蒼術酮對肝癌荷瘤小鼠腫瘤生長、上皮－間充質轉化和凋亡標志物表達的影響

麥靜愔，陳澍，柯碧蓮，何青青，王浩藝，平鍵，陳建杰，成揚

（1.上海市光華中西醫(yī)結合醫(yī)院，上海 200052；2.復旦大學附屬華山醫(yī)院，上海 200040；3.上海市第一人民醫(yī)院，上海 200080；4.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 201203）

原發(fā)性肝癌是高病死率的惡性腫瘤之一，給世界各國人民的健康帶來極大危害。我國是原發(fā)性肝癌的重災區(qū)，患者數(shù)量和病死率均占世界前列。目前肝癌治療尚無特效藥，基本采用綜合治療方案，早期以手術治療為主，對無法手術或者不能耐受手術的，采用TACE、姑息治療和綜合對癥處理，以此控制腫瘤生長和轉移，延長患者生存期［1－2］。肝癌是一種具有高轉移潛能的惡性腫瘤，其復發(fā)和轉移是大多數(shù)肝癌患者治療失敗和死亡的主要原因。上皮－間充質轉化（epithelial－mesenchymal transition，EMT）被認為是腫瘤細胞擴散的初始步驟，可導致惡性腫瘤的侵襲和轉移，因此抑制腫瘤細胞EMT 的發(fā)生對腫瘤的治療具有積極意義［3－4］。

在肝癌的預防治療中，從中醫(yī)藥寶庫中發(fā)掘有效的輔助治療方法，無疑是其發(fā)展方向之一［1］。蒼術為菊科草本植物茅蒼術［Atractylodes lancea（Thunb.）DC.］或北蒼術［Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.］的干燥塊莖，味辛、苦，性溫，具有燥濕健脾、祛風散寒的功效，是臨床許多中藥方劑的重要組成部分。蒼術酮是從蒼術中分離得到的倍半萜類有效成分，現(xiàn)代藥理研究表明，蒼術酮具有保肝、抗病毒和抗腫瘤等多種藥理活性［5－6］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)蒼術酮可抑制肝癌HepG2細胞的增殖和遷移，誘導腫瘤細胞的凋亡［7］。本研究擬在既往研究基礎上，通過在非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠（non－obese diabetes/server combined immune deficiency，NOD/SCID）小鼠左側背部皮下種植HepG2 細胞懸液的方法制備肝癌荷瘤小鼠模型，以進一步研究蒼術酮對腫瘤生長、EMT 和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 肝癌細胞株培養(yǎng)

肝癌細胞株HepG2（美國ATCC，MD，USA）采用常規(guī)傳代保種。細胞使用DMEM 培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）培養(yǎng)，添加10%胎牛血清（美國Gibco 公司）和1%的青霉素和鏈霉素（美國Hyclone 公司），于5%CO2，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 模型制備、分組和給藥

NOD/SCID 小鼠，體質量18～22 g，6～8周齡，購自北京華阜康公司。動物飼養(yǎng)溫度（22 ± 2）°C，濕度50%～60%。所有動物自由進食飲水。適應環(huán)境1 周后開始實驗。在NOD/SCID 小鼠左側背部，皮下種植100 μL的HepG2細胞懸液，劑量為1×107/只。當注射位置腫瘤生長到50～100 mm3之后，將小鼠隨機分為對照組、蒼術酮低劑量組（低劑量組）和蒼術酮高劑量組（高劑量組），每組6只。根據(jù)課題組前期預實驗，將蒼術酮溶于玉米油中，低、高劑量組分別按照5、10 mg/kg劑量灌胃給藥；對照組給予玉米油灌胃。每日1 次，共15 d。

1.3 觀測指標

1.3.1 腫瘤組織體積與質量

實驗結束后處死小鼠，采集血液和相應組織標本，腫瘤瘤體立刻拍照并稱重，取部分腫瘤組織固定于福爾馬林溶液中，待進一步檢測。皮下腫瘤體積測量公式如下：

腫瘤體積（mm3）=0.5×L×W2

其中，L是腫瘤長度，W是寬度。

1.3.2 免疫組化染色法觀察腫瘤組織細胞增殖情況

將固定好的腫瘤組織采用石蠟進行包埋，切成5 μm 組織切片，貼附在載玻片上。使用二甲苯和梯度分級乙醇對切片進行脫蠟和再水化，再將切片浸入目標回收溶液中水浴30 min。用3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶15 min，用山羊血清阻斷非特異性結合50 min。切片依次用Ki－67 Ⅰ抗和HRP 標記的Ⅱ抗聚合物共孵育反應，最后用DAB 染色和甲基綠復染，在顯微鏡下觀察拍攝。

1.3.3 Western blot 法檢測腫瘤組織EMT 標志物、凋亡相關因子蛋白表達水平

用含有1 mmol/L PMSF的RIPA裂解緩沖液（上海碧云天生物技術有限公司）裂解組織樣品，使用BCA法測定蛋白質濃度。用5%脫脂牛奶阻斷非特異性結合1.5 h，Ⅰ抗（Bcl－2、Bax、裂解Caspase－3、α－SMA、波形蛋白、N－鈣黏蛋白、E－鈣黏蛋白、MMP－2、MMP－9、TIMP－2和GAPDH）在膜上孵育4°C 過夜。Ⅱ抗在室溫下孵育1 h。通過化學發(fā)光試劑顯示蛋白質條帶，采用Amersham prime ECL Plus detection system（Pittsburgh，PA）進行定量檢測分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計分析采用SPSS 13.0 軟件，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（±s）表示，多樣本間的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 蒼術酮對肝癌荷瘤小鼠腫瘤體積和質量的影響

實驗結果顯示，對照組肝癌荷瘤小鼠的腫瘤體積和質量都比較大。經治療后，低、高劑量組的腫瘤組織體積和質量均明顯下降（P＜0.01），并呈現(xiàn)劑量依賴性，且高劑量組明顯低于低劑量組（P＜0.05）。見圖1、表1。

表1 各組荷瘤小鼠腫瘤體積和質量比較（±s）

表1 各組荷瘤小鼠腫瘤體積和質量比較（±s）

注：與對照組比較，1）P ＜0.01；與低劑量組比較，2）P ＜0.05。

組別對照組低劑量組高劑量組n6 6 6腫瘤體積（mm3）810.90±111.54 392.85±69.131）329.82±58.231）2）腫瘤質量（mg）730.81±53.70 238.96±40.571）190.41±41.281）2）

圖1 肝癌荷瘤小鼠腫瘤組織

2.2 蒼術酮對肝癌荷瘤小鼠腫瘤細胞增殖的影響

Ki－67 免疫組化染色顯示，對照組Ki－67 陽性染色面積十分明顯，顯示皮下注射的HepG2 細胞增殖活躍；蒼術酮組Ki－67 陽性染色面積均顯著縮小，尤其以高劑量組最為明顯?？梢姡n術酮治療抑制了腫瘤細胞的增殖。見圖2。

圖2 肝癌荷瘤小鼠腫瘤組織Ki-67免疫組織化學染色圖（×100）

2.3 蒼術酮對肝癌荷瘤小鼠腫瘤組織EMT 標志物的影響

Western blot檢測結果顯示，低、高劑量蒼術酮的干預均對EMT（E－鈣黏蛋白、N－鈣黏蛋白、波形蛋白和α－SMA）和EMT促進因子（MMP－2、MMP－9和TIMP－2）的表達產生了作用。與對照組相比較，低、高劑量組均顯著上調了上皮標記物（E－鈣黏蛋白）的表達，下調了間充質標記物（N－鈣黏蛋白、波形蛋白和α-SMA）的表達，顯著增加了TIMP-2的表達，降低了MMP-2和MMP-9的表達，差異均具有統(tǒng)計學意義。見圖3、表2。

表2 各組荷瘤小鼠腫瘤組織EMT標記物的蛋白表達量比較（±s）

表2 各組荷瘤小鼠腫瘤組織EMT標記物的蛋白表達量比較（±s）

注：與對照組比較，1）P ＜0.01，2）P ＜0.05；與低劑量組比較，3）P ＜0.01，4）P ＜0.05。

組別對照組低劑量組高劑量組n6 6 6 TIMP－2 0.104±0.001 0.207±0.0231）0.483±0.0521）3）MMP－2 0.878±0.067 0.353±0.0281）0.306±0.0241）MMP－9 0.826±0.070 0.255±0.0241）0.242±0.0221）N－鈣黏蛋白0.499±0.044 0.328±0.0232）0.134±0.0291）3）E－鈣黏蛋白0.085±0.012 0.193±0.0291）0.277±0.0591）3）波形蛋白1.556±0.129 0.533±0.0551）0.104±0.0201）3）α－SMA 0.886±0.071 0.334±0.0341）0.251±0.0341）4）

圖3 各組肝癌荷瘤小鼠腫瘤組織EMT標記物檢測結果

2.4 蒼術酮對肝癌荷瘤小鼠腫瘤細胞凋亡標志物的影響

Western blot 檢測結果顯示，與對照組比較，低、高劑量蒼術酮的干預均顯著降低了Bcl-2 的表達水平，顯著增加了Bax 和裂解Capase-3 的表達水平，差異均有統(tǒng)計學意義。與低劑量組比較，高劑量組影響更顯著。見圖4、表3。

圖4 肝癌荷瘤小鼠腫瘤組織Bcl-2、Bax和裂解Caspase-3檢測結果

表3 各組荷瘤小鼠腫瘤組織Bcl－2、Bax和裂解Caspase－3的蛋白表達量比較（±s）

表3 各組荷瘤小鼠腫瘤組織Bcl－2、Bax和裂解Caspase－3的蛋白表達量比較（±s）

注：與對照組比較，1）P ＜0.01，2）P ＜0.05；與低劑量組比較，3）P ＜0.05，4）P ＜0.01。

組別對照組低劑量組高劑量組n6 6 6 Bcl－2 0.663±0.058 0.203±0.0251）0.123±0.0201）3）Bax 0.561±0.037 0.731±0.0772）1.094±0.0431）4）裂解Capase－3 0.265±0.033 0.398±0.0372）0.882±0.0761）4）

3 討論

由于肝癌早期臨床癥狀常不明顯，大多數(shù)患者在確診時已發(fā)展到晚期，導致治療十分困難，預后較差。腫瘤細胞的侵襲和遷移能夠促進遠處轉移，這是肝癌患者高復發(fā)率和高病死率的主要原因之一。由于肝癌發(fā)病的分子機制十分復雜，目前臨床藥物的療效有限，效果不甚理想［8］。近年來中醫(yī)藥在對肝癌的治療中不斷取得進展，可從整體上系統(tǒng)地調控機體抑制腫瘤，在臨床上已經漸漸顯露出獨特優(yōu)勢［1－2］。中草藥提取物或其衍生物已成為發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新型抗癌藥物的重要來源［5－6］。作為從蒼術中分離得到的活性成分，既往研究發(fā)現(xiàn)蒼術酮能夠降低肝癌HepG2 細胞線粒體膜電位，增加細胞內ROS 水平，誘導其早期凋亡，并可呈劑量依賴性地抑制肝癌HepG2 細胞的增殖和遷移［7］。本次研究發(fā)現(xiàn)，蒼術酮在整體動物模型上能夠抑制NOD/SCID 小鼠皮下荷瘤的生長，減少了腫瘤體積和質量；Ki－67 免疫組化染色顯示其抑制了腫瘤細胞的生長活性，表明其具有一定的體內抗腫瘤效應。

大量證據(jù)表明，上皮細胞惡性腫瘤可以通過EMT獲得遷移和侵襲能力，從而促進腫瘤的擴散和轉移［9］。EMT 的主要特征是上皮標記物，如E－鈣黏蛋白和ZO－1 的丟失，并伴隨間充質標記物，如波形蛋白、α－SMA 和N－鈣黏蛋白的增加［10］。本次研究結果顯示，蒼術酮干預上調了上皮標志物E－鈣黏蛋白水平，降低了間充質標志物α－SMA、N－鈣黏蛋白和波形蛋白水平。結果提示表面蒼術酮能夠抑制肝癌皮下荷瘤的EMT 過程。

由于腫瘤轉移是涉及一系列復雜相互作用的多步驟過程，細胞外基質和基底膜的降解是促進腫瘤細胞遷移和侵襲的關鍵步驟?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族是一類重要的降解細胞外基質的蛋白水解酶，在細胞外基質的降解中起重要作用，MMP 的高表達可促進腫瘤細胞的侵襲和遷移。MMP－2 和MMP－9 是兩種重要的MMP，在多種腫瘤中高表達，在降解細胞外基質基本骨架Ⅳ膠原中發(fā)揮重要作用［11－12］。本研究發(fā)現(xiàn)，蒼術酮能有效抑制MMP－2 和MMP－9 的表達，并增加MMP 抑制劑TIMP－2 的表達。綜合這些結果表明，蒼術酮可通過抑制EMT和下調MMP－2和MMP－9的表達來抑制肝癌細胞的遷移和侵襲。

Bcl－2家族蛋白在線粒體依賴性凋亡中起主要調節(jié)作用，在正常情況下，Bax 定位于細胞質并與Bcl－2結合形成異二聚體，穩(wěn)定促凋亡蛋白的胞質定位，抑制細胞凋亡。如果Bcl－2/Bax 平衡被凋亡誘導信號破壞，導致Bax 與Bcl－2/Bax 異二聚體分離并轉移到線粒體膜上，即可啟動凋亡途徑［13－15］。本次研究結果顯示，蒼術酮顯著降低了Bcl－2 的表達水平，增加了Bax和裂解Caspase－3的表達水平，結合既往研究，顯示其可能通過凋亡途徑發(fā)揮對肝癌細胞的抑制作用［7］。

綜合研究結果顯示，蒼術酮具有一定的體內抗腫瘤效應，可通過抑制EMT 和下調MMP－2 和MMP－9的表達來抑制肝癌細胞的遷移和侵襲，通過凋亡抑制肝癌細胞的生長。綜合國內外研究顯示，蒼術酮具有抗腫瘤、降血壓、保護呼吸系統(tǒng)、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、保肝、抗流感病毒和除螨等廣泛良好的藥理活性［5，16－17］。深入開展對蒼術酮治療肝癌的研究，可擴展對該成分在現(xiàn)代藥理學方面的新認識，也對合理開發(fā)中藥新藥具有重要意義。