帕金森病患者血清中miR-29、PARK2 表達(dá)及其臨床意義

施 劍 袁曉琴 羅 倩 張 蕓

電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬綿陽醫(yī)院 四川省綿陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川綿陽 621000

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直等[1-3]。PD 多發(fā)生于中老年人群，具有較高的發(fā)病率和致殘率[4-5]。PD 發(fā)生與神經(jīng)系統(tǒng)老化、遺傳等多種因素有關(guān)，同時(shí)可能與分子生物學(xué)有一定關(guān)聯(lián)。微小RNA-29（microRNA-29，mir-29）是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的非編碼小RNA 分子，其表達(dá)在多種疾病中發(fā)揮重要作用[6-9]。人帕金森病蛋白2（Parkinson’s disease protein 2，PARK2）與PD的發(fā)生密切相關(guān)[10-11]，而二者對(duì)PD的影響尚不完全清楚。因此，本文對(duì)血清miR-29、PARK2 表達(dá)水平與PD的作用及潛在診斷價(jià)值進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014 年3 月至2020 年5 月四川省綿陽市中心醫(yī)院收治的原發(fā)性PD 患者85 例為PD 組，體檢健康者90 名為對(duì)照組。本研究經(jīng)四川省綿陽市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。PD 組納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合PD的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]；②依從性較高；③自愿加入本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有腦外傷、腦卒中等病史；②入院前服用過藥物治療；③有嚴(yán)重精神疾病，無法配合研究；④臨床資料缺失。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品采集及保存 采集受試者清晨空腹靜脈血5 ml，轉(zhuǎn)速為3500 r/min，離心半徑10 cm，離心15 min后取上清，低溫保存。

1.2.2 miR-29和PARK2 表達(dá)水平檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）：取出待測(cè)血清，按照RNA 提取試劑盒（貨號(hào)：20310；廠家：北京索萊寶科技有限公司）說明書提取總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄（貨號(hào)：AORT-0020；廠家：上海伯易生物科技有限公司）得到cDNA。以cDNA 為模板，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)條件：94℃，5 min；94℃，30 s；60℃，35 s；72℃，20 s，共40個(gè)循環(huán)。引物由北京甘棠飛華生物科技有限公司合成，見表1。血清miR-29、PARK2 相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt法計(jì)算。

表1 引物序列（5’-3’）

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；采用logistic 回歸分析影響因素；使用受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線的曲線下面積（area under curve，AUC）預(yù)測(cè)診斷價(jià)值。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組性別、年齡、BMI 及高血壓占比比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表2。

表2 兩組一般資料比較

2.2 兩組血清miR-29、PARK2 水平比較

PD 組血清miR-29 水平高于對(duì)照組，PARK2 水平低于對(duì)照組（P ＜0.05）。見表3。

表3 兩組血清miR-29、PARK2 水平比較（）

表3 兩組血清miR-29、PARK2 水平比較（）

注 PD：帕金森??；mir-29：微小RNA-29；PARK2：人帕金森病蛋白2

2.3 PD 影響因素的logistic 回歸分析

以PD 是否發(fā)生（0=否，1=是）為因變量，miR-29（高表達(dá)=1，低表達(dá)=0）、PARK2（低表達(dá)=1，高表達(dá)=0）為自變量。結(jié)果顯示，血清miR-29 高表達(dá)、PARK2低表達(dá)是PD 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（OR>1，P<0.05）。見表4。

表4 PD 影響因素的logistic 回歸分析

2.4 血清miR-29、PARK2 對(duì)PD的診斷價(jià)值

ROC 結(jié)果顯示，血清miR-29、PARK2 聯(lián)合檢測(cè)PD的AUC 高于miR-29、PARK2 單獨(dú)檢測(cè)（Z=8.317，P ＜0.001；Z=6.124，P ＜0.001）。見表5、圖1。

表5 血清miR-29、PARK2 表達(dá)水平對(duì)PD的診斷價(jià)值

3 討論

PD的發(fā)生主要與紋狀體多巴胺含量減少及選擇性中腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元喪失有關(guān)[13-15]。流行病學(xué)研究顯示，近年來發(fā)病人數(shù)越來越多，且逐漸趨于年輕化，不利于患者及其家庭的正常生活[16]。因此，進(jìn)一步尋找能早期評(píng)估PD 發(fā)生的指標(biāo)，對(duì)減少PD 發(fā)生是非常重要的。

人miR-29 主要包括miR-29a、miR-29b、miR-29c三個(gè)成員，各成員之間序列高度同源，主要定位于1 號(hào)和7 號(hào)染色體上[17]。研究顯示，miR-29 與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[18-20]。劉辰庚等[21]研究發(fā)現(xiàn)，PD 患者血漿外泌體內(nèi)miR-29c 表達(dá)水平與健康受試者比較，無顯著性差異。韓凱[22]研究發(fā)現(xiàn)，miR-29b 在PD 患者外周血中表達(dá)水平升高，可作為診斷PD的指標(biāo)。本研究也得出與韓凱[22]研究相似的結(jié)果，提示miR-29 可能在PD 發(fā)病中扮演著重要角色，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí)。

PARK2 是早發(fā)型帕金森綜合征的致病基因，其基因突變與PD 密切相關(guān)[23]。PARK2 基因可通過線粒體的自噬功能清除機(jī)體內(nèi)損傷的線粒體，保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[24]。目前，有關(guān)PARK2 在PD 中的作用機(jī)制尚未明確。陳美紅等[25]通過對(duì)患有PD的兄弟3 人的外周血RNA 及DNA 進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該家族PD 主要是由于PARK2 基因復(fù)合突變所致。肖丹丹等[26]研究發(fā)現(xiàn)，Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬與心血管疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，可作為治療心血管疾病的新靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)低PARK2 可能與PD的發(fā)生有關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，血清miR-29 高表達(dá)、PARK2 低表達(dá)是影響PD 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示監(jiān)測(cè)二者表達(dá)水平對(duì)評(píng)估PD發(fā)生有一定的臨床價(jià)值。此外，本研究通過繪制并觀察ROC 曲線，發(fā)現(xiàn)miR-29、PARK2 均可作為診斷PD的有效血清指標(biāo)，但診斷靈敏度和特異度相對(duì)較低，尚有可提高的空間。因此，本研究將miR-29、PARK2聯(lián)合繪制ROC 曲線，結(jié)果顯示AUC 為0.911，靈敏度為74.6%，特異性高達(dá)93.3%，提示聯(lián)合檢測(cè)可能更有利于PD的診斷。

綜上所述，PD 患者血清miR-29 高表達(dá)，PARK2低表達(dá)，二者均可作為診斷PD的潛在血清指標(biāo)，且聯(lián)合診斷的意義可能更大。但PD的形成受多種因素的影響，因此仍需進(jìn)行深入研究。