tǒng)一的壓力值。由于人工智能機(jī)械臂可通過(guò)相應(yīng)軟件量化各項(xiàng)操作數(shù)據(jù)，故本次實(shí)驗(yàn)將采用人工智能機(jī)械臂模擬操作一指禪推法。功能性消化不良是臨床上發(fā)病率較高的消化系統(tǒng)疾病，其病因?yàn)槲改c激素分泌異常，影響胃腸平滑肌收縮舒張，導(dǎo)致胃腸功能減退[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，在胃腸道平滑肌細(xì)胞內(nèi)的肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)通路可控制胃腸平滑肌的收縮舒張[4]，而石玉生等[5]通過(guò)以和解肝脾腹部推拿法干預(yù)非酒精性脂肪肝大鼠，發(fā)現(xiàn)腹部推拿法可通過(guò)調(diào)控腸組織MLCK信號(hào)通路,從而改善腸上皮屏障功能。綜上，本實(shí)驗(yàn)研究中以脾虛型家兔為研究對(duì)象，選擇胃泌素(GAS)及一氧化氮(NO)為主要研究指標(biāo)，探究抑制MLCK通路的情況下，一指禪推法能否影響脾虛型家兔的胃腸激素的分泌，如能影響，則可說(shuō)明一指禪推法可通過(guò)其他通路或途徑對(duì)脾虛型家兔的GAS及NO產(chǎn)生作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其分組

選取普通成年新西蘭兔40只，體質(zhì)量為(2.0±0.5)kg，雌雄各半，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(粵)219-0035，分籠飼養(yǎng)并于兔籠外貼標(biāo)簽編為1～40號(hào)，其中1～20號(hào)置雌兔，21～40號(hào)置雄兔。在室溫24 ℃環(huán)境中，分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。待其進(jìn)食，活動(dòng)和糞便正常開(kāi)始分組，具體為：每次分組在1～20號(hào)、21～40號(hào)各隨機(jī)取5只家兔組成1組，每組10只，共分為4組，分別為空白組(K組)、模型組(P組)、一指禪推法治療組(A組)、抑制劑組(I組，采用A組治療方法+腹腔注射ML-9)。

1.2 造模藥物的制備及造模過(guò)程

本實(shí)驗(yàn)采用灌飼小承氣湯和饑飽失常法建立脾虛證家兔模型[2]，除K組外，P組、A組、I組均進(jìn)行造模處理。本造模方法是將大黃36 g，厚樸27 g，枳實(shí)18 g混合(全部飲片均為袋裝可溶制劑，由廣州致信藥業(yè)有限公司提供)，加入650 mL蒸餾水浸泡30 min，將蒸餾水連同生藥一起倒入1000 mL燒瓶中，將燒瓶放在電熱套上，至藥汁沸騰45 min。倒出藥汁，在12層紗布上過(guò)濾2次，過(guò)濾后的藥汁倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的燒瓶中，以70 ℃的溫度將藥汁濃縮至80 mL，即濃度為1 g/mL，按生藥6 g/kg體質(zhì)量給藥。隔日灌胃1次，每次喂飼常規(guī)量飼料的一半，自由飲水，造模同時(shí)記錄家兔行為學(xué)改變。連續(xù)15 d可造成脾虛證功能性消化不良動(dòng)物模型。

分別于造模前、后進(jìn)行評(píng)估，記錄各組家兔癥狀變化，包括體質(zhì)量、食量、大便次數(shù)及行為學(xué)改變等，記錄于“家兔行為學(xué)量表”上，用于綜合評(píng)價(jià)造模成功與否。造模組家兔體質(zhì)量減輕、食量下降、大便次數(shù)增多及行為學(xué)差異，則可判斷造模成功。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及相關(guān)參數(shù)校對(duì)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)儀器

TEKSCAN壓力測(cè)試調(diào)制器、校對(duì)器、動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)采集器及MFF多點(diǎn)薄膜壓力傳感器由上海邑成測(cè)試設(shè)備有限公司生產(chǎn)；智能機(jī)械臂(越疆科技，DOBOT魔術(shù)師)；家兔固定器(上海化科實(shí)驗(yàn)器材，PVC-01)；計(jì)時(shí)器(拜杰有限公司，cp-167)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)試劑

ML-9試劑,是Akt激酶的選擇性強(qiáng)效抑制劑，可有效抑制MLCK活性，由生物制劑(北京)生物技術(shù)有限公司提供，批號(hào)：YZM002844。

1.3.3 相關(guān)參數(shù)校對(duì)

連接好相關(guān)器械后，將人工智能機(jī)械臂置于家兔腹部操作手法，并控制頻率處于101～150 次/min頻率段，施加同等力量值操作并保持1 min，在電腦上建立力-電壓之間的擬合函數(shù)模型y=a+bx，然后通過(guò)校對(duì)器得出曲線的標(biāo)準(zhǔn)力量值和頻率值，此后操作頻率都必須落在該組要求的頻率范圍內(nèi)。手法操作時(shí)，壓力值采集選用MFF多點(diǎn)薄膜壓力測(cè)試系統(tǒng)，手法壓力值以觀察實(shí)時(shí)采集數(shù)據(jù)為度量標(biāo)準(zhǔn)，具體操作過(guò)程：共選取5名測(cè)試者各測(cè)試10次，選取其中手法壓力曲線均值較接近的5組為樣本并取其平均值；再取其平均值作為手法治療的標(biāo)準(zhǔn)操作值。手法操作時(shí)，全部治療組手法壓力均值控制在以上標(biāo)準(zhǔn)操作值不超過(guò)±5%[2]。經(jīng)過(guò)上述模擬測(cè)試后，選取150 mN的壓力值作為該手法的壓力。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 穴位定位

采用比較解剖學(xué)和模擬人體經(jīng)穴定位法結(jié)合進(jìn)行新西蘭兔穴位定位[6]。中脘穴：取家兔胸骨下端和肚臍之間連線的中點(diǎn)；天樞穴：取肚臍與腹外側(cè)之間連線上內(nèi)1/3與外2/3的交點(diǎn)。

1.4.2 手法操作

(1)由兩名助手將家兔固定于手術(shù)臺(tái)上，腹部向上，剃毛后定好穴位。(2)電腦進(jìn)入壓力監(jiān)測(cè)界面，且設(shè)定機(jī)械臂操作頻率為101～150次/min。(3)在家兔腹部固定好壓力傳感器。(4)使用人工智能機(jī)械臂于中脘、天樞(雙)行一指禪推法，操作時(shí)觀察電腦顯示的壓力曲線變化以保證手法力量與波形穩(wěn)定，操作后保存壓力曲線記錄。每穴推5 min，每次治療時(shí)長(zhǎng)為15 min，每天1次，連續(xù)10 d。其中I組家兔在每日治療結(jié)束后注射ML-9(2 mg/kg)，抑制MLCK靶點(diǎn)，持續(xù)干預(yù)10 d。

1.5 血清胃泌素(GAS)水平測(cè)定

胃泌素采用家兔血清樣本提取。血清樣本處理如下：采血得到血液后靜置使其自然凝固，在4 ℃下，3 000 r/min離心20 min，收集上清液即為待測(cè)血清。GAS水平測(cè)定采用ELISA法，具體步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.6 胃竇一氧化氮(NO)水平測(cè)定

將胃內(nèi)容物充分清洗干凈之后，自家兔胃幽門(mén)括約肌處取得適量胃竇部組織，并用蒸餾水沖洗干凈后用濾紙吸干多余水分，稱重，按1∶9(質(zhì)量/體積)的比例，加入PBS，冰水浴條件下破碎組織得到勻漿液，4 000 r/min離心15 min，取上清液。蛋白濃度測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法，以硝酸還原酶法測(cè)定組織勻漿上清液的NO水平，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組家兔GAS水平對(duì)比

結(jié)果顯示，4組GAS水平結(jié)果均為正態(tài)分布，故采用對(duì)比均數(shù)進(jìn)行分析。組間兩兩比較，除A組(20.66±1.71)和I組(19.96±4.40)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與K組(7.17±3.89)比較，P組、A組、I組的GAS平均水平處于較高水平，其中P組(78.82±8.32)GAS平均水平最高，而A組和I組均為接受治療后的組別，兩組的GAS水平較K組上升，較P組下降，而A、I兩組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組家兔GAS水平比較

2.2 各組家兔NO水平對(duì)比

結(jié)果顯示，4組NO水平結(jié)果均為正態(tài)分布，故采用對(duì)比均數(shù)進(jìn)行分析。組間兩兩比較，除A組(46.64±5.10)和I組(4.03±1.27)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余組間比較，均有顯著性差異(P<0.05)；與K組(46.64±5.10)比較，P組、A組、I組的NO水平處于較低水平，其中P組(4.03±1.27)水平最低，A組及I組的NO水平較K組下降，較P組上升，而A、I兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組家兔NO水平比較

2.3 治療前后家兔食量對(duì)比

選取治療前一天的家兔進(jìn)食量與結(jié)束治療后一天的家兔進(jìn)食量進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證治療是否有效。治療前一天各組的進(jìn)食量為正態(tài)分布，故采用對(duì)比均數(shù)進(jìn)行比較；治療結(jié)束后一天，各組的進(jìn)食量為正態(tài)分布，故采用對(duì)比均數(shù)進(jìn)行比較。進(jìn)行組內(nèi)治療前后的進(jìn)食量比較，K組及P組治療前后進(jìn)食量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，A組及I組兩組治療后的進(jìn)食量均比治療前進(jìn)食量增加，且治療前后進(jìn)食量有顯著性差異(P<0.05)，而A組及I組兩組進(jìn)食量在治療前后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組家兔治療前后平均進(jìn)食量對(duì)比

3 討論

GAS及NO對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)功能皆有不同方面的影響，分析治療后胃腸激素水平，通過(guò)對(duì)比各組胃腸激素水平及各組治療后進(jìn)食量，明確一指禪手法治療脾虛證家兔模型的療效。

3.1 治療后GAS水平分析

GAS由胃竇部G細(xì)胞分泌，該激素水平變化與胃腸運(yùn)動(dòng)功能有密切的關(guān)系，能夠引起胃竇收縮和胃底舒張，延遲胃排空[7]。GAS對(duì)胃運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生影響的可能機(jī)理如下：(1)GAS可與幽門(mén)上的受體相結(jié)合，經(jīng)過(guò)相關(guān)生化反應(yīng)激動(dòng)兩個(gè)信號(hào)傳遞途徑：IP3/Ca2+和DG/PKC途徑[8]，繼而使幽門(mén)收縮。(2)GAS可間接通過(guò)內(nèi)臟神經(jīng)或迷走神經(jīng)反射抑制胃排空[9]。由此證明，胃泌素具有減緩胃排空的作用。GAS可影響模型組家兔的胃運(yùn)動(dòng)功能，延長(zhǎng)胃排空時(shí)間。造模后，P、A、I組GAS水平較K組升高，表示造模成功，經(jīng)手法治療后的A組及I組GAS水平較P組都有下降，說(shuō)明一指禪手法可減緩脾虛型家兔的胃竇收縮和胃底舒張，加強(qiáng)胃排空，進(jìn)而促進(jìn)家兔的胃運(yùn)動(dòng)功能。

3.2 治療后NO水平分析

NO是一種重要的腦腸肽，可調(diào)節(jié)平滑肌舒張性，具有抑制胃腸收縮功能的作用，亦對(duì)內(nèi)臟感覺(jué)的傳導(dǎo)有抑制作用，在中樞及外周神經(jīng)調(diào)節(jié)胃運(yùn)動(dòng)過(guò)程中扮演重要角色。因此當(dāng)NO含量升高時(shí)，可減少降低內(nèi)臟敏感性，對(duì)腹痛等癥狀有改善作用[10]。本實(shí)驗(yàn)中，K組NO水平最高，P組NO水平最低，而經(jīng)手法治療后的A組及I組的脾虛型家兔，其NO水平較P組都有上升，結(jié)合治療后脾虛型家兔進(jìn)食量的上升，說(shuō)明一指禪手法可調(diào)控NO含量，推測(cè)其可降低脾虛型家兔腹痛等不適癥狀，使治療后的脾虛型家兔進(jìn)食量增加，促進(jìn)胃腸攝入功能的恢復(fù)。

3.3 關(guān)于MLCK通路的討論

現(xiàn)代生理研究認(rèn)為，在胃腸道平滑肌細(xì)胞內(nèi)有兩條信號(hào)通路可控制消化道的收縮舒張運(yùn)動(dòng)功能，包括肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和蛋白激酶C(PKC)兩條途徑，而MLCK通路的作用更為突出，常與鈣離子濃度相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)A組及I組均為一指禪手法治療組，而I組注射了ML-9(MLCK抑制劑)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，A組及I組兩組的胃泌素及NO水平比較差異皆無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即不能證明一指禪手法治療對(duì)MLCK具有影響性。目前研究認(rèn)為胃腸道平滑肌細(xì)胞內(nèi)具有不同的通路，MLCK通路僅為其中一條。據(jù)現(xiàn)代生理學(xué)研究表明，GAS可通過(guò)IP3/Ca2+和DG/PKC通路影響胞內(nèi)鈣離子濃度[8]，從而影響胃腸運(yùn)動(dòng)功能，因此抑制MLCK通路并未影響一指禪手法通過(guò)其他通路影響相關(guān)胃腸激素，如NO及GAS，從而對(duì)胃腸平滑肌的收縮舒張產(chǎn)生作用。

4 小結(jié)

在本實(shí)驗(yàn)中，治療后脾虛型家兔的相關(guān)胃腸激素含量較治療前有所變化，但仍未恢復(fù)至正常家兔的水平，說(shuō)明一指禪推法治療后，家兔受損的胃腸功能可得到一定程度的恢復(fù)。此外，通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得知，盡管現(xiàn)有藥理學(xué)研究證據(jù)表示MLCK通路途徑為主導(dǎo)，但本實(shí)驗(yàn)暫未發(fā)現(xiàn)一指禪推法與MLCK通路存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。由于消化道平滑肌內(nèi)存在多條通路，如張鋒利等[11]研究表明桔梗枳殼湯加味可通過(guò)抑制PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)胃腸激素，增強(qiáng)胃腸動(dòng)力。這也說(shuō)明一指禪治療手法亦可作用于其他通路(如IP3/Ca2+和DG/PKC)，使胃腸運(yùn)動(dòng)的相關(guān)激素如GAS的水平產(chǎn)生變化；NO亦屬于常見(jiàn)的神經(jīng)遞質(zhì)，與GAS一樣亦可通過(guò)神經(jīng)—體液系統(tǒng)使胃腸道平滑肌進(jìn)行收縮舒張運(yùn)動(dòng)。駱雄飛等[12]通過(guò)腹部推拿干預(yù)便秘型腸易激綜合征家兔，探討推拿手法對(duì)ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)神經(jīng)遞質(zhì)的作用，發(fā)現(xiàn)推拿力可轉(zhuǎn)化成機(jī)械波影響腸道神經(jīng)元。結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，亦可說(shuō)明一指禪推法可能通過(guò)神經(jīng)-體液系統(tǒng)對(duì)胃腸功能產(chǎn)生影響，最終對(duì)脾虛型家兔起到治療作用，有待下一步實(shí)驗(yàn)探究。綜上可得出，一指禪推法可通過(guò)多通路、多途徑影響脾虛型家兔的胃腸運(yùn)功，并促使其胃腸功能趨于正常。