膽石癥患者血清膽汁酸譜的檢測(cè)與分析

金素麗 武 艷 汪 冉 楊 利 閆國(guó)超 趙 帥

1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)中心，河北石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北石家莊 050000

膽石癥是臨床上常見的一種疾病，根據(jù)結(jié)石的發(fā)生部位可分為膽囊結(jié)石、膽總管結(jié)石和肝內(nèi)膽管結(jié)石，其中膽囊結(jié)石和膽總管結(jié)石較為常見[1]。我國(guó)膽囊結(jié)石患病率為2.3%～6.5%[2]，個(gè)別地區(qū)的發(fā)病率較高，甚至可達(dá)24.0%[3]，且隨著人口年齡的增長(zhǎng)和人們生活水平的提高，其患病率呈上升趨勢(shì)[4-7]。研究表明，很多因素可以促進(jìn)膽石的形成，如：遺傳因素、環(huán)境、性別、脂質(zhì)代謝異常、膽囊功能、促核因子、生活習(xí)慣、其他疾病影響等[8]，這些危險(xiǎn)因素可以通過影響膽汁代謝導(dǎo)致膽汁成分改變或影響膽囊功能而誘發(fā)膽囊結(jié)石[9-10]。雖然，目前對(duì)膽石癥形成的大致危險(xiǎn)因素已有所認(rèn)識(shí)，但仍缺乏有效的策略以預(yù)防膽石的形成[11]。膽汁酸是膽結(jié)石發(fā)病的重要因子，人體血清中膽汁酸各亞組分的比例、含量的變化，與膽石癥的發(fā)病及轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切，臨床上常用熊脫氧膽酸作為膽結(jié)石的治療藥物[2]。因此，膽汁酸譜的檢測(cè)可能對(duì)膽石癥的診斷及預(yù)防有一定的價(jià)值。以往由于技術(shù)的限制，臨床上主要測(cè)定總膽汁酸的含量，不能定量檢測(cè)血清中各膽汁酸代謝組分的含量。隨著高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)的發(fā)展，膽汁酸代謝譜的檢測(cè)在臨床上的應(yīng)用日漸成熟，利用其高靈敏性、高特異性、高通量的特點(diǎn)檢測(cè)血清中膽汁酸亞組分的含量可為篩選膽石癥轉(zhuǎn)化標(biāo)志物提供一種新思路。本研究通過對(duì)膽石癥患者血清中膽汁酸譜的檢測(cè)，探索其在膽石癥的臨床診斷及早期預(yù)防中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019 年9 月至2020 年6 月在河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）確診為膽囊結(jié)石或膽管結(jié)石的患者59 例作為研究對(duì)象。其中膽囊結(jié)石組48 例，其中男16 例，女32 例；年齡27～75 歲，平均（54.08±12.68）歲；膽管結(jié)石組11 例，其中男2 例，女9 例；年齡32～73 歲，平均（58.36±14.61）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)超聲、CT 或磁共振膽胰管成像診斷確診為膽囊結(jié)石或膽管結(jié)石；②同意血清膽汁酸譜檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有病毒性肝炎、酒精性肝病等肝臟損傷的病史；②有梗阻性腸道疾病。對(duì)照組來自同期我院體檢中心經(jīng)彩超確認(rèn)無膽囊結(jié)石或膽管結(jié)石的健康體檢者，共26 例，其中男10 例，女16 例；年齡32～76 歲，平均（48.35 ±11.33）歲。三組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。該研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審批同意，所有受試者知曉并簽署知情同意書。

1.2 儀器及試劑

Waters ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQD（美國(guó)，Waters 公司）；H1650R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（中國(guó)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；G560E 渦旋混合器（美國(guó)，Scientific Industries 公司）；CV100-DNA-H 真空離心濃縮儀（中國(guó)，北京乾明基因技術(shù)有限公司）；色譜柱為Waters 公司UPLCBEH C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。

HPLC-MS 級(jí)甲醇、甲酸、乙腈購(gòu)自美國(guó)Fisher Scientific 公司；釋放劑及內(nèi)標(biāo)液購(gòu)自杭州佰辰公司，所有實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水。

1.3 樣本的采集及預(yù)處理

樣本采集：膽囊結(jié)石組（術(shù)前）、膽管結(jié)石組（術(shù)前）及對(duì)照組于清晨空腹采集靜脈血5 ml 并以離心力1760 g 離心10 min，提取上清液保存于-80 ℃冰箱待測(cè)。

預(yù)處理：取100 μl 血清樣本，加入300 μl 膽汁酸內(nèi)標(biāo)工作液，旋渦混合5 min，離心力13 813 g，4℃低溫離心5 min，吸取上清液300 μl，低溫濃縮2 h 至近干；用100 μl 的樣本釋放劑B 液復(fù)溶，旋渦混合5 min，離心力13 813 g，4℃低溫離心5 min，取上清液80 μl于96 孔板中，采用LC-MS/MS 對(duì)膽汁酸進(jìn)行分析。

1.4 UPLC-MS/MS 分析

采用線性梯度洗脫模式對(duì)膽汁酸進(jìn)行色譜分離，流速為0.4 ml/min，柱溫為45℃。流動(dòng)相A：10%（體積比）的甲酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈∶甲醇為3∶1 的混合溶劑。梯度分離條件為：0～0.5 min，38%B；0.5～1.9 min，38%B →48%B；1.9～6.7 min，48%B →64%B；6.7～8.7 min，64%B→83%B；8.7～10.7 min，83%B→95%B；10.7～11.3 min，95%B→38%B；11.3～12.0 min，38%B。進(jìn)樣量為5 μl。

質(zhì)譜儀離子化方式：電噴霧離子源，負(fù)離子模式。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)膽汁酸譜進(jìn)行定量檢測(cè)。15 種膽汁酸亞組分分別為：膽酸（choleic acid，CA）、鵝脫氧膽酸（chenodesoxycholic acid，CDCA）、脫氧膽酸（deoxycholic acid，DCA）、石膽酸（lithocholic acid，LCA）、甘氨膽酸（glycocholic acid，GCA）、甘氨熊脫氧膽酸（glycoursodeoxycholic acid，GUDCA）、甘氨鵝脫氧膽酸（glycochenodeoxycholic acid，GCDCA）、甘氨脫氧膽酸（glycodeoxycholic acid，GDCA）、?；悄懰幔╰aurocholic acid，TCA）、牛磺脫氧膽酸（taurodeoxycholicacid，TDCA）、?；切苊撗跄懰幔╰auroursodeoxycholic acid，TUDCA）、?；蛆Z脫氧膽酸（taurochenodeoxycholic acid，TCDCA）、牛磺石膽酸（taurolithocholic acid，TLCA）、甘氨石膽酸（glycocholic acid，GLCA）、熊脫氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，偏態(tài)分布計(jì)量資料的描述以中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，多組間比較采用獨(dú)立樣本的Kruskal Wallis 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

三組TLCA、GLCA 大部分?jǐn)?shù)據(jù)小于檢測(cè)限，故未進(jìn)行比較統(tǒng)計(jì)。三組GCA、GUDCA、GCDCA、TCA、TUDCA、TCDCA 這6 種膽汁酸亞組分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，膽囊結(jié)石組和膽管結(jié)石組中的GCA、GUDCA、TCA、TCDCA 及TUDCA顯著高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），但膽囊結(jié)石組與膽管結(jié)石組GCA、GUDCA、TCA、TCDCA 及TUDCA 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；膽囊結(jié)石組GCDCA 高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），但膽管結(jié)石組與對(duì)照組、膽囊結(jié)石組與膽管結(jié)石組之間GCDCA 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 三組膽汁酸譜比較[nmol/L，M（P25，P75）]

3 討論

膽石癥是臨床上的一種多見病、常發(fā)病。多數(shù)患者并無明顯癥狀，常于健康體檢或其他疾病檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)。但是膽結(jié)石的存在會(huì)對(duì)膽囊或膽管的正常結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響，如占位性的影響膽囊排空功能、結(jié)石嵌頓引起的膽絞痛、結(jié)石反復(fù)摩擦膽囊壁誘發(fā)膽囊炎等[2]。目前膽石癥的診斷和治療已相對(duì)成熟，但術(shù)后易出現(xiàn)諸多遠(yuǎn)期并發(fā)癥[12]。有研究表明，膽囊切除術(shù)后部分患者腸道的細(xì)菌降解功能出現(xiàn)紊亂，直腸癌的發(fā)病率明顯提高[13-17]。除此以外，膽石癥患者術(shù)后結(jié)石的復(fù)發(fā)率較高[18]。多項(xiàng)研究顯示，膽總管結(jié)石患者經(jīng)內(nèi)鏡逆行膽胰管成像術(shù)后的復(fù)發(fā)率為4%～24%[19]，膽囊結(jié)石術(shù)后的復(fù)發(fā)率高達(dá)20%[20-23]。因此，對(duì)膽石癥形成的原因及預(yù)防的研究顯得尤為重要。

膽汁酸是膽固醇的代謝產(chǎn)物，是由24 個(gè)碳原子組成的膽烷酸衍生物，占人體總膽汁含量的50%～70%[24-25]。膽汁酸成分的改變是膽囊結(jié)石形成的主要原因之一[26]。在非疾病狀態(tài)下，血清中膽汁酸各亞型含量及比例基本恒定，其中CA 約占總膽汁酸的40%，CDCA 占40%，DCA 占18%，LCA 不足2%。在疾病狀態(tài)下，受肝細(xì)胞功能和膽汁酸肝腸循環(huán)的影響，血清中膽汁酸各亞型的種類及含量可能發(fā)生改變，膽固醇不能維持微膠粒狀態(tài)，逐漸形成結(jié)晶并析出，最終導(dǎo)致結(jié)石的形成。

本研究中筆者使用LC-MS/MS 法，對(duì)膽囊結(jié)石組、膽管結(jié)石組及對(duì)照組的血清膽汁酸譜進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)三組GCA、GUDCA、GCDCA、TCA、TUDCA、TCDCA這6 種膽汁酸亞組分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，膽囊結(jié)石組和膽管結(jié)石組中的GCA、GUDCA、TCA、TCDCA 及TUDCA 顯著高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），但膽囊結(jié)石組與膽管結(jié)石組GCA、GUDCA、TCA、TCDCA 及TUDCA比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；膽囊結(jié)石組GCDCA 高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），但膽管結(jié)石組與對(duì)照組、膽囊結(jié)石組與膽管結(jié)石組之間GCDCA 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。本研究與相關(guān)報(bào)道[27-28]的結(jié)果基本一致，提示了本研究結(jié)果的可靠性。從以上結(jié)果可以看出，無論是膽囊結(jié)石組還是膽管結(jié)石組，其與對(duì)照組的膽汁酸譜都存在差異。其共同的差異膽汁酸為GCA、GUDCA、TCA、TCDCA 及TUDCA，且波動(dòng)趨勢(shì)一致，均比對(duì)照組增高。即此5 項(xiàng)指標(biāo)與結(jié)石本身的位置無關(guān)，而與體內(nèi)有無結(jié)石有關(guān)。由此可以推斷，GCA、GUDCA、TCA、TCDCA 及TUDCA 這5 種膽汁酸組分可能為膽石癥診斷的標(biāo)志性分子。另有研究表明[27]，膽汁酸各亞組分在膽石癥發(fā)生前，即超聲、CT 等結(jié)果正常時(shí)已有明顯的改變。因此，膽汁酸亞組分的檢測(cè)有望成為預(yù)測(cè)及診斷膽石癥的新型指標(biāo)。

值得注意的是，本研究中，有差異的膽汁酸亞組分均為結(jié)合膽汁酸。這些差異膽汁酸亞組分在血清中與膽汁中是否一致尚未可知。對(duì)于兩者之間相互影響及轉(zhuǎn)化的過程中的影響因素還需要繼續(xù)研究。

綜上所述，本研究通過對(duì)血清中膽汁酸譜的檢測(cè)探討了膽汁酸代謝亞組分與膽石癥的關(guān)系，為膽石癥早期診斷及預(yù)防尋找可能的標(biāo)志物。