基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探究槲皮素治療非小細(xì)胞肺癌的作用機(jī)制

韓坤余，熊常州，夏雪，高朗，王怡丁，蔡政，吳繼萍，牛華濤

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650021；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075；3.云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650021；4.云南省腫瘤醫(yī)院，云南 昆明 650118）

肺癌是最常見的癌癥之一，全世界每年有180 多萬新確診的肺癌病例（占全部確診癌癥病例的13%）和160 萬肺癌相關(guān)死亡病例（占總數(shù)的19.4%）［1］。非小細(xì)胞肺癌（non－small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌亞型的85%［2］。NSCLC 目前主要采用手術(shù)、放射治療、化療、靶向治療和免疫治療［3］，雖然可緩解患者癥狀并提高生活質(zhì)量，但患者的五年生存率仍然很低，且產(chǎn)生很多的毒副作用［4］。中醫(yī)藥具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、阻滯癌細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡，下調(diào)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子表達(dá)，抑制腫瘤血管生成等多種作用［5］。槲皮素（quercetin）是多種中藥的有效成分，如半枝蓮、敗醬草、柴胡、黃芪、黃連和苦參等［6］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，槲皮素具有多重生物活性，如抗氧化、抗病毒、抗癌、肝細(xì)胞保護(hù)、心臟保護(hù)、腎臟保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)和眼保護(hù)等［7］。研究證實(shí)，槲皮素可促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、抑制轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和抑制腫瘤血管生成［8］，并可通過上調(diào)p53、Fas、Bax 和Bag 等凋亡基因以及下調(diào)抗凋亡基因Bcl－2，發(fā)揮誘導(dǎo)NSCLC 細(xì)胞凋亡并抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用［9］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于系統(tǒng)生物學(xué)理論和大數(shù)據(jù)挖掘的方法，通過研究中藥或中藥復(fù)方的潛在活性成分和作用靶點(diǎn)，對生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，并系統(tǒng)、全面地評價中藥成分與作用機(jī)制，進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計的新興學(xué)科［10-12］。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，挖掘槲皮素的作用靶點(diǎn)，結(jié)合生物信息學(xué)的優(yōu)勢，構(gòu)建“槲皮素－靶點(diǎn)－NSCLC”的網(wǎng)絡(luò)模型，探究槲皮素治療NSCLC 的分子與信號通路機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 槲皮素作用靶點(diǎn)獲取

在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲取槲皮素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，并通過Pharmmappe（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）和 Uniprot（http：//www.Uniprot.org）數(shù)據(jù)庫獲取槲皮素靶標(biāo)基因。

1.2 NSCLC相關(guān)靶點(diǎn)獲取

以“non－small cell lung cancer”為關(guān)鍵詞在GEO數(shù)據(jù)庫檢索并下載NSCLC 基因芯片GSE19188，運(yùn)用Perl、R 語言進(jìn)行基因注釋以獲得NSCLC 相關(guān)差異基因。魯棒多陣列平均（RMA）方法進(jìn)行芯片數(shù)據(jù)的背景校正和歸一化處理。R 軟件limma 包篩選差異表達(dá)的基因。以P＜0.05和|logFC|＞1為截斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與富集分析

對槲皮素的作用靶點(diǎn)與NSCLC 的相關(guān)基因靶點(diǎn)繪制韋恩圖，獲得槲皮素抗NSCLC 的潛在作用靶點(diǎn)。將其導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string－db.org/）。再導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建槲皮素治療NSCLC 的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），使用MCODE 插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觥＠肦 語言limma和heatmap 包對槲皮素抗NSCLC 的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行結(jié)果可視化，得到GO 功能和KEGG 通路富集分析。

1.4 分子對接與生存分析

根據(jù)上述篩選的核心靶點(diǎn)，從PDB 數(shù)據(jù)（https：//www.rcsb.org/）下載蛋白質(zhì)3D 結(jié)構(gòu)（pdb 格式）。利用AutoDock 軟件對靶蛋白進(jìn)行加水、去氫、分離配體和受體等，并將槲皮素及靶蛋白格式轉(zhuǎn)換為pdbqt 格式。利用AutoDock Vina 計算靶點(diǎn)與配體之間的對接活性，得分＜-7.0 分說明兩者之間有強(qiáng)烈的對接活性，可作為槲皮素治療NSCLC 作用靶點(diǎn)的篩選依據(jù)。利用Kaplan－Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫（http：//kmplot.com/analysis/）對槲皮素治療NSCLC 的PPI關(guān)鍵基因進(jìn)行五年生存與預(yù)后分析。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素潛在靶點(diǎn)的獲取

利用Pubchem 數(shù)據(jù)庫和Pharmmapper 數(shù)據(jù)庫篩選并獲得229 個槲皮素化學(xué)成分對應(yīng)靶點(diǎn)蛋白，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫匹配所對應(yīng)的人類基因靶點(diǎn)。

2.2 槲皮素抗NSCLC的潛在作用靶點(diǎn)

通過基因注釋和差異基因篩選共獲得1 448 個NSCLC 作用靶點(diǎn)，對229 個槲皮素的有效成分作用靶點(diǎn)與1 448 個NSCLC 作用靶點(diǎn)繪制韋恩圖，得到槲皮素抗NSCLC的33個潛在作用靶點(diǎn)。見圖1。

圖1 槲皮素作用靶點(diǎn)與NSCLC相關(guān)靶點(diǎn)交集

2.3 成分－靶點(diǎn)－疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與蛋白質(zhì)（PPI）分析

將33個潛在作用靶點(diǎn)上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫得到潛在作用靶點(diǎn)互作關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建槲皮素治療NSCLC 的PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2。在拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)中包含29個節(jié)點(diǎn)，52條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為3.15，平均局部聚類系數(shù)為0.575。使用MCODE插件得到3 個功能聚類模塊，模塊1 共6 個節(jié)點(diǎn)和9 條邊，得分3.6分，見圖3A。模塊2共5個節(jié)點(diǎn)和5條邊，得分5 分，見圖3B。模塊3 共4 個節(jié)點(diǎn)和6 條邊，得分4 分，見圖3C。根據(jù)得分可得到PLK1、KIF11、CHEK1和ANG 等15 個關(guān)鍵基因，其中4 個關(guān)鍵基因的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析見表1。

表1 槲皮素蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯?個核心基因）

圖2 槲皮素抗NSCLC靶標(biāo)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖3 功能聚類模塊

2.4 GO和KEGG富集分析

利用ClusterProfiler 對槲皮素抗NSCLC 的33 個潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析。顯著性前15 條的GO 功能與KEGG 通路見圖4，圖4A、B、C 分別表示前15 條GO 富集分析的生物過程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞組分（CC），圖4D 表示前15 條KEGG 通路。生物過程包括先天免疫反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控和蛋白水解等。分子功能包括蛋白質(zhì)結(jié)合、膠原結(jié)合等。細(xì)胞組分包括膜、核和細(xì)胞質(zhì)等。KEGG 通路富集分析包括癌癥信號通路、TNF信號通路、PPAR 信號通t 路、IL－17 信號通路和細(xì)胞色素P450 等。

2.5 分子對接與生存分析

槲皮素與核心治療靶點(diǎn)PLK1、KIF11、CHEK1、ANG 的分子對接得分見表2，對接圖見圖5。得分均＜-7.0 分，說明兩者之間有強(qiáng)烈的對接活性，可作為槲皮素治療NSCLC 作用靶點(diǎn)的篩選依據(jù)。Kaplan－Meier（K－M）生存分析結(jié)果表明，PLK1（P＜1E－16）、KIF11（P= 6.8E－14）、CHEK1（P= 4.11E－15）和ANG（P= 0.004 8）基因與NSCLC 患者的五年總生存率顯著相關(guān)。見圖6。

表2 槲皮素與核心治療靶點(diǎn)分子對接得分（分）

圖5 槲皮素與4個核心基因的分子對接圖

圖6 生存分析

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為非小細(xì)胞肺癌可歸于“肺積”“肺壅”“肺巖”“息賁”等范疇。臟腑氣血虧虛、邪毒外侵或內(nèi)生以及氣、血、痰、瘀、毒互結(jié)為本病主要病機(jī)，如《諸病源候論》云：“積聚者，由陰陽不和，臟腑虛弱，受于風(fēng)邪，搏與腑臟之氣所為也”。中醫(yī)藥在治療非小細(xì)胞肺癌方面發(fā)揮了獨(dú)特的優(yōu)勢。研究表明，中藥有效成分及復(fù)方抗NSCLC的機(jī)制包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、自噬，抑制腫瘤細(xì)胞生長、增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等［13］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)證實(shí)多種中藥和方劑均具有抗NSCLC的作用靶點(diǎn)，如夏枯草、黃芪和葦莖湯等［14-16］。研究發(fā)現(xiàn)，中藥聯(lián)合化療可顯著提高臨床療效和免疫功能，并可降低不良反應(yīng)發(fā)生率。在維持治療中晚期NSCLC的疾病控制、癥狀改善、生存期延長及生活質(zhì)量提高方面，中醫(yī)藥發(fā)揮了極大作用［17-18］。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)槲皮素及其衍生物可通過抑制有絲分裂所必需蛋白質(zhì)的合成，使癌細(xì)胞周期停滯在G0/G1 期［19］，并激活PI3K/Akt 分子途徑，進(jìn)而減少癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［20］。研究顯示，槲皮素可調(diào)節(jié)活性氧（reactive oxygen species，ROS）介導(dǎo)的蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）通路，以及調(diào)節(jié)MAPK 和AMPK 信號通路。PKC 可抑制癌細(xì)胞增殖和存活，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［21］。AMPK 的重要催化亞基AMPK α1可調(diào)控硫氧還原蛋白（thioredoxin，Trx）表達(dá)，下調(diào)ROS 水平，導(dǎo)致NSCLC 中高表達(dá)A549 細(xì)胞的凋亡，MAPK 信號通路中的p38 MAPK 途徑在影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞周期、分化、凋亡和自噬等方面的作用［22-23］。槲皮素可激活Caspase－3、Caspase－8 和Caspase－9，刺激促凋亡基因Bax、Bad 的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白［24］。Caspase－3 的表達(dá)可抑制肺癌腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移［25］。槲皮素可通過抑制EGFR 酪氨酸激酶活性與自磷酸化水平進(jìn)而影響EGFR 信號通路，超過60%的NSCLC 表達(dá)EGFR，EGFR 已成為治療NSCLC的重要靶標(biāo)［26-27］。槲皮素還可通過誘導(dǎo)VEGF 受體2（VEGFR2）抑制腫瘤調(diào)控因子AKT 的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤的生長［8］。

Polo樣激酶1（polo－like kinase 1，PLK1）參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和不同階段的有絲分裂。研究表明，抑制PLK1 可導(dǎo)致NSCLC 周期停滯在G2/M 期，抑制有絲分裂紡錘體成熟，而紡錘體的完整性決定了細(xì)胞分裂在時間和空間上的準(zhǔn)確性［28］。在PLK1 研究最廣泛的抑制劑Volasertib 中，人體抑癌基因p53 表達(dá)狀態(tài)不同的NSCLC 細(xì)胞系，如A549 和A549－NTC，均可以體現(xiàn)PLK1抑制對細(xì)胞生長、周期分布、誘導(dǎo)細(xì)胞死亡、細(xì)胞衰老和遷移等方面的敏感性［29］。驅(qū)動蛋白家族成員11（kinesin family member 11，KIF11）有助于有絲分裂紡錘體的成熟和形成。研究顯示，其在NSCLC 中的表達(dá)高于癌旁細(xì)胞，并且與NSCLC 的總生存時間、總體存活率與不良預(yù)后顯著相關(guān)［30］。檢查點(diǎn)激酶（checkpoint kinase，CHEK）的家族成員CHEK1 是miR－195 的直接靶標(biāo)，miR－195 在NSCLC 中表達(dá)的增加抑制了癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，低CHEK1 蛋白與NSCLC 患者的良好生存有關(guān)，作為NSCLC 治療的新分子靶標(biāo)，高miR－195、低CHEK1 可以協(xié)同抑制腫瘤生長并改善NSCLC 患者的生存［31］。血管生成素（angiopoietin，ANG）家族中的Ang－2 作為一類重要的促血管生成因子，通過IL－10、血管滲漏相關(guān)因子和凋亡轉(zhuǎn)移蛋白等可以促進(jìn)NSCLC 的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并且可以與VEGF 通過PI3K/Akt 信號通路途徑相互作用，影響腫瘤新生血管的生成［32］。

通過對槲皮素作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行了GO 生物學(xué)過程富集分析，證實(shí)了槲皮素對蛋白水解、蛋白質(zhì)結(jié)合和紡錘體微管等生物學(xué)過程有一定影響，這些生物學(xué)過程在槲皮素治療NSCLC 所涉及的作用靶點(diǎn)及其相關(guān)通路都有體現(xiàn)。在KEGG 富集分析中，證實(shí)槲皮素對癌癥信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators－activated receptors，PPAR）信號通路、白介素－17（interleukin－17，IL－17）信號通路和細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP）等多種癌癥相關(guān)通路有調(diào)控作用。TNF 信號通路的失調(diào)可以引起腫瘤，炎癥等多種疾?。?3］，TNF－α可以激活NFκB 信號通路，起到影響癌細(xì)胞增殖、腫瘤血管生成和細(xì)胞凋亡等方面的作用［34］。IL－17 在NSCLC 患者腫瘤組織中高表達(dá)，并通過趨化作用使炎性因子聚集，炎性因子在腫瘤血管的生成以及免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用［35］，并可通過CD4+、CD8+T 細(xì)胞抑制腫瘤細(xì)胞浸潤，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)［36］。CYP 可在NSCLC 中高表達(dá)，并且可以通過肝臟代謝影響抗NSCLC 腫瘤藥物的活性，其中CYP19和CYP24可能成為NSCLC 治療的新靶點(diǎn)［37］。PPAR的家族成員PPAR－γ可通過拮抗NF－κB通路，抑制NSCLC 腫瘤細(xì)胞中血管生成趨化因子的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤相關(guān)血管的生成［38］。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接分析方法探究槲皮素對NSCLC 的作用機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用槲皮素輔助治療NSCLC 提供了新思路和重要理論依據(jù)。然而本研究的數(shù)據(jù)主要從數(shù)據(jù)庫中獲得，故具體結(jié)果仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。