畬藥銅絲藤根化學(xué)成分的分離鑒定

張曉芹 袁宙新 倪京麗 王娜妮

1.浙江省麗水市中醫(yī)院藥劑科，浙江麗水 323000；2.浙江省中醫(yī)藥研究院，浙江杭州 310007

銅絲藤根，是畬族習(xí)用藥材，系海金沙科植物海金沙[Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.]的干燥根及根莖[1]，具有清熱解毒、利濕消腫之功效，主治水濕腫滿(mǎn)、風(fēng)濕痹痛[2-3]，是畬族民間治療骨關(guān)節(jié)炎的常用藥物[2-3]。銅絲藤根孢子的乙醇提取物可通過(guò)抑制核因子κB通路發(fā)揮抗炎作用[4-5]，水煎液對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎具有治療作用[6]。銅絲藤根中已報(bào)道化合物主要為黃酮類(lèi)、甾體類(lèi)、酚酸類(lèi)、脂肪酸類(lèi)及揮發(fā)類(lèi)成分[7-8]，但化合物種類(lèi)僅有20 余種，尚需要進(jìn)一步探索。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1100，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；制備液相色譜儀（ZR，江蘇智潤(rùn)科技有限公司）；核磁共振波譜儀（AVANCE-Ⅲ，德國(guó)Bruker 公司）；紅外光譜儀（FTIR-650，天津港東科技有限公司）。

1.2 試藥

甲醇、乙腈（色譜級(jí)和制備級(jí)，上海星可高純?cè)噭┯邢薰荆?。銅絲藤根樣品采自浙江省麗水市，由浙江省麗水市中醫(yī)院林娜主任中藥師鑒定為海金沙科植物海金沙[Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.]的地下根及根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取分離

10 kg 銅絲藤根藥材，80%乙醇回流提取3 次，每次2 h，浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮，得石油醚部位（51.17 g）、乙酸乙酯部位（237.75 g）、正丁醇部位（199.12 g）。乙酸乙酯部位經(jīng)硅膠柱色譜Sephadex LH-20 層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，薄層檢測(cè)，合并濃縮后得到的Fr.1～11 分別經(jīng)制備型高效液相色譜、硅膠柱層析等方法純化得到化合物1～13，見(jiàn)圖1。

圖1 提取分離流程圖

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色粉末。紅外吸收光譜法（infrared absorption spectrum，IR）（KBr，cm-1）：3369、2964、1660、1649、1577、1336、1266、1034、885、727。紫外可見(jiàn)光譜法（ultraviolet-visible spectrometr，UV）：204.2、266.7、346.6 nm。氫-1 核磁共振波譜法（1H nuclear magnetic resonance spectroscopy，1H-NMR）（400 MHz，DMSOd6）δ∶7.77（1H，s）、7.30（1H，s）、6.68（1H，s）；1.12（6H，d，J=6.8 Hz）、3.10（1H，m）、2.24（3H，s）。核磁共振碳譜（13C Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，13C-NMR）（100 MHz，DMSO-d6）：低場(chǎng)區(qū)共有10 個(gè)C 信號(hào)，含2 個(gè)羰基信號(hào)185.1 和183.4。高場(chǎng)區(qū)有3 個(gè)C 信號(hào)。與文獻(xiàn)[9]比較，確定為6-羥基-2-異丙基-7-甲基-1，4-萘醌。

化合物2：白色粉末。IR（KBr，cm-1）：3329、3228、1645、1597、1533、1441、1296、1164、876、812、754、631。UV：205.3（max）、230.1、278.6、311.9 nm。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ∶7.33（1H，dd，J=7.6，2.0 Hz）、7.32（1H，s）、6.92（1H，d，J=7.6 Hz）、9.71（1H，s）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）顯示7 個(gè)C 信號(hào)，與文獻(xiàn)[10]比較，確定為原兒茶醛。

化合物3：無(wú)色油狀物。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ∶1.03（3H，s，H-12）、1.06（3H，s，H-11）、1.26（3H，d，J=6.4 Hz，H-10）、1.93（3H，s，H-13）、2.17（1H，d，J=16.8 Hz，H-2b）、2.49（1H，d，J=16.8 Hz，H-2a）、4.33（1H，m，H-9）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ∶42.4（s，C-1）、50.7（t，C-2）、201.2（s，C-3）、127.1（d，C-4）、136.9（d，C-7）、130.0（d，C-8）、68.6（d，C-9）、23.5（q，C-10）、23.8（q，C-11）、24.5（q，C-12）、19.6（q，C-13）。與文獻(xiàn)[11]比較，確定為吐葉醇。

化合物4：黃色粉末。IR（KBr，cm-1）：3464、1619、1601、1445、1281、1189、1155、1111、1012、966、804、565。UV：221.8、249.0、338.2（max）nm。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ∶2.36（3H，s，4-H）、6.57（1H，d，J=16.0 Hz，1-H）、7.54（1H，d，J=16.0 Hz，2-H）、7.10（1H，d，J=2.0 Hz，2’-H）、6.81（1H，d，J=8.4，2.1 Hz，5’-H）、7.01（1H，dd，J=8.4，2.1 Hz，6’-H）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ∶27.0（C-4）、115.3（C-2’）、116.6（C-5’）、123.5（C-2）、124.7（C-6’）、127.8（C-1’）、6.8（C-1）、146.9（C-3’）、150.0（C-4’）、201.5（C-3）。與文獻(xiàn)[12]比較，確定為（E）-3，4-二羥基苯亞甲基丙酮。

化合物5：白色粉末。IR（KBr，cm-1）：3386、1672、1602、1450、1312、1245、1215、1173、1012、978、831、557、515。UV：204.2、266.7 nm。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ∶7.46（2H，d，J=8.6 Hz）、6.82（2H，d，J=8.6 Hz）、7.61（1H，d，J=16.0 Hz）、6.30（2H，d，J=16.0 Hz）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ∶146.6（C-1）、115.7（C-2）、171.0（C-3）、127.3（C-1’）、116.8（C-2’，6’）、131.1（C-3’，5’）、161.2（C-4’）。與文獻(xiàn)[13]比較，確定為對(duì)羥基肉桂酸。

化合物6：白色粉末。IR（KBr，cm-1）：3367、1684、1589、1381、1302、1248、1207、769、694。UV：212.4、252.5 nm。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ∶：7.96（1H，d，J=2.0 Hz）、7.81（1H，dd，J=8.4，1.6 Hz）、6.96（1H，d，J=8.4 Hz）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ∶1 個(gè)羧基C 信號(hào)168.8；1 個(gè)苯環(huán)連氧（羥基）的C 信號(hào)158.8；3 個(gè)CH，分別為132.9、131.0 和117.1；2 個(gè)季碳信號(hào)為124.0 和121.7。與文獻(xiàn)[14]比較，確定為3-氯-4-羥基-苯甲酸。

化合物7：黃色粉末。IR（KBr，cm-1）：3421、1658、1604、1508、1450、1362、1207、1061、1012、970、833。UV：212.4、252.5 nm。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ∶8.09（2H，d，J=8.8 Hz）、6.91（2H，dd，J=8.8 Hz）；6.43（1H，d，J=2.0 Hz）、6.23（1H，d，J=2.0 Hz）；5.15（1H，d，J=7.2 Hz）、4.59（1H，brs）；1.14（3H，d，J=6.0 Hz）。13CNMR（100 MHz，CD3OD）δ∶179.4（C-4），166.1（C-7），163.0（C-5），161.5（C-4’），159.4（C-2），158.6（C-9），135.5（C-3），132.4（C-2’，6’），122.8（C-1’），116.2（C-3’，5’），105.7（C-10），100.0（C-6），94.9（C-8），glc（C-1～C-6）為104.6、75.8、78.2、72.3、77.2，68.6.rha（C-1～C-6）為102.4、71.5、72.1、73.9、69.7、17.9。與文獻(xiàn)[15]比較，確定為山柰酚-3-O-蕓香糖苷。

化合物8：白色粉末。IR（KBr，cm-1）：3211、1660、1591、1452、1284、1219、1163、839、820、696、602、505。UV：220.6、262.0 nm。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）：7.79（2H，d，J=8.6 Hz）、6.93（2H，d，J=8.6 Hz）、9.78（1H，s）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）共有5 個(gè)C 信號(hào)，與文獻(xiàn)[16]比較，確定為對(duì)羥基苯甲醛。

化合物9：白色粉末。1H-NMR（400 MHz，Pyr-d5）顯示三萜皂苷的特征信號(hào)。13C-NMR（100 MHz，Pyrd5）顯示共有1 組雙鍵C 信號(hào)140.7 ppm 和121.7 ppm；1 個(gè)糖上端基C 信號(hào)102.4 ppm，與78.4、78.3、77.9、75.1、62.4 ppm，共同構(gòu)成葡萄糖的骨架C 信號(hào)。與文獻(xiàn)[17]比較，確定為胡蘿卜苷。

化合物10：黃色粉末。UV 譜顯示：232.4、207.2 nm。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）顯 示：7.51（2H，d，J=7.2 Hz）、6.83（2H，d，J=7.2 Hz）；7.60（1H，d，J=16.0 Hz）、6.63（1H，d，J=16.0 Hz）；2.36（3H，s）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）顯示有1 個(gè)羰基信號(hào)201.5 ppm，1 個(gè)甲基信號(hào)27.1 ppm，苯環(huán)季碳信號(hào)161.6 ppm，一組對(duì)取代苯環(huán)的CH 質(zhì)子信號(hào)131.6 ppm 和116.9 ppm。與化合物4 的核磁圖譜比較，確定為對(duì)羥基亞芐基丙酮。

化合物11：白色粉末。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ ∶6.81（1H，d，J=7.4 Hz）、7.44（1H，s）、7.43（1H，d，J=7.4 Hz）、3.84（3H，s）。3C-NMR（100 MHz，CD3OD）低場(chǎng)區(qū)顯示共有7 個(gè)C 信號(hào)，含有酯羰基C 信號(hào)、苯環(huán)信號(hào)、季碳信號(hào)。與文獻(xiàn)[18]比較，確定為3，4-二羥基苯甲酸甲酯。

化合物12：白色粉末。IR（KBr，cm-1）：3462、3343、1696、1619、1535、1437、1372、1260、1198、1051、1001、768。UV：214.7、272.7 nm。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）：7.06（2H，s）、3.83（3H，s）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）低場(chǎng)區(qū)顯示有5 個(gè)C 信號(hào)，高場(chǎng)區(qū)1 個(gè)甲氧基C 信號(hào)52.3 ppm。確定為沒(méi)食子酸甲酯。

化合物13：黃色粉末。IR（KBr，cm-1）：3284、1667、1608、1550、1454、1412、1350、1251、1147、962、812。UV：219.5、249.0、369.1 nm。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ∶7.29（1H，d，J=16.0 Hz）和6.58（1H，d，J=16.0 Hz）；6.77（1H，d，J=8.0 Hz）、6.94（1H，dd，J=8.0，1.6 Hz）和7.02（1H，d，J=1.6 Hz）；5.56（1H，d，J=1.6 Hz）和6.14（1H，d，J=1.6 Hz）；3.87（3H，s）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）結(jié)合DEPT 顯示：該化合物含有14 個(gè)C 信號(hào)，其中7 個(gè)CH（137.0、121.7、116.4、116.3、114.6、101.1、88.3），1 個(gè)OCH3（56.6）。與文獻(xiàn)[19]比較，確定為4-甲氧基-6-（3’，4’-二羥基苯乙烯基）-2-吡喃。

13 種化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2。

圖2 銅絲藤根化學(xué)成分圖

3 討論

本研究從銅絲藤根中分離得到13 個(gè)化合物，其中酚類(lèi)9 種、醌類(lèi)2 種、黃酮類(lèi)1 種、甾醇類(lèi)1 種?；衔?～8、10～13 為首次從該植物中分離得到，也是首次從海金沙屬中分離得到。

3-氯-4-羥基-苯甲酸（6）是一個(gè)較為少見(jiàn)的鹵素取代化合物[20-21]，其生理活性鮮見(jiàn)報(bào)道。4-甲氧基-6-（3’，4’-二羥基苯乙烯基）-2-吡喃（13）與抗癌活性顯著的hispidin 化合物具有高度的結(jié)構(gòu)相似性[22-25]。原兒茶醛能通過(guò)抑制絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路降低腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-1β 等炎癥因子的水平，發(fā)揮抗骨關(guān)節(jié)作用。（E）-3，4-二羥基苯亞甲基丙酮（4）、對(duì)羥基亞芐基丙酮（10）作為苯亞甲基丙酮類(lèi)化合物可以作為潛在的抗骨質(zhì)疏松類(lèi)藥物。本文建立了銅絲藤根成分的分離工藝，可為以上化合物的后續(xù)研究提供借鑒。