二陳湯對(duì)Lewis肺癌移植瘤血管生成及PI3K/Akt表達(dá)的影響

屈直，王芬，李志明，張燕娜，王玥慧

（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

根據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告，肺癌是世界病死率最高及發(fā)病率第二的癌癥［1］，也是21世紀(jì)以來(lái)迅速發(fā)展的疾病之一。我國(guó)是全球范圍內(nèi)肺癌疾病負(fù)擔(dān)最重的國(guó)家［2］，在老齡化、環(huán)境污染、吸煙等多重因素的影響之下，新罹患肺癌和以肺癌為主要死亡原因的患者人數(shù)逐年遞增。目前臨床上多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)即是中晚期，其五年生存率尚不到20%［3］。鉑類藥物化療是治療肺癌的主要手段，然而其耐藥性、副作用、效益率低等問(wèn)題成為制約其臨床療效的瓶頸［4］?，F(xiàn)代研究表明，中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)免疫功能、促進(jìn)凋亡、抑制血管生成等方面對(duì)肺癌的治療有較好的作用［5］。二陳湯是臨床經(jīng)典方藥，具有燥濕化痰、理氣和中的功效。前期研究顯示，二陳湯加減方聯(lián)合含鉑化療方案可降低痰證非小細(xì)胞肺癌患者外周血中IL－17 的表達(dá)［6］。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，二陳湯加減方的抑瘤率為34.71%，且可改善小鼠體內(nèi)CD4+T 淋巴細(xì)胞水平［7］。本次研究通過(guò)以二陳湯干預(yù)Lewis 肺癌小鼠，觀察其對(duì)移植瘤的作用，并進(jìn)一步研究其對(duì)VEGF/VEGFR－2 分子軸以及對(duì)PI3K/Akt通路的影響，探討其抗肺癌的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及瘤株

40 只4～6 周齡C57BL/6 雄性小鼠，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2014－0004。在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所SPF 級(jí)動(dòng)物房進(jìn)行飼養(yǎng)以及給藥，環(huán)境溫度23～26 ℃，相對(duì)溫度50%～60%，環(huán)境噪音＜60 dB。用于造模的Lewis 瘤株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

二陳湯（組方：法半夏15 g，陳皮15 g，茯苓9 g，炙甘草6 g，生姜7 g和烏梅8 g）中所包含中藥均由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院中藥房提供，常規(guī)水煎煮，根據(jù)小鼠與人的劑量換算公式［6］計(jì)算出小鼠每日劑量，將藥液濃縮至1.35 g/mL，冷凍保存。10 mg/瓶注射用順鉑，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院西藥房提供，批號(hào)：AA1A7030B。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

VEGFR－2、VEGF 抗體（Abcam 公司，貨號(hào)：ab68153、ab39256）；PI3K、Akt 抗體（CST 公司，貨號(hào)：6342S、4968S）；β－肌動(dòng)蛋白抗體（Proteintech group，貨號(hào)：Ag27042）；CD34 抗體（Proteintech group，貨號(hào)：14486－1－AP）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號(hào)：PC0020）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺(tái)（VD－650）；倒置顯微鏡（日本，Olympus公司）；5810 R離心機(jī)（德國(guó)，Eppendorf 公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)，Pro－mega 公司）；DYCZ－24DH 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；92－14860－00 型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)，Alpha Innotech公司）。

1.5 Lewis肺癌小鼠造模及分組給藥

40只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、中藥組、聯(lián)合組和順鉑組，每組各10 只。將細(xì)胞密度為6×106個(gè)/mL 的小鼠Lewis 肺癌細(xì)胞在C57BL/6 小鼠右腋下以0.2 mL/只的劑量進(jìn)行皮下注射接種。7 d后，可在小鼠腋窩皮下觀察到綠圓形隆起，則標(biāo)志著造模成功。造模成功后，對(duì)照組予以0.4 mL 生理鹽水日1 次灌胃；中藥組予以0.4 mL 二陳湯藥液日1 次灌胃；順鉑組予以0.4 mL 生理鹽水灌胃的同時(shí)，用注射用順鉑以200 μL/20 g 劑量進(jìn)行腹腔內(nèi)灌注，每隔3 d灌注1次；聯(lián)合組同時(shí)給予中藥灌胃和順鉑腹腔內(nèi)灌注。各組小鼠均連續(xù)干預(yù)15 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 一般生存狀態(tài)觀察

每日觀察各組小鼠的外在一般行為狀態(tài)、進(jìn)食量、排便、氣味和毛色的狀況，每周稱量1 次體質(zhì)量，并對(duì)各組小鼠的狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估。

1.6.2 Lewis肺癌小鼠抑瘤率測(cè)定

第21 天給藥結(jié)束24 h 后，用脫椎法處死小鼠，剝離腫瘤組織稱重并計(jì)算抑瘤率，腫瘤組織分成兩部分，一部分置于甲醛中固定，另一部分于－20 ℃冷凍保存。

抑瘤率=（模型組平均瘤質(zhì)量－治療組平均瘤質(zhì)量）/模型組平均瘤質(zhì)量× 100%

1.6.3 免疫組化法檢測(cè)各組Lewis 小鼠瘤組織中VEGF、VEGFR－2、PI3K、Akt的含量及MVD值

用病理切片機(jī)將石蠟包埋后的腫瘤組織制成切片，脫蠟水化后用3%過(guò)氧化氫洗滌，將切片置于抗原修復(fù)液中進(jìn)行修復(fù)（置于微波爐中，高火加熱15 min），取出待其冷卻，滴加一抗（稀釋濃度為1∶100），放入濕盒中過(guò)夜，第2天將組織37 ℃恒溫孵育30 min，沖洗后加入二抗，等待30 min 后進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染，脫水封片，封好后在顯微鏡下觀察蛋白的表達(dá)及分布，通常蛋白表達(dá)可見(jiàn)細(xì)胞核中及胞質(zhì)中有棕黃色顆粒樣物質(zhì)，用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析圖像，蛋白的表達(dá)水平以IOD值表示。

CD34 染色后，選擇2 個(gè)血管化程度較高的區(qū)域進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)，采用低光度數(shù)（× 10 物鏡）進(jìn)行計(jì)數(shù)。最終的MVD 值為每個(gè)高血管化區(qū)域（總面積：2.65 mm2）3個(gè)高倍視野（×25物鏡）的平均值。具有清晰管腔或明確線形血管形狀的血管用于計(jì)數(shù)。

1.6.4 Western blot 法檢測(cè)各組Lewis 小鼠瘤組織中PI3K、Akt、VEGF、VEGFR－2蛋白含量

將腫瘤組織剪碎在冰上進(jìn)行慢速研磨，研磨后所獲得的溶液進(jìn)行細(xì)胞裂解并抽提蛋白，用BCA 檢測(cè)試劑盒測(cè)定所獲得的蛋白濃度。蛋白變性后，冷卻上樣，凝膠電泳半干法轉(zhuǎn)入PVDF 膜后置于封閉緩沖液（搖床振蕩1 h），分別加入目的蛋白一抗，4 ℃過(guò)夜，TBST洗滌后孵育二抗，用ECL 顯影條帶顯影并輸入電腦進(jìn)行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法；不滿足正態(tài)分布則使用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般生存狀態(tài)比較

通過(guò)觀察，各組小鼠在接種肺癌細(xì)胞1 周后均逐漸出現(xiàn)不同程度的皮毛光澤消失、脫落，反應(yīng)遲緩，飲食量減少等現(xiàn)象，其中對(duì)照組小鼠尤為明顯。對(duì)照組及中藥組在造模后7 d 出現(xiàn)死亡狀況（對(duì)照組2 只，中藥組3 只，順鉑組1 只）。而聯(lián)合組小鼠一般狀況與其他組比較則相對(duì)較好，飲食量可，反應(yīng)較靈敏，體質(zhì)量無(wú)明顯下降，生存質(zhì)量相對(duì)較好。

2.2 各組小鼠瘤重及抑瘤率比較

中藥組、聯(lián)合組及順鉑組抑瘤率分別為13.04%、22.94%和21.26%。經(jīng)檢驗(yàn)，與對(duì)照組相比，中藥組、聯(lián)合組及順鉑組Lewis小鼠瘤重均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；順鉑組與中藥組瘤重比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余各組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠瘤重及抑瘤率比較（±s）

表1 各組小鼠瘤重及抑瘤率比較（±s）

注：與中藥組比較，*P ＜0.05；與對(duì)照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組別對(duì)照組中藥組聯(lián)合組順鉑組n8 7 9 10瘤重（g）2.75±0.24 2.45±0.44#2.02±0.57##2.20±0.42*##抑瘤率（%）—13.04 22.94 21.26

2.3 各組小鼠腫瘤組織中CD34 表達(dá)值及微血管密度（MVD）比較

聯(lián)合組瘤體組織中CD34的表達(dá)值及MVD 相較于其他組均明顯降低，且在一定的濃度范圍內(nèi)隨濃度增高而降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。順鉑組CD34 的表達(dá)值及MVD 也有所下降，與其他組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠腫瘤組織中CD34表達(dá)值及MVD比較（±s）

表2 各組小鼠腫瘤組織中CD34表達(dá)值及MVD比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與中藥組比較，#P ＜0.05。

組別對(duì)照組中藥組聯(lián)合組順鉑組n8 7 9 10 CD34 41.07±7.22 35.15±10.74 18.15±5.45*#36.12±7.65 MVD（mm2）47.80±6.73 43.64±18.06 28.68±6.05*#32.22±8.33

2.4 各組小鼠腫瘤組織中VEGF、VEGFR－2 表達(dá)情況比較

與對(duì)照組、中藥組相比，聯(lián)合組、順鉑組腫瘤組織中VEGFR－2 蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.05）。而各組之間VEGF 蛋白的表達(dá)量經(jīng)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示二陳湯作用于VEGF/VEGFR－2 分子軸的機(jī)制主要是通過(guò)抑制VEGFR 的表達(dá)。與順鉑組比較，聯(lián)合組雖然VEGFR－2 的蛋白表達(dá)量更低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2、表3。

表3 各組小鼠腫瘤組織中VEGF、VEGFR－2表達(dá)比較（±s）

表3 各組小鼠腫瘤組織中VEGF、VEGFR－2表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與中藥組比較，#P ＜0.05。

組別對(duì)照組中藥組聯(lián)合組順鉑組n8 7 9 10 VEGFR－2 0.41±0.15 0.36±0.14 0.12±0.09*#0.25±0.07*#VEGF 0.58±0.12 0.42±0.12 0.45±0.17 0.33±0.15

圖1 各組小鼠瘤組織中VEGF、VEGFR－2蛋白表達(dá)情況

圖2 免疫組化檢測(cè)各組小鼠腫瘤組織中VEGF、VEGFR－2表達(dá)情況（×400）

2.5 各組小鼠腫瘤組織中PI3K、Akt 蛋白表達(dá)情況比較

與對(duì)照組、中藥組相對(duì)比，聯(lián)合組、順鉑組小鼠腫瘤組織中PI3K、Akt 蛋白的表達(dá)量減少（P＜0.05）；聯(lián)合組與順鉑組比較，雖有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而中藥組與對(duì)照組經(jīng)比較，蛋白的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4、圖3、圖4。

圖3 免疫組化檢測(cè)各組小鼠腫瘤組織中PI3K和Akt的表達(dá)情況（×400）

圖4 各組小鼠腫瘤組織PI3K、Akt蛋白表達(dá)情況

表4 各組小鼠腫瘤組織中PI3K、Akt蛋白表達(dá)量比較（±s）

表4 各組小鼠腫瘤組織中PI3K、Akt蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與中藥組比較，#P ＜0.05。

組別對(duì)照組中藥組聯(lián)合組順鉑組n8 7 9 10 PI3K 0.54±0.12 0.43±0.16 0.17±0.12*#0.12±0.09*#Akt 0.77±0.14 0.58±0.17 0.24±0.11*#0.18±0.07*#

3 討論

二陳湯出自宋代《太平惠民和劑局方》，目前在各類呼吸系統(tǒng)疾病的治療中廣泛應(yīng)用［8］。痰證為肺癌常見(jiàn)中醫(yī)證候［9］，二陳湯在臨床上應(yīng)用于辨證為肺脾氣虛兼見(jiàn)痰濕，癥見(jiàn)乏力納呆、便溏少氣懶言、痰多色白、惡心嘔吐等的肺癌患者。《醫(yī)宗必讀》云：“脾為生痰之源，肺為儲(chǔ)痰之器”，脾胃主運(yùn)化水濕，肺主通調(diào)水道，若脾胃運(yùn)化無(wú)力，肺氣不利，則津液營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)集聚于肺而成痰，故治療痰飲宜在溫化、淡滲、燥濕的同時(shí)調(diào)理肺脾。方中君藥半夏辛溫，能燥濕化痰、和胃降逆止嘔；陳皮理氣燥濕化痰；茯苓健脾淡滲利濕；生姜降逆化痰止嘔；烏梅收斂肺氣；甘草健脾和中、調(diào)和諸藥。其組方配伍標(biāo)本兼顧，為燥濕化痰、理氣和胃的基礎(chǔ)方劑。二陳湯在歷代醫(yī)家臨床治療中更是根據(jù)患者的辨證情況化裁演變出了導(dǎo)痰湯、溫中化痰丸等臨床常用成方。

研究顯示VEGF/VEGFR 軸是腫瘤調(diào)節(jié)血管生成的關(guān)鍵分子軸［10］。而腫瘤細(xì)胞在過(guò)度增殖過(guò)程中，微環(huán)境氧缺乏是誘導(dǎo)腫瘤血管生成的主要因素，環(huán)境中高水平的缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF－1α）則促進(jìn)了肺癌細(xì)胞表達(dá)因子VEGF 增多［11］。VEGF 家族包括VEGFA、VEGF－B、VEGF－C、VEGF－D 等。VEGF 因子通過(guò)與其位于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的受體VEGFR 結(jié)合后，便會(huì)釋放各種生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子，促進(jìn)腫瘤組織中的血管生成。VEGFR 分子根據(jù)其結(jié)構(gòu)通常又有三種：VEGFR－1/Flt－1、VEGFR－2/Flk－1/KDR 和VEGFR－3/Flt－4，在腫瘤組織內(nèi)發(fā)揮促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的主要是VEGFR－2［12］。研究表明，磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）信號(hào)通路在多種癌細(xì)胞中被廣泛激活。該信號(hào)通路起始于PI3K 的活化，導(dǎo)致磷脂酰肌醇－3，4，5的產(chǎn)生，從而激活蛋白激酶B 和下游的mTOR 通路［13］。VEGFR－2 可通過(guò)HIF－1α 激活PI3K/Akt/mTOR 通路，從而發(fā)揮調(diào)控血管新生與重塑的作用。相應(yīng)的PI3K/Akt/mTOR 通路激活后又可以通過(guò)HIF－1α 依賴性或非依賴性機(jī)制反過(guò)來(lái)提高VEGF 的分泌，從而形成一個(gè)正反饋環(huán)［14］。故通過(guò)阻斷PI3K/Akt 通路，可以起到影響腫瘤血管生成的作用。

本研究結(jié)果顯示，與化療藥物順鉑聯(lián)用，二陳湯具有一定的抑瘤作用，且聯(lián)合組在提高小鼠的生活質(zhì)量及免疫功能方面作用較單用順鉑組更加突出。二陳湯聯(lián)合順鉑可減少Lewis 小鼠腫瘤組織中VEGF 及其受體VEGFR－2 的表達(dá)，從而對(duì)腫瘤血管生成起到抑制作用。不僅如此，在抑制VEGF/VEGFR－2分子軸的同時(shí)，二陳湯聯(lián)合順鉑還可以降低小鼠瘤體組織內(nèi)PI3K、Akt 蛋白含量，從而達(dá)到多靶點(diǎn)、多方位調(diào)控腫瘤增殖和血管生成的作用。PI3K下游的mTOR酪氨酸激酶激活A(yù)kt，使其活化為p－Akt，形成二聚體，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核中，活化后的PI3K 能在細(xì)胞核中長(zhǎng)期穩(wěn)定存在，從而使其下游靶基因表達(dá)紊亂，最終導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖［15］。多個(gè)研究證實(shí)，在不同的癌種中，PI3K/Akt通路的活化與腫瘤的血管生成密切相關(guān)［16-18］，對(duì)于PI3K/Akt 通路及其與VEGF/VEGFR－2 分子軸交互作用在腫瘤中的機(jī)制研究仍有待進(jìn)一步深入。

綜上，二陳湯能提高Lewis 肺癌小鼠整體的生存質(zhì)量，聯(lián)合順鉑治療，可對(duì)小鼠移植瘤的增殖、血管生成有一定抑制作用，其機(jī)制為通過(guò)下調(diào)PI3K/Akt 通路繼而影響腫瘤組織中VEGF、VEGFR－2 分子的表達(dá)，從而起到抑制腫瘤血管生成的作用。二陳湯的作用是多靶點(diǎn)、整體性的調(diào)節(jié)，抗腫瘤血管生成是其抗腫瘤作用的重要機(jī)制之一。