基于網(wǎng)絡藥理學探討白芍治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的分子機制

郭子琳，夏聰敏，唐曉頗?

（1.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種慢性自身免疫病，患者體內(nèi)產(chǎn)生異常的自身抗體、補體和免疫復合物［1-2］，常攻擊多器官、多系統(tǒng)［3］。SLE 在我國患病率達30～70/10 萬［4］，其發(fā)病機制尚無定論，臨床癥狀復雜多樣，病勢遷延，威脅著眾多育齡期女性［5-6］。糖皮質激素、免疫抑制劑是臨床常用藥［7］，但由于遠期療效及安全性欠佳、價格昂貴等問題，本病治療始終存在瓶頸［8］。

中醫(yī)對SLE 的認識歷史悠久，《內(nèi)經(jīng)》云：“風雨寒熱不得虛，邪不能獨傷人。此必因虛邪之風……乃客其形”，點明其發(fā)病核心在于本虛；《金匱要略》專篇首次以“陰陽毒”命名，認為病機屬虛實夾雜，邪盛正虛貫穿始終［9］。近年來，中醫(yī)藥治療SLE 嶄露頭角，在增效減毒、調節(jié)免疫、控制疾病活動、促進激素撤減等方面優(yōu)勢突出［10］。白芍作為風濕免疫科常用中藥，臨床療效確切［11-12］，不僅能明顯改善SLE 患者實驗室指標，降低血清免疫因子水平［13-14］，還能控制疾病活動，激活低表達免疫細胞［15］。但其發(fā)揮作用的具體物質基礎和分子機制尚待闡明。

網(wǎng)絡藥理學是在疾?。悬c－藥物的多層次網(wǎng)絡基礎上研究起效機制，與中醫(yī)整體觀念相呼應，應用十分廣泛［16-17］。本研究借助此方法，挖掘白芍治療SLE的深層機制，探討其科學內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 白芍活性成分篩選和靶點預測

基于TCMSP平臺［18］（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索并篩選出口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18［19］的白芍活性成分，結合文獻補充完善篩選結果。從PubChem［20］（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫查找對應的標準化 SMILES 格式導入SwissTargetPrediction［21］（http：//www.swisstargetprediction.ch/）平臺，得到活性成分對應的靶標，與TCMSP所預測靶標匯總去重后，利用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫進行基因標準化處理。

1.2 白芍“活性成分－靶點”網(wǎng)絡構建

利用Cytoscape3.7.2［22］軟件將上述結果構建為“白芍－活性成分－潛在靶標”網(wǎng)絡圖，其中藥物、活性成分、潛在靶標以“節(jié)點”（node）表示，三者關聯(lián)情況由“邊”（edge）呈現(xiàn)。

1.3 疾病相關靶點確定

以“systemic lupus erythematosus”為關鍵詞，從TTD［23］、OMIM［24］、GeneCards［25］、DrugBank［26］、CTD［27］等數(shù)據(jù)庫檢索、篩選疾病靶點，去重后導入Uniprot 數(shù)據(jù)庫實現(xiàn)基因標準化，獲得SLE 相關靶點，再通過Venny（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）平臺提取出白芍和SLE的交集靶點。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡構建及關鍵靶點篩選

將白芍與SLE 相關靶點分別導入BisoGenet 插件中，得到各自的蛋白互作（protein protein interaction，PPI）網(wǎng)絡，利用Merge 功能獲取二者交集部分，結合拓撲分析插件CytoNCA［28］及相關研究文獻，將交集網(wǎng)絡中各節(jié)點的屬性值逐一進行分析。算出連接度的中位數(shù)并提取所有大于其2 倍值的節(jié)點，得到“Hit hubs”網(wǎng)絡。接著提取所有大于連接度（degree centrality，DC）2 倍中位數(shù)的節(jié)點，以及所有大于緊密度（closeness centrality，CC）、介度（betweenness centrality，BC）、特征向量（eigenvector centrality，EC）、網(wǎng)絡中心性（network centrality，NC）和局部邊連通性（local average connectivity，LAC）中位數(shù)的節(jié)點，作為核心靶點。

1.5 通路富集分析

數(shù)量龐大的基因、蛋白生物功能注釋信息都可通過檢索DAVID 數(shù)據(jù)庫［29］（https：//david.ncifcrf.gov/）獲得。將白芍與SLE 的共同靶點錄入DAVID 數(shù)據(jù)庫，勾選GO 插件中的生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）選項，以及Pathway插件中的KEGG 選項，完成富集分析。提取GO 中P值＜0.1、KEGG 中P值＜0.05 的結果，經(jīng)微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）平臺繪制氣泡圖，P值展示為節(jié)點顏色變化，氣泡大小表示基因數(shù)。

2 結果

2.1 白芍活性成分篩選與ADME分析

TCMSP 數(shù)據(jù)庫共檢索出白芍相關成分85 個，經(jīng)OB 和DL 篩選出13 個，查詢靶點及相關文獻后剔除4個，最終納入有效活性成分9個，見表1。

表1 白芍活性成分表

2.2 “活性成分－靶點”網(wǎng)絡構建

利用靶點預測技術得到80 個相關靶點，經(jīng)Cytoscap 3.7.2繪制白芍“活性成分－靶點”網(wǎng)絡，網(wǎng)絡中共存在90 個節(jié)點（包含80 個靶點和9 個活性成分）和138 條關系，見圖1。節(jié)點面積越大表示度值越大，生物學功能和重要性相應提升。

圖1 白芍“活性成分－靶點”網(wǎng)絡圖

2.3 疾病相關靶點獲取

檢索TTD、OMIM、GeneCards、DrugBank、CTD 數(shù)據(jù)庫，分別得到疾病靶點133、545、29、67、100 個，匯總去重后共計793 個。繪制Venn 圖，見圖2，可視化展示二者交集，可見白芍治療SLE的潛在靶點有20個。

圖2 白芍治療SLE的潛在靶點Venn圖

2.4 PPI網(wǎng)絡構建和關鍵靶點分析

利用BisoGenet插件分別構建白芍和SLE的PPI網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)白芍可通過2 989 個靶點發(fā)揮作用，其間相互關系達70 169 條；SLE 潛在靶點有7 476 個，關聯(lián)達176 712條，二者交集網(wǎng)絡見圖3。

圖3 白芍與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的PPI交集網(wǎng)絡

為進一步擴充節(jié)點連接信息、提升傳遞效率、明確關鍵作用靶點，對PPI網(wǎng)絡進行了2次拓撲屬性篩選，得到關鍵靶點278個，篩選策略和最終結果見圖4～5。

圖4 白芍干預SLE關鍵節(jié)點的篩選策略

2.5 白芍“活性成分－靶點－疾病”生物學功能和通路分析

運用DAVID 數(shù)據(jù)庫進行富集分析，并根據(jù)所涉及的信號通路推測潛在作用機制。取GO 富集BP 模塊中P值＜0.1、KEGG 中P值＜0.05 的結果繪制氣泡圖，結果見圖6。其中，橫軸為通路基因在總體中所占的比率，縱軸為富集名稱，氣泡顏色由紅到綠表示-log10（P）值依次減小，氣泡大小代表該通路所包含的基因數(shù)。

圖6 白芍治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡作用靶點富集分析氣泡圖

圖5 白芍核心靶點PPI網(wǎng)絡

GO 富集得到127 個結果，其中BP 94 個，CC 6 個，MF 27 個，KEGG 富集得到34 條通路。分析結果提示：白芍調控SLE主要涉及炎癥反應、轉錄因子調控、細胞因子合成、氧化應激抵抗、激素藥物反應和細胞增殖、分化、凋亡等生物學過程，以及TNF、花生四烯酸代謝、Nod 樣受體（NOD－like receptor signaling pathway，NLR）、Toll 樣受體（toll－like receptor signaling pathway，TLR）、癌癥、細菌感染、激素合成等多條信號通路。

2.6 “成分－靶點－通路”網(wǎng)絡構建

根據(jù)KEGG 及其映射的顯著差異基因，構建“成分－靶點－通路”網(wǎng)絡，包括22條信號通路、17個基因靶點、7個成分和119條關系，見圖7。據(jù)圖推測，白芍干預SLE 的關鍵靶基因可能為Degree 值較大的TNF、CASP3、IL6、CASP8、TGFB1、NOS2。

圖7 “成分－靶點－通路”網(wǎng)絡圖

3 討論

SLE 可歸屬“痹病”“陰陽毒”“紅蝴蝶瘡”等范疇［30］。臨床醫(yī)家多認為SLE 證屬本虛標實，毒蘊血瘀是病理關鍵，故以扶正祛邪為治療大法［31］。白芍是毛茛科植物芍藥的干燥根，性微寒，味苦而酸，入肝、脾經(jīng)，可養(yǎng)血柔肝止痛、斂陰平抑肝陽，是風濕免疫病組方常用中藥。藥理學研究證實［32］，白芍具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝、抗氧化等功效。臨床從氣、血、水辨治SLE，取白芍滋陰利水、扶脾胃、解藥毒之效，療效確切［33］。網(wǎng)絡藥理學與中醫(yī)整體觀念高度重合，故筆者選用這一方法探索白芍治療SLE的起效機制。

本研究共篩選出芍藥苷、兒茶素、山柰酚在內(nèi)的白芍核心成分9 個，涉及60 個靶點，富集結果分布在NF－κB、TNF、Toll 樣受體、Nod 樣受體及花生四烯酸代謝、癌癥、雌激素等信號通路，充分展現(xiàn)出了白芍多成分、多靶點、多通路治療SLE的特點。

研究顯示［34-35］，芍藥苷可通過NF－κB和ERK通路相關機制阻礙TNF－α 誘導趨化因子的產(chǎn)生和白細胞遷移，從而發(fā)揮體外抗炎作用；還可抑制免疫調節(jié)因子及組織蛋白mRNA表達、調節(jié)細胞免疫以治療疾?。?6］；同時能促進骨髓造血以增強免疫功能［37］，與扶正固本的中醫(yī)思想不謀而合。目前廣泛應用的白芍總苷復合制劑含40%以上芍藥苷成分，具有抗炎和雙向免疫調節(jié)等作用［38-39］，且療效溫和、適用性強、安全性佳，已成為臨床優(yōu)選用藥方案［40-41］。兒茶素憑借對Th17/Treg特異性轉錄因子ROR－γt mRNA/Foxp3 mRNA 表達的雙重調節(jié)作用，使機體恢復免疫平衡狀態(tài)［42］。山柰酚可使免疫抑制細胞Treg 活化，實現(xiàn)免疫耐受和免疫穩(wěn)態(tài)［43］。

根據(jù)富集結果推測白芍治療SLE 的起效機制，可概括為以下兩種：

（1）直接調控TLRs、NLRs、NF－κB、TNF 等信號通路。TLRs通路以NF－κB活化和免疫應答基因轉錄為主，TLR 屬于模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR），可特異性識別病原體并啟動炎癥信號通路［44］。研究發(fā)現(xiàn)［45-46］，B 細胞中固有的TLR7 缺失可抑制自身免疫；相反TLR9缺失則促使免疫復合物（IC）沉積，加劇系統(tǒng)性炎癥；TLR9激活是SLE常見并發(fā)癥狼瘡腎炎發(fā)生的重要原因［47］。多效應細胞因子TNF－α由T 細胞和單核－巨噬細胞分泌，通過影響機體免疫應答參與SLE 發(fā)病過程［48］；還能加劇組織相容性抗原之間的免疫反應，導致疾病進展［49］。NLR 家族同屬天然免疫PRR，在病原和損傷相關分子模式的識別中舉足輕重［50］。家族中的NOD 蛋白和配體結合后，可通過下游受體蛋白的相互作用激活NF－κB 通路，誘導促炎細胞因子及趨化因子轉錄上調，介導炎癥反應［51-52］，還能催化凋亡相關細胞因子的表達以及參與1 型糖尿病等適應性免疫反應的啟動［53］。白芍或許能直接調控上述通路，從而改善SLE。

（2）間接調控信號通路和多系統(tǒng)代謝靶點?；ㄉ南┧嵬ㄟ^COX 酶代謝生成前列腺素，引起疼痛、血管擴張（腫脹和紅腫）和發(fā)熱等癥狀［54-55］；5－LO 酶與激活蛋白結合推動花生四烯酸轉化形成白三烯，促使中性粒細胞趨化［56］。雌激素促炎和抗炎雙向作用分別由受體ER－α、β介導，其表達量分別同SLE患者病情活動度呈正、負相關［57］。雌激素可選擇性激活或抑制miR－145、miR－125a和miR－146a等SLE相關miRNA，影響基因表達［58］。白芍可能通過干預上述通路，間接發(fā)揮對SLE的治療作用。

另外GO 富集分析網(wǎng)絡覆蓋細胞色素P450 酶代謝、細胞凋亡、神經(jīng)營養(yǎng)、脂肪細胞因子和卵巢類固醇合成、癌癥、肌萎縮側索硬化癥、2 型糖尿病等信號通路，說明白芍可調控多個系統(tǒng)和多種代謝途徑靶點，從而影響自身免疫狀態(tài)、干預SLE病理過程。

4 結語

本研究基于網(wǎng)絡藥理學技術，擬深挖白芍物質基礎和對SLE 的起效機制，研究結果與已知文獻報道吻合，驗證了靶點預測技術的準確性，也為中醫(yī)新藥研發(fā)、臨床應用及后續(xù)研究提供了新的依據(jù)。但囿于這一手段的局限性和機體反應的非單一性，僅就白芍的藥理成分進行預測探討，具體機制仍需進一步挖掘和驗證。