基于方證相關(guān)探尋氣、血虛證物質(zhì)基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

梁華，梁爾新，李奇瑋，閆起，王燕，李澤光

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

方劑是研究治法與配伍規(guī)律及其臨床運用的學(xué)科，其功用效果的發(fā)揮與證侯密切相關(guān)。以方測證體現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)辨證論治的思想，通過病、證動態(tài)演變特性來研究方劑與證候之間的相互關(guān)系。隨著現(xiàn)代醫(yī)藥科技迅猛的發(fā)展，特別是蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)作為研究生理條件、突變情況及對抗外部因素產(chǎn)生應(yīng)變的有力工具，能夠?qū)τ谏锵到y(tǒng)之間復(fù)雜作用及行為的系統(tǒng)生物學(xué)進行描述和預(yù)測[1],其具有較為出色的特征表現(xiàn)，諸如復(fù)雜性、整體性以及動態(tài)性等。這一點也和中醫(yī)學(xué)的觀念保持高度一致。為了明確經(jīng)典名方四君子湯、四物湯[2]的抗衰老機制[3-9],本研究采用經(jīng)典名方補益氣、血劑干預(yù)自然衰老小鼠肝細胞線粒體蛋白質(zhì)組的變化，探尋自然生長小鼠增齡過程中伴隨氣、血虛證的物質(zhì)基礎(chǔ)，為指導(dǎo)臨床辨證用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級40只ICR雌性小鼠，購自遼寧長生生物有限公司，許可證號:SCXK(遼)2010-0001。小鼠的飼養(yǎng)要求均為自然光照條件，室內(nèi)溫度(22±2)℃，相對濕度55%±20%，對所有小鼠進行固體飼料飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。

1.2 藥物

補氣劑四君子湯：白術(shù)9 g，人參9 g，茯苓9 g，炙甘草6 g，共33 g;補血劑四物湯：熟地黃12 g,當(dāng)歸9 g,白芍藥9 g,川芎6 g,共36 g。制備方法：所有藥物加水浸泡后，加入10倍量水，分兩次進行煎煮，時長1 h，將煎煮后的藥液合并，濃縮至100 mL備用，補氣劑藥液濃度配置為0.33 g/mL，補血劑藥液濃度配置為0.36 g/mL，使用前加溫至37 ℃。

1.3 主要試劑

SDS、DTT、過硫酸銨、Urea、IAA、TEAB均來自美國Sigma-Aldrich公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、銀染試劑盒來自中國碧云天生物技術(shù)公司；ACN來自德國Merck KguA Darmstadt公司；二抗來自美國Santa Cruz；Monoclonal Anti-GAPDH antibody produced in mouse來自美國SIGMA 技術(shù)有限公司；iTRAQ Reagents-8plex來自美國AB Sciex公司。

1.4 主要儀器

電子分析天平AL204(上海梅特勒托利多儀器有限公司)；離心機(德國，eppendorf)；pH計(德國，inoLab)；蛋白電泳儀(美國，Bio-Rad)；冷凍干燥機(美國，Thermo Scientific)；超低溫冰箱(美國，Thermo Fi-sher)；安捷倫液相色譜儀1290 Infinity(美國，Agilent Technologies,Inc.)。

2 方法

2.1 實驗動物分組

40只SPF級ICR雌性小鼠，其中3月齡以及16月齡小鼠的數(shù)量分別為10只、30只。隨機選取10只3月齡雌性小鼠為空白組;30只16月齡雌性小鼠隨機分為模型組、四君子組、四物湯組，每組10只。

2.2 給藥方法

四君子湯組、四物湯組每天灌胃給藥劑量為13 mL/kg，空白組及模型組灌胃生理鹽水，劑量為13 mL/kg。

2.3 樣品處理

第30天禁食、自由飲水，經(jīng)過24 h，處死小鼠，方式為頸椎脫位法，取材部位為完整肝臟，然后用冰生理鹽水清洗肝組織，用濾紙吸干水分,將肝組織剪成小塊后放入液氮中快速冷凍處理，保存至-80 ℃冰箱凍存待用。在進行樣本檢測前，選擇肝臟組織大小約為50～100 mg，剪切處理后于冰浴上進行勻漿，同時添加PMSF的線粒體分離試劑A，4 ℃ 15 000 r/min離心5 min，取其上清液，再次4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，獲取的沉淀就是線粒體。

2.4 酶解和iTRAQ標(biāo)記

采用FASP方法[10](蛋白濾膜輔助酶解)進行酶解，制取肽段。完成酶解后，使用100 μL TEAB buffe清洗2次，隨后在其中加入1% FA，此時溶液的濃度是0.1%，充分混合后，每管中加入20 μL，隨后對肽段凍干，在-80 ℃條件下凍存。凍干肽段樣品各取20 μg用于iTRAQ標(biāo)記。

2.5 肽段分級

樣品溶解：100 μg的肽段用24 μL bufferA溶解，高速離心2遍，取20 μL上清液置于上樣瓶中。

2.6 LC-MS/MS分析

應(yīng)用Easy nLC1000和orbitrap Elite液質(zhì)聯(lián)用平臺對iTRAQ標(biāo)記樣品進行數(shù)據(jù)采集。

2.7 生物學(xué)信息分析

使用Maxqunt軟件，對來自O(shè)rbitrap Elite所獲取的MS譜圖進行分析，將數(shù)據(jù)歸一化處理后，利用GO數(shù)據(jù)庫的各節(jié)點映射進行富集分析，之后進行KEGG通路分析，對顯著富集的通路，以KEGG網(wǎng)站提供的繪圖模塊進行渲染。

3 結(jié)果

3.1 蛋白定量結(jié)果

蛋白質(zhì)含量與色氨酸的含量成正線性相關(guān)關(guān)系，因此可以通過測定蛋白質(zhì)樣品中的色氨酸含量來計算蛋白質(zhì)的濃度。

3.2 聚丙烯酰胺凝聚電泳檢測結(jié)果

分離膠的濃度12%，Marker上樣量4 μg， 每個樣品上樣量15 μg，進行SDS-PAGE凝膠電泳分析。結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)電泳結(jié)果條帶清晰，定量較為整齊，降解較少，見圖1。

圖1 蛋白條帶圖

3.3 差異蛋白篩選

差異蛋白篩選以sign.level≥2為條件，結(jié)合差異倍數(shù)(FOLD CHANGE>1.2或FOLD CHANGE<0.83)及P<0.05進行蛋白標(biāo)志物的篩選，確保結(jié)果有較為出色的可靠保障?？瞻捉M與模型組共鑒定出差異蛋白數(shù)量是496個，上調(diào)以及下調(diào)的數(shù)量分別是257個、239個；四物湯組有237個標(biāo)志性蛋白質(zhì)出現(xiàn)了良性回調(diào)；四君子湯組有256個標(biāo)志性蛋白質(zhì)出現(xiàn)了良性回調(diào)；同時受到四物湯組、四君子湯組影響的蛋白有493個。

3.4 Gene Ontology分析

Gene Ontology是組學(xué)實驗常用的方法和工具，對研究有著極為重要的作用。本實驗借助GO數(shù)據(jù)庫富集分析，發(fā)現(xiàn)差異蛋白參與生物進程有類固醇代謝過程、蛋白質(zhì)多泛素化、鈣離子運輸、mRNA加工、高爾基體、脂質(zhì)代謝過程的正調(diào)控等，主要與胞外外泌體、細胞內(nèi)核糖核蛋白復(fù)合物、高爾基體、核、細胞質(zhì)等細胞組分有關(guān)；參與的分子功能有核苷酸結(jié)合、水解酶活性、氨肽酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性、聚(A)RNA結(jié)合等，見表1。

表1 差異表達蛋白GO分析富集結(jié)果(前5位)

3.5 KEGG Pathway分析

KEGG是基因組破譯方面的數(shù)據(jù)庫，用于了解生物系統(tǒng)的分子水平表達。本實驗結(jié)果利用KEGG網(wǎng)站篩選的差異蛋白主要集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、剪接體、脂肪消化吸收、細胞凋亡、阿爾茨海默病5條通路中，見表2。

表2 差異蛋白基因KEGG通路富集分析結(jié)果

4 討論

中醫(yī)學(xué)認為人體生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)是氣和血，氣對人體有推動、溫煦、防御、固攝以及氣化作用；血對人體有濡養(yǎng)以及化神作用。因此有“氣為血之帥”“血為氣之母”的理論。本課題組認為機體的衰老與氣、血密切相關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)小鼠飼養(yǎng)到16月齡后出現(xiàn)蜷縮少動、閉目、毛發(fā)脫落少光澤、鼠尾蒼白等現(xiàn)象，存在著氣血虧虛的癥狀?；诜阶C相關(guān)理論，我們認為通過補益氣血劑可以改善衰老相關(guān)性證候[11]。本實驗以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為依托，深入發(fā)現(xiàn)模型小鼠的肝細胞線粒體中存在與增齡相關(guān)的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，經(jīng)過補益氣血劑干預(yù)后回調(diào)了493個差異蛋白。通過對以上差異蛋白生物學(xué)功能及通路情況的分析，探求補益氣血劑與衰老進程中脾氣虛證相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

實驗結(jié)果可見，差異蛋白主要參與的生物進程有類固醇代謝過程、蛋白質(zhì)多泛素化、鈣離子運輸、mRNA加工、高爾基體、脂質(zhì)代謝過程的正調(diào)控等；參與的分子功能有核苷酸結(jié)合、水解酶活性、氨肽酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性、聚(A)RNA結(jié)合等；主要與胞外外泌體、細胞內(nèi)核糖核蛋白復(fù)合物、高爾基體、細胞核、細胞質(zhì)等細胞組分有關(guān)。

通路主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、剪接體、脂肪消化吸收、細胞凋亡、阿爾茨海默病。

4.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)的調(diào)節(jié)

主要有以下蛋白參與了該途徑：Wolframin、鈣蛋白酶-1催化亞單位(Calpain-1 catalytic subunit)、蛋白質(zhì)SEC13同源物(Protein SEC13 homolog)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凝集素1(Endoplasmic reticulum lectin 1)、泛素結(jié)合因子E4 B ( Ubiquitin conjugation factor E4 B)。

Wolframin是由Wfs1基因編碼而成的蛋白質(zhì)。Wolframin蛋白主要生理功能是分泌、膜的運輸、調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣以及加工。INOUE等[12]1998年第一次發(fā)現(xiàn)WFS1基因。WFS1基因定位于人染色體4p16.1，由8個外顯子組成，其中最長片段是exon8，大約為2.6 kb。WFS1蛋白質(zhì)或Wolframin蛋白質(zhì)是WFS1基因編碼的跨膜糖蛋白質(zhì)[13],大約由890個氨基酸組成[14]。Wolframin蛋白質(zhì)主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上,由細胞質(zhì)N端親水部分、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的C端親水部分和中間疏水區(qū)域3個結(jié)構(gòu)域，其包括了330～650的氨基酸[15]。YAMADA等人[16]發(fā)現(xiàn)小鼠胰島中的活性X盒結(jié)合蛋白1以及PERK磷酸化水平升高是由于WFS1基因缺陷引發(fā)的，其分子伴侶表達量的增長體現(xiàn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平的增長；其次還伴隨著caspase-3裂解水平上升以及BrdU陽性細胞降低，并發(fā)現(xiàn)細胞周期的損傷和死亡都會比平時要快，導(dǎo)致此類現(xiàn)象的原因主是細胞周期的調(diào)節(jié)因子P21CIP1升高所致，但過度表達P21CIP1是影響細胞數(shù)量減少的主要原因，同時也表明P21CIP1的升高和WFS1基因缺陷胰島中β細胞數(shù)量減少。SHANG等[17]將Wolfram綜合征患者身上的皮膚纖維細胞體外誘導(dǎo)為多能干細胞，促使其能夠分化為β細胞, 進而發(fā)現(xiàn)缺陷的β細胞中胰島素含量在逐漸減少, 而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平則會提升，在PERK、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白肌醇激酶1和ATF6這3條主要的UPR通路活性都會相應(yīng)提升：分子伴侶4-苯基丁酸能協(xié)助進行蛋白折疊, 這對于降低UPR信號通路活性具有幫助, 不僅如此，還能提升細胞內(nèi)的胰島素，這表明WFS1基因?qū)τ讦录毎哂幸欢ǖ谋Ｗo作用，見圖2。

4.2 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease)的調(diào)節(jié)

主要有以下蛋白參與了該途徑：鈣蛋白酶-2催化亞單位(Calpain-2 catalytic subunit)、鈣蛋白酶-1催化亞單位(Calpain-1 catalytic subunit)、去整合素和含10蛋白的金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域Amyloid-beta A4 protein淀粉樣βA4蛋白(Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10)、線粒體細胞色素C氧化酶亞基7C(Cytochrome c oxidase subunit 7C, mitochondrial)、1-磷脂酰肌醇4,5-二磷酸磷酸二酯酶β-3(1-phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate phosphodiesterase beta-3)、BH3相互作用域死亡激動劑(BH3-interacting domain death agonist)、半胱天冬酶-7(Caspase-7)。

鈣蛋白酶-2催化亞單位(Calpain-2 catalytic subunit)是由Capn2基因編碼而成的蛋白質(zhì)，屬于鈣蛋白酶超家族的主要成員之一。鈣蛋白酶是一種降解肌纖維蛋白依賴鈣離子、半胱氨酸的蛋白酶，在動物組織中廣泛存在。鈣蛋白酶系統(tǒng)主要的參與對象是磷酸酶、細胞骨架、細胞凋亡、蛋白激酶以及激素受體。病理狀態(tài)下, 異常的鈣離子濃度能激活Calpain，進而造成組織損失從而影響了酶和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并對細胞骨架、蛋白激酶產(chǎn)生降解作用。診斷阿爾茨海默病(AD)主要包括β淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)濃度降低、細胞內(nèi)的神經(jīng)纖維纏結(jié) (neurofibrillary tangle, NFT)。研究表明Ca2+信號異常是引發(fā)Calpain過度激活直接或間接影響AD的大腦病變[18]。LOPES等[19]研究發(fā)現(xiàn)大鼠腦皮層神經(jīng)元通過Aβ40和prp106-126處理后，引發(fā)CDK5的異常，由合成胎處理后p25水平顯著增強，CDK5的抑制劑與鈣蛋白酶的抑制劑可改變tau蛋白的過磷酸化且能有效阻止神經(jīng)元死亡。

半胱天冬酶-7(Caspase-7)是由Casp7基因編碼而成的蛋白質(zhì)，其酶活性是完成凋亡細胞死亡所必需的，屬于半胱天冬酶的一個亞型結(jié)構(gòu)。半胱天冬酶家族在哺乳動物的細胞凋亡途徑及細胞內(nèi)凋亡信號的誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴增中起著重要作用。Caspase3、Caspase6、Caspase7是Caspase家族中的凋亡執(zhí)行因子。申雷娜[20]通過對早期胎停的絨毛組織中細胞凋亡情況進行檢測發(fā)現(xiàn)Caspase3、Caspase7對早期胎停的調(diào)控是通過凋亡路徑，并可作為妊娠初期篩查胚胎停止發(fā)育病因的分子標(biāo)記物，見圖3。

結(jié)合上述觀點分析可知，補益氣血劑在抗衰老方面有著積極意義, 本文從蛋白質(zhì)組學(xué)視角出發(fā)，就自然衰老小鼠中補益氣血劑干預(yù)價值進行分析。通過研究指出，16月齡模型組小鼠肝組織樣本中蛋白質(zhì)標(biāo)志物與3月齡空白組存在差異；補益氣血劑對16月齡小鼠肝組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、剪接體、脂肪消化吸收、細胞凋亡、阿爾茨海默病等途徑具有調(diào)節(jié)作用。通過調(diào)節(jié)這些信號通路的相關(guān)蛋白，進而對增齡產(chǎn)生的相關(guān)機體功能紊亂起到保護和調(diào)節(jié)作用。